食品分析《維生素的測定》(第8章)課件

第8章：維生素的測定浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院

劉鐵兵

tbliu@126.comChapter8AnalysisofVitamin歡迎各位同學(xué)和朋友！浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院

劉鐵兵

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食品分析概述1）維生素對人體的作用：維生素是維持人體正常生命活動所必需的一類天然有機(jī)化合物。其種類很多，目前已確認(rèn)的有30余種，其中被認(rèn)為對維持人體健康和促進(jìn)發(fā)育至關(guān)重要的有20余種。這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類，有的屬于胺類，有的屬于酯類，還有的屬于酚或醌類化臺物。作為代謝的輔酶?；瘜W(xué)方法：3）維生素分析方法：水溶性維生素：B、C脂溶性維生素：A、D、E、K2）維生素的分類：儀器方法：微生物法：生物鑒定法：1．溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。2．耐酸堿性：維生素A、D對酸不穩(wěn)定，對堿穩(wěn)定，維生素E對堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。脂溶性維生素的測定脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)：VA、VD、VE、與類脂物一起存于食物中，攝食時可吸收，可在體內(nèi)積貯。耐熱性氧化性VA好，能經(jīng)受煮沸易被氧化（光、熱促進(jìn)其氧化）VD好，能經(jīng)受煮沸不易被氧化VE好，能經(jīng)受煮沸在空氣中能慢慢被氧化（光、熱、堿促進(jìn)其氧化）耐熱性、耐氧化性：

皂化樣品水洗去除類脂物有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素(不皂化物)濃縮溶于適當(dāng)?shù)娜軇y定。在皂化和濃縮時，為防止維生素的氧化分解，常加入抗氧化劑(如焦性沒食子酸、維生素C等)。對于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。國際單位：IU（InternationalUnit)

1IU=0.3μgVA=0.025VD=1.79μgβ-胡蘿卜素=1.1mgα-VE=3μgVB根據(jù)上述性質(zhì)．測定脂溶性維生素時，通常：三氯化銻比色法測定VA基本原理：在氯仿溶液中VA能與三氯化銻生成藍(lán)色可溶性絡(luò)合物，在620nm有最大光吸收，其光吸收強(qiáng)度與VA濃度成正比。適用范圍與特點(diǎn)：適用于高VA含量的食品；對低VA含量的食品因其它脂溶性成分的存在而受干擾；本法生成的藍(lán)色絡(luò)合物不穩(wěn)定，比色必須在6秒內(nèi)完成。試劑：無水乙醚：不含過氧化氫，檢測方法：5ml乙醚加1ml10%碘化鉀振1分鐘，或再加4滴0.5%淀粉，水呈藍(lán)色；去除方法：重蒸餾時，瓶內(nèi)加入少許鐵絲。

（GB/T5009.82—2003中第二法）注意事項(xiàng)：

★樣品中的β-胡蘿卜素會干擾測定，可將干樣品用正已烷溶解，以氧化鋁為吸附劑，丙酮-已烷混合液為洗脫劑進(jìn)行層析分離；

★三氯化銻腐蝕性極強(qiáng)；

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VA含量高的樣品可直接加無水硫酸鈉研磨后，加乙醚提取，加三氯甲烷溶解后即為待測的處理樣品；

★顯色劑除用三氯化銻外，還可用三氟乙酸、三氯乙酸。胡蘿卜素的測定

VA的前體物質(zhì)：類胡蘿卜素；α、β、γ胡蘿卜素，其中以β-胡蘿卜素的效價最高，每毫克β-胡蘿卜素相當(dāng)于560國際單位VA。胡蘿卜素只存在于植物性食物中；胡蘿卜素對熱、酸、堿比較穩(wěn)定，但對紫外線和氧卻不穩(wěn)定，可將其破壞。胡蘿卜素在450nm有最大吸收；但由于其常與葉綠素、葉黃素等色素共存，故要測定必須要分離出胡蘿卜素?；驹恚阂员?、石油醚提取出胡蘿卜素，以石油醚為展開劑進(jìn)行紙層析，由于胡蘿卜素的極性最小，移動速度最快，從而與其它色素分開，取下此區(qū)帶，洗脫后于450nm比色測定。

通常用層析法分離測定胡蘿卜素：β—胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)如下：胡蘿卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡蘿卜為食物的家禽、獸類、水產(chǎn)動物及其加工產(chǎn)品，以及為著色而添加胡蘿卜素的食品，當(dāng)然也含有胡蘿卜素。樣品的提取與洗滌：注意植物油和高脂肪樣品先要皂化；樣品的濃縮與定容：在有氮?dú)猸h(huán)境中濃縮，但不要濃縮得太干；紙層析：點(diǎn)樣：在基線（距低端4CM處）上取四點(diǎn)，分別在二點(diǎn)間帶狀點(diǎn)樣；展開：以飽和過的石油醚為展開劑，進(jìn)行上行展開；洗脫：剪下胡蘿卜素色帶，置于5ml具塞試管中，用力振搖，使色素完全溶解；比色測定：以石油醚為空白，于450nm處比色測定；標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：測定方法：

★此法為國標(biāo)方法，方法簡單、最小檢出限為0.11ug；

★濃縮時要防止蒸干，同時要在充氮條件下進(jìn)行；

★層析分離也可用柱層析，效果好，但費(fèi)時；

★一般用專用的中速濾紙；（GB/T5009.83—2003）第一方法是HPLC；第二方法為紙層析法。說明與討論：維生素D的測定概述：成人缺乏VD會患軟骨病，兒童缺乏VD會患佝僂??；VD有多種，其中最重要的是VD2和VD3及其維生素D原，VD3只存在于某些動物性食物中。維生素D2無天然存在，維生素D2只存在于某些動物性食物中。但它們都可由維生素D原(麥角固醇和7一脫氫膽固醇)經(jīng)紫外線照射形成。

1IU=0.025ugVD3VD測定方法有：比色法、紫外分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層層析；比色法和HPLC法為AOAC推薦的VD測定方法。三氯化銻比色法測定VD

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VD常與VA、VE、膽固醇等在一起，且量要大大超過VD，嚴(yán)重干擾其測定，因此要經(jīng)柱層析去除這些干擾成分；

★操作時加入乙酰氯可消除溫度的影響；

★此法不能區(qū)分VD2和VD3，測定的是二者的總和；說明與討論：維生素E的測定概述：VE有八種，又稱生育酚，屬于酚類化合物；其中以α-生育酚的生理活性最高，分布也最廣；動植物中均有分布，其中又以植物油料中為最多。主要測定方法有：比色法、熒光法、氣相色譜法、高效液相色譜法；比色法操作簡單，靈敏度較高，但由于VE無特異性反應(yīng)，要采取一些方法消除干擾；熒光法特異性強(qiáng)、干擾少、靈敏、快速、簡單；目前測定VE最好的方法為HPLC法。

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VE在堿性條件下易被氧化，因此需在N2氣流中皂化，并可加入焦性沒食子酸作為抗氧化劑；

★處理前應(yīng)將其它可使三價鐵還原為二價鐵的還原性物質(zhì)去除；

★發(fā)色劑除用聯(lián)氮苯外，也可用4，7-二苯基-1，10-菲繞啉；

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VE的各種異構(gòu)體與試劑的反應(yīng)速度、呈色強(qiáng)度各不相同；

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VE見光易氧化，因此操作要避光。說明與討論：水溶性維生素B1、B2和C，廣泛存在于動植物組織中，飲食來源充足。但是由于它們本身的水溶性質(zhì)，除滿足人體生理、生化作用外，任何多余量都會從小便中排出。為避免耗盡，需要經(jīng)常地由飲食來提供。水溶性維生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑。在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，既使加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在堿性條件下加熱，可破壞大部分或全部。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響；維生素B2對光，特別是紫外線敏感，易被光線破壞；維生素C對氧、銅離子敏感，易被氧化。水溶性維生素的測定維生素B1的測定概述：VB1又名硫胺素，可與鹽酸生成鹽酸鹽；通常以游離態(tài)，自然界常與焦磷酸結(jié)合成焦磷酸硫胺素（TPP）。在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色蔬菜和牛乳、蛋黃中含量較為豐富。VB1在機(jī)體代謝中具有重要作用，缺乏會引起腳氣病、神經(jīng)炎等。人體維生素B1的需要量為每天1～2mg。主要測定方法有：分光光度法、熒光法、高效液相色譜法；GB/T5009.84—2003中唯一的方法是熒光計法。熒光法測定維生素B1基本原理：VB1在堿性高鐵氰化鉀溶液中，能被氧化成一種藍(lán)色的熒光化合物——硫色素，在沒有其它熒光物質(zhì)存在時，溶液的熒光強(qiáng)度與硫色素的濃度成正比。所含雜質(zhì)需要用柱色譜法處理，測定提純?nèi)芤褐蠽B1的含量。操作步驟：（1）樣品處理：（2）提純：（3）氧化：（4）標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)空白制備：（5）測定：（1）凡士林有熒光，因此活塞上不能涂，可用甘油-淀粉代替；（2）一般樣品中VB1有游離也有結(jié)合型，故需要用酸和酶水解；（3）谷物類不需要酶分解，樣品經(jīng)粉碎后用酸性氯化鉀直接提取，氧化測定；（4）一般每克人造沸石能吸附30ugVB1，硫胺素量過大，回收率下降；（5）鐵氰化鉀的用量要適當(dāng)，過多會破壞硫胺素，過少則硫胺素氧化不完全；（6）樣液和標(biāo)準(zhǔn)液通過交換管的流速要一致，流速過快會因交換不徹底或吸附不完全而影響測定結(jié)果。說明：維生素C的測定概述：VC又名抗壞血酸，廣泛分布于新鮮果蔬及綠色植物中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑桔等食品中含量尤豐富。VC在生物機(jī)體中起重要功能。固體VC比較穩(wěn)定，但其水溶液極易氧化，氧化速度隨溫度升高pH增加而加快．維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。VC在食品工業(yè)中常作抗氧化劑。

VC測定方法主要有2,6-二氯靛酚滴定法、2,4-二硝基苯肼比色法、熒光法、極譜法、HPLC法等。（1）2,6-二氯靛酚滴定法測定維生素C原理：中性和弱酸性條件下，Vc能將2,6-二氯酚靛酚還原成無色的還原型2,6-二氯酚靛酚，同時Vc被氧化成脫氫Vc，因此可用2,6-二氯酚靛酚測樣品中的Vc含量。Vc全部被氧化后，稍多加一點(diǎn)染料，使溶液呈淡粉紅色，即為終點(diǎn)。如無其它干擾，則消耗的染料與樣品中Vc含量成正比。

Vc的提取：4g樣品（加5ml2%草酸，研磨成勻漿）→轉(zhuǎn)入50ml容量瓶（殘渣用2%草酸提取2—3次）→并入50ml容量瓶（加2%草酸35ml）→用1%草酸定容到刻度→過濾或離心→濾液（清液）備用?？瞻椎味ǎ喝?0ml空白液（加35ml2%草酸，用1%草酸定容到50ml）用2,6-二氯酚靛酚滴定。標(biāo)準(zhǔn)液滴定，取標(biāo)準(zhǔn)Vc液20ml2—3份，置三角瓶中，用2.6-二氯酚靛酚滴定。樣液滴定，取樣液20ml各2份，置于三角瓶中，進(jìn)行滴定。

操作：（2）2,4-二硝基苯肼法測定維生素C總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸。樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4-二硝基苯肼作用生成紅色脎，脎的含量與總抗壞血酸含量成正比，進(jìn)行比色測定。本方法適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定。

（1）樣品處理：（2）氧化處理：（3）呈色反應(yīng)：（4）比色測定：主要操作：原理：（1）大多數(shù)植物組織內(nèi)含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶，因此，抗壞血酸的測定應(yīng)采用新鮮樣品并盡快用2%草酸溶液制成勻漿以保存維生素C。

（2）若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解熱會使溶液變黑。

（3）試管自冰水中取出后，顏色會繼續(xù)變深，所以，加入硫酸后30分鐘應(yīng)準(zhǔn)時比色。

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