酶工程-04酶的分離純化課件

第四章酶的分離純化酶的分離純化是酶工程的主要內(nèi)容之一，是酶的生產(chǎn)和應(yīng)用以及酶學(xué)研究過程中必不可少的重要環(huán)節(jié)之一。酶的提取和分離純化是指將酶從細(xì)胞或培養(yǎng)基中取出，在與雜質(zhì)分開而獲得與使用目的相適應(yīng)的有一定純度的酶產(chǎn)品的過程。酶的使用目的不同，要求純度也不同工業(yè)上：較粗應(yīng)用上：生化試劑，分析工具，醫(yī)藥用酶，鑒定酶，酶理化性質(zhì)鑒定等用純酶純化過程中注意的問題1.注意防止酶的變性失活一般要在低溫下進(jìn)行，要求特定的pH(pH4－10之間較穩(wěn)定），不能有泡沫形成，消除重金屬的作用和微生物污染等2.可使用各種手段，但一定要達(dá)到目的3.要有鑒定酶的適當(dāng)方法。第一節(jié)酶活性測定酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。表示方法：反應(yīng)速度酶活力單位mol催化活性或分子活性率、轉(zhuǎn)換

mol催化活性(分子催化活性）：表示在單位時(shí)間內(nèi)，每個酶分子中每個活性中心轉(zhuǎn)化的分子數(shù)目。根據(jù)Vm=k0[E]k0=Vm/[E]K0：轉(zhuǎn)換率（有時(shí)也用kcat表示）表示的是每個酶分子的催化效率。三比活力四酶活力測定方法酶活力受許多因素影響，酶活力測定通常有兩種方法即終止反應(yīng)法和連續(xù)反應(yīng)法。（一）終止反應(yīng)法此法指酶在一定條件下，反應(yīng)一定時(shí)間后立即終止反應(yīng)，然后用適當(dāng)?shù)姆椒ù_定反應(yīng)物的消耗量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算出酶活性，產(chǎn)物的測定方法可用酶法、化學(xué)法或放射化學(xué)法。酶法；用其他純酶將產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€可用分光光度法測定的化合物。例子見P64化學(xué)法：利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€可用某種物理方法或化學(xué)方法測出的化合物，再算出酶活性。放射性化學(xué)法：用產(chǎn)物或底物具有放射性的性質(zhì)，通過測定放射量的大小，算出酶活性。（二）連續(xù)反應(yīng)法指在反應(yīng)過程中用光學(xué)儀器連續(xù)檢測反應(yīng)進(jìn)行情況，分為非偶聯(lián)的和偶聯(lián)的連續(xù)反應(yīng)法酶反應(yīng)測定方法LDH乳酸＋NAD---丙酮酸＋NADH+H340nmNADH增加LDH丙酮酸＋NADH+H---乳酸＋NAD340nmNADH減少偶聯(lián)的連續(xù)反應(yīng)法是加入指示酶。1，6二磷酸果糖3磷酸甘油醛磷酸二羥丙酮醛縮酶1磷酸甘油磷酸甘油脫氫酶NADH+H+NAD+磷酸丙糖異構(gòu)酶偶聯(lián)酶指示酶五酶活力測定中應(yīng)注意的幾個問題1.必須測定初速度如何知道測定的速度是不是初速度，一般認(rèn)為底物消耗量在5％以內(nèi)，或產(chǎn)物形成量占總產(chǎn)物量的15％以下的速度，在此條件下的都認(rèn)為是初速度。2.底物和輔因子濃度都是過飽和的。3.必須在酶的最適條件下進(jìn)行。4.底物本身不能有裂解。5.測定酶活性所用的試劑中不能有酶的激活劑或抑制劑。第二節(jié)酶溶液的制備酶的種類繁多，存在于不同的生物體的不同部位，除了動植物體液酶和微生物胞外酶外，大多數(shù)酶都存在于細(xì)胞內(nèi)，所以酶液制備的第一步就是材料預(yù)處理和破碎細(xì)胞。一、材料預(yù)處理和破碎細(xì)胞酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的分布形式有三種；胞外酶，溶酶和結(jié)酶，后二者合稱胞內(nèi)酶，對于不同生物體不同酶形式，所采用的預(yù)處理方法也不同，細(xì)胞破碎的方法很多，歸納起來可分為物理破碎法、化學(xué)破碎法和酶法。（二）化學(xué)法1.滲透作用2.干燥處理3.有機(jī)溶劑處理4.表面活性劑處理5.酶法（1）自溶法（2）外加酶處理法6.其他：如噬菌體感染法等（一）pH：.穩(wěn)定性、抽提效果、純度（二）鹽；.鹽溶現(xiàn)象、鹽析現(xiàn)象，一般采用稀鹽溶液，濃度在0.02－0.05mol/L（三）溫度；考慮穩(wěn)定性，通?？刂圃?－4℃左右，一般不宜超過10℃（四）抽提液用量：用量大提取率高，但酶濃度下降，不利于進(jìn)一步純化，一般為含酶原料體積的1－5倍，可一次提取，也可分幾次提取。（五）添加保護(hù)劑。三酶溶液的凈化和脫色凈化：指通過離心或過濾等方法除去抽提液中的固型物質(zhì)的過程。絮凝劑的分類和應(yīng)用分類：無機(jī)的、有機(jī)的和天然高分子。應(yīng)用：除去細(xì)胞碎片等酶的脫色：除去色素（活性碳、離子交換樹脂）四濃縮酶蛋白由低濃度到高濃度的過程方法；鹽析法，超濾，離子交換樹脂法，真空濃縮，冷凍干燥等（一）冷凍干燥（二）蒸發(fā)法（三）超濾法（四）凝膠過濾（五）其他第三節(jié)酶分離純化的基本過程一、酶分離純化方法的選擇菌體內(nèi)含有核酸，當(dāng)菌體破裂后釋放核酸，這樣使菌體抽提液粘度增加，影響菌體殘?jiān)c酶液的分離，干擾酶蛋白的純化，有必要除去。除去核酸可以用核酸酶將其降解成核苷酸，使粘度下降，便于離心分離。也可用沉淀劑使核酸中帶負(fù)電荷的磷酸基與沉淀劑中帶正電荷的基團(tuán)反應(yīng)生成沉淀，然后離心除去。另外還有用活性碳吸附除去核酸和核苷酸的，但是在大量核酸存在時(shí)，用活性碳是不行的。酶的分離純化方法是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立起來的。1.根據(jù)分子量設(shè)計(jì)的方法：離心法、凝膠過濾法。2.根據(jù)溶解度大?。蝴}析法，有機(jī)溶劑沉淀法，選擇性沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法。3.根據(jù)電荷的多少和性質(zhì)：離子交換法，電泳法等。4.根據(jù)穩(wěn)定性差異；選擇性熱變性，選擇性酸堿變性法。5.根據(jù)親和（互補(bǔ)）作用：親和層析。二酶分離純化中的一些數(shù)據(jù)處理酶的分離純化過程中每一步都要做三件事1.測定酶活力2.測定蛋白質(zhì)含量3.測量體積將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理（P72表4－5）總活力＝體積×活力體積以毫升為單位活力：Iu/ml比活力＝純度＝(活力/ml)/{蛋白（mg)/ml}回收率（產(chǎn)量）＝（某步總活力/第一次抽提液的總活力）×100％純化倍數(shù)＝某步純化液比活力/第一次抽提液比活力過飽和時(shí)，溶液趨向一個平衡態(tài)，這時(shí)溶質(zhì)在液相和固相之間分配，此時(shí)分子間的相互吸引作用大于相互分散或排斥作用，開始形成無定型的沉淀或結(jié)晶，對于溶液中的生物大分子來說，分子是處在含水的環(huán)境中，由于溶液的過飽和，維持水合物（完全隔離分子間的直接接觸）所需的水是不足的，此時(shí)分子直接接觸的機(jī)會增加，有可能形成無定型沉淀或結(jié)晶。如果溶液達(dá)到過飽和的過程太快，分子很快的聚集，往往出現(xiàn)無定型沉淀，這是應(yīng)該避免的。如果溶液非常緩慢的達(dá)到過飽和點(diǎn)，分子就會有充分的可能排列到晶格中形成結(jié)晶。所以獲得大分子結(jié)晶的基本方法有兩方面，一是使體系非常緩慢地趨于最小溶解度狀態(tài)，二是調(diào)整溶液性質(zhì)和環(huán)境條件，使盡可能多的分子相互接近排列到晶格中。（二）結(jié)晶條件1.酶的純度2.酶蛋白濃度3.晶種4.溫度5.pH6.金屬離子7.其他X-rayDiffractionX-raybeamProteincrystalX-raydetectorX-rayDiffractionGetaseriesofreflections.Informationabouttheposition,andintensityofeachdottellsyouinformationabouttheproteininthecrystalUsethisinfowithsomefancymathematicstoconstructanelectrondensitymapElectronDensityMapsRememberthatitistheregionsofelectrondensitythatdiffracttheX-rays.Constructa“picture”oftheelectrondensityintheproteincrystal.Ithelpstoknowthesequenceoftheprotein１、單晶的概念及識別（晶體結(jié)構(gòu)特征、幾何外型特征、光學(xué)性質(zhì)特征２、單晶分析樣品的要求、選擇和安裝上機(jī)的樣品盡可能選擇呈球形（粒狀）的單晶體或晶體碎片，直徑大小在0.1-0.7mm，無解理、無裂紋確保用于單晶衍射的樣品代表要鑒定的物相，從晶體的形狀、顏色、解理和其他的分析方法給予保證。單晶樣品制備四酶的制劑與保存（一）液體酶制劑（二）固體酶制劑（三）純酶制劑（四）固定化酶制劑（五）保存1.影響酶穩(wěn)定的因素（1）溫度（2）pH（3）酶蛋白濃度（4）氧氣2.提高穩(wěn)定性加入穩(wěn)定劑（1）底物、抑制劑和輔酶（2）對于巰基酶：加入巰基保護(hù)劑如二巰基乙醇、GSH、DTT(3)金屬離子及表面活性劑，高分子化合物、有機(jī)溶劑等第四節(jié)根據(jù)分子大小輕重建立的分離純化方法根據(jù)此法建立的方法有：離心、凝膠過濾、透析和超濾等一、透析和超濾1.透析（dialysis):是利用蛋白不能透過半透膜而小分子的物質(zhì)如無機(jī)鹽，單糖等可以透過半透膜將蛋白質(zhì)與小分子雜質(zhì)分開的技術(shù)。過程：2.超濾上世紀(jì)70年代以后，在實(shí)驗(yàn)室精制酶的過程中人們開始廣泛采用超濾技術(shù)，進(jìn)行大溶質(zhì)分子的濃縮、分級分離、純化等。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、快速溫和，操作中不產(chǎn)生相的變化，離子狀態(tài)的變化以及溫度變化。此法主要是利用壓力或離心力迫使溶質(zhì)按分子量、性狀大小的差異，所需溶質(zhì)分子留在膜的一側(cè)，小分子物質(zhì)隨溶劑透過膜被壓到另一側(cè)，使大小溶質(zhì)分子得到分開。其主要特征是利用有選擇透過的微孔膜，在液壓作用下，分離大溶質(zhì)分子。超濾是加壓膜過濾方法的一種，和其他加壓膜濾方法是有區(qū)別的，影響超濾的因素很多：如膜的滲透性、溶質(zhì)形狀、大小及擴(kuò)散性、壓力、溶質(zhì)濃度、流體剪切力、離子環(huán)境、溫度等。超濾上應(yīng)用比較理想的膜是一種孔徑成坡度的多微孔膜，膜表層的孔徑最小，向基層逐漸擴(kuò)大，呈錐體狀，能防止堵塞、耐熱、及抗化學(xué)降解，理想的膜還能抗生垢，是一種帶磺酸基的聚合物（磺化聚合物）制成的，膜本身帶負(fù)電荷，甚至在高濃度H＋下仍能保持帶負(fù)電荷。大多數(shù)的商品超濾膜在制備方面的資料不公開發(fā)表，僅有um膜報(bào)道是由含多價(jià)電解質(zhì)聚合物制成的。實(shí)驗(yàn)室常用的超濾系統(tǒng)和裝置有：1.封閉系統(tǒng)又分為有室式攪拌型和特殊的五攪拌型裝置P77圖4－92.循環(huán)系統(tǒng)此系統(tǒng)有淺道型超濾裝置，可使液體在淺道中奔流，產(chǎn)生帶有高剪切力和穩(wěn)定的流層，此裝置比室式攪拌型裝置的流速高好幾倍，濃縮大溶質(zhì)的濃度高達(dá)40％3.中空纖維系統(tǒng)特點(diǎn)：運(yùn)用成束（千根以上）堅(jiān)實(shí)的中空纖維，每根纖維內(nèi)腔直徑0.2mm，由惰性的非離子聚合物制成，流率高，抗堵塞，當(dāng)軸流通過管腔，在膜表面上形成高剪切力，因此截留溶質(zhì)分子的同時(shí)將濃度極化降低到最低限度，由于使用成束的纖維（裝于套筒內(nèi)，兩端封閉），所以表面積與體積的比率極大，可提供高到的超濾流量，二離心分離離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力是，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)。在酶的提取和分離純化過程中，細(xì)胞的收集，細(xì)胞碎片和沉淀的分離及酶的純化往往要使用離心機(jī)。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小，密度和特性的不同選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)，離心方法和離心條件。1.離心機(jī)的種類和用途通常按轉(zhuǎn)速的不同分為（1）常速離心機(jī)（低速離心機(jī)）最大轉(zhuǎn)速小于8000r/min，相對離心力（R.C.F)小于1×104g應(yīng)用廣泛，主要用于細(xì)胞分離，細(xì)胞碎片及培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦臀锖痛纸Y(jié)晶等大顆粒的分離。（2）高速離心機(jī)轉(zhuǎn)速1×104－2.5×104r/minR.C.F:1*104-105主要用于分離各種沉淀物，細(xì)胞碎片及較大的細(xì)胞器，為防止離心中溫度升高對酶等生物大分子的影響有的安裝了冷凍裝置，即高速冷凍離心機(jī)（3）超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速2.5×104－8.0×104r/minR.C.F>＝5×105g此機(jī)精密度高，為了防止樣品濺出，有離心管帽，有冷凍裝置和溫度控制系統(tǒng)，為減少空氣阻力和摩擦，有真空系統(tǒng)，此外還有一系列安全保護(hù)系統(tǒng)，制動系統(tǒng)和指示儀表等。按離心機(jī)的用途又分為制備、分析、及分析制備兩用超速離心機(jī)三種。分析型：樣品純度檢測，沉降系數(shù)，分子量測定，它裝有光學(xué)檢測系統(tǒng)、自動記錄儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。純度檢測：根據(jù)吸收峰及折光率改變與否。沉降系數(shù)檢測：S是指在單位離心力的作用下，粒子的沉降速度，以Svedberg表示，簡稱為S，其量值為s,1S=1*10-13sS的獲得可通過超速離心，測出轉(zhuǎn)速，離心時(shí)間和粒子移動距離，按下式求出S=(lnX2-lnX1)/W2(t2-t1)w:角速度t2-t1：離心時(shí)間X2、X1分別是對應(yīng)t2、t1時(shí)運(yùn)動粒子到離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心的距離（cm)S與分子量的關(guān)系有下式M=RTS/[D(1-vp)]M:分子量R：氣體常數(shù)S：沉降系數(shù)T：絕對溫度D：擴(kuò)散系數(shù)v：粒子偏比容（粒子密度的倒數(shù)）p：溶劑密度（g/cm2)2.離心方法的選擇離心方法的選擇主要區(qū)別于粒子大小及密度，如果兩者差異較大，只要選擇好速度和時(shí)間即可，如果樣品中存在兩種以上大小、密度不同的顆粒，則采用差速離心。在超速離心中可分為差速離心，密度梯度離心和等密度離心。（1）差速離心定義：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。先選擇好離心力和時(shí)間，使大顆粒先沉降，取出上清液，加大離心力在進(jìn)行離心，分離較小的顆粒，如此多次離心使不同沉降速度的顆粒分批分離。此法所得的沉降物是不均一的，含有較多雜質(zhì)，需經(jīng)過重新懸浮和再離心若干次，才能獲得較好分離效果。應(yīng)用：主要用于分離那些大小和密度差異較大的顆粒。操作簡單方便，但分離效果差。（2）密度梯度離心定義：樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行分離，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。為此必須配制好密度梯度系統(tǒng)，梯度介質(zhì)應(yīng)有足夠大的溶解度，以形成所需密度，且不與分離組分反應(yīng)，不會引起分離組分的凝集、變性或失活。常用的有蔗糖，甘油等，蔗糖濃度范圍是5－60％，密度1.02－1.30g/cm2密度梯度常采用線性的，配制方法是用梯度混合器。離心前，把樣品加到梯度液表面，離心后，不同大小、性狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。（3）等密度離心定義：當(dāng)要分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍之內(nèi)時(shí)，在離心力作用下，不同浮力密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降或向上漂浮，一直移動到與其各自浮力密度恰好相等的位置（等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶的方法，又叫平衡等密度離心。在密度梯度離心中，要分離的顆粒并沒有達(dá)到其等密度位置，而等密度梯度離心則要求要分離的顆粒處于密度梯度中的等密度點(diǎn)上，為此，（3）所采用的離心介質(zhì)及其密度梯度范圍與（2）有所不同。等密度離心常用的介質(zhì)是銫鹽CsCl、CsSO4、CsBr3.離心條件的確定離心效果的好壞與許多因素有關(guān)，除了離心機(jī)種、方法、介質(zhì)和梯度外，主要的是確定離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，此外還要注意介質(zhì)pH和溫度（1）離心力離心分離是借助于離心機(jī)產(chǎn)生的離心力，使不同大小密度的顆粒分離的現(xiàn)象。物質(zhì)顆粒在離心場中所受到的離心力大小，決定于其質(zhì)量和離心加速度Fc=macac取決于轉(zhuǎn)子的速度和顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑ac=w2rw轉(zhuǎn)子角速度（r/s)r：旋轉(zhuǎn)半徑，即顆粒到旋轉(zhuǎn)軸中心的距離（cm)W=2?n/60ac=4?2n2r/3600其中n:轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（r/min)在說明離心條件時(shí)，低速離心常以轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)表示，如4000r/min，高速離心時(shí)，特別是超速離心時(shí)，常用相對離心力(R.C.F)表示，如6500×gR.C.F是指顆粒所受到的離心力與地心引力（重力）之比，即：R.C.F＝Fc/Fg=mac/mg=4?2n2r/(3600*980.6)(g)簡化后R.C.F＝1.12×10－5×n2×r（g)式中g(shù)：重力加速度（980.6cm/s2)由此可見，F(xiàn)c的大小與n2，r均成正比，在n一定時(shí)，r越大，則Fc越大。在離心過程中隨著顆粒在離心管中移動，其所受的離心力也隨著變化，實(shí)際工作中，F(xiàn)c的數(shù)據(jù)是指其平均值即離心溶液中點(diǎn)處顆粒所受到的Fc（2）離心時(shí)間離心時(shí)間的概念依據(jù)離心方法的不同有所差別，對于差速離心：指某種顆粒完全沉降到管底的時(shí)間對于密度梯度：指形成界面分明的區(qū)帶的時(shí)間對于等密度離心：指顆粒完全到達(dá)等密度點(diǎn)的平衡時(shí)間對于后兩種的時(shí)間，影響因素復(fù)雜，可通過試驗(yàn)后確定。對于差速離心所需的沉降時(shí)間又叫澄清時(shí)間，它決定于顆粒沉降速度和沉降距離，對于已知沉降系數(shù)的顆粒，其沉降時(shí)間可由下式求得T=(1/s)(lnr2-lnr1)/w2t:沉降時(shí)間（s)s:沉降系數(shù)w：轉(zhuǎn)子角速度r1r2轉(zhuǎn)軸中心到樣品液面和管底距離（cm)令K＝(lnr2-lnr1)/w2則K=stK定義為轉(zhuǎn)子的效率因子，它與r,w有關(guān)，生產(chǎn)廠家已在轉(zhuǎn)子出廠時(shí)標(biāo)出了最大轉(zhuǎn)速時(shí)的K值。對于具有某一沉降系數(shù)的顆粒來說，K越低，則沉降時(shí)間越短，轉(zhuǎn)子使用效率就越高。在S，r1，r2確定后w2t是一個常數(shù)，即在離心機(jī)和轉(zhuǎn)子選定后r1，r2不變，對于某種物質(zhì)顆粒（S確定）的沉降起作用的是w及t，操作時(shí)可采用低w，長t或高w，短t而得到相同的w2t。舉例用10000r/min離心10min,記得w2t=(2?n/60)2t=6.5785*108(s-1)若用5000r/min轉(zhuǎn)速離心40min,w2t=6.5766*108(s-1)二者相等對于未知S的球形顆粒計(jì)算，t按下式t=4.5*u/[w2d2(P-P0)]*ln(r2/r1)t：沉降系數(shù)u介質(zhì)粘度p,p0顆粒和介質(zhì)溶液密度d顆粒平均直徑pH和溫度離心溫度一般控制在4C左右離心介質(zhì)的pH一般控制在酶的穩(wěn)定pH，一般采用緩沖液，另外過酸、過堿還可能引起轉(zhuǎn)子和離心機(jī)其他部件的腐蝕，應(yīng)盡量避免。三凝膠過濾葡聚糖凝膠、聚丙烯酰氨凝膠、瓊脂糖凝膠第五節(jié)調(diào)節(jié)溶解度的分離方法

這種分離方法又叫沉淀分離法，是通過改變某些條件，使溶液中某種溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達(dá)到與其他溶質(zhì)分離的目的，是酶分離純化過程中常用的方法。主要包括鹽析沉淀、等電點(diǎn)沉淀，有機(jī)溶劑沉淀、復(fù)合沉淀和選擇性變性沉淀等。是蛋白質(zhì)和酶分離純化中應(yīng)用最早、而且至今仍在廣泛使用的方法。蛋白質(zhì)和酶在溶液中的溶解度受溶液中鹽濃度的影響很大，一般在低鹽濃度下，它們的溶解度隨鹽濃度升高而增加，稱為鹽溶，當(dāng)達(dá)到一定濃度后蛋白質(zhì)和酶溶解度又隨鹽濃度升高而降低，使蛋白質(zhì)和酶沉淀析出稱為鹽析。在某一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)和酶的溶解度各不相同，可達(dá)到彼此分離的目的。鹽之所以會改變蛋白質(zhì)和酶的溶解度，是由于鹽在溶液中會解離為正、負(fù)離子，由于離子作用，改變了蛋白質(zhì)和酶分子表面的電荷，同時(shí)也改變了水的活度，使分子表面的水化膜改變，所以大分子的溶解度與溶液中的離子強(qiáng)度密切相關(guān)，其關(guān)系式為：一、鹽析法（鹽析沉淀法）logS/S0=-KsIS：蛋白質(zhì)或酶在離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度（g/L）S0：離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度（g/L）Ks：鹽析常數(shù)I：離子強(qiáng)度在溫度和pH一定的條件下，S0為一個常數(shù)logS=logS0-KsI令logS0=β則logS=β-KsIΒ主要決定于蛋白質(zhì)或酶的性質(zhì)，Ks大小與離子價(jià)數(shù)成正比，與離子半徑和溶液的介電常數(shù)成反比，也與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。對于某種蛋白質(zhì)而言，在溫度和酸堿度等鹽析條件確定后（即β確定后），以及所用的鹽即Ks確定后，蛋白質(zhì)的溶解度只決定于I，I指溶液中離子強(qiáng)弱的程度，與離子濃度及價(jià)數(shù)有關(guān)I=1/2∑mizi2mi離子濃度Zi離子價(jià)數(shù)對于含有多種蛋白質(zhì)或酶的混合液，可采用分段鹽析分離純化。在一定的溫度和酸堿度等條件下（β為常數(shù)），可通過改變I，使不同蛋白質(zhì)或酶分離的方法叫Ks分段鹽析。而在一定的鹽和I條件下（Ks，I為常數(shù)），通過改變溫度和pH，使不同物質(zhì)分離的方法叫做β分段鹽析。通常用的中性鹽有，硫酸氨，硫酸鈉，磷酸鉀，硫酸鎂，氯化鈉，磷酸鈉等，其中以硫酸氨最為常用。這是由于硫酸氨在水中的溶解度大而穩(wěn)定系數(shù)?。?5℃時(shí)，767g/L,0℃時(shí)，697g/L)，不影響酶的活性，分離效果好，且價(jià)廉易得。缺點(diǎn)：用它鹽析時(shí)緩沖能力較差，且氨離子的存在往往會干擾蛋白的測定，所以有時(shí)也要用其他中性鹽進(jìn)行鹽析。磷酸鉀和磷酸鈉的Ks(鹽析常數(shù))較大，但由于在較低溫度時(shí)，溶解度太低，所以應(yīng)用不廣泛。鹽析時(shí)，溶液中硫酸氨的濃度常用飽和度表示，飽和度指溶液中飽和硫酸氨的體積與溶液總體積之比。如70mL酶液加入30飽和硫酸氨溶液，則混合物中硫酸氨的濃度為30÷（70＋30）＝0.3飽和度，由此可知，不含硫酸氨的溶液飽和度為0飽和硫酸氨的飽和度為1，飽和溶液稀釋一倍（即飽和溶液與水等體積混合），其飽和度為0.5。飽和硫酸氨的配方如下水＋過量硫酸氨50－60℃加熱數(shù)分鐘趁熱過濾，濾液在0℃或25℃平衡1－2天，有固體析出時(shí)，此液即達(dá)100％飽和度。鹽析時(shí)所需添加的飽和硫酸氨的體積計(jì)算如下V=V0*(S2-S1)/(1-S2)V，V0分別為所需加入的飽和硫酸氨體積及原來溶液的體積S2，S1分別為所需達(dá)到的飽和度和原來的飽和度除此之外，也可將固體硫酸氨直接按需要量加入到酶液中，其加入量按下式計(jì)算W=B*(S2-S1)/(1-AS2)(g)W:將1LS1飽和度的溶液提高到S2飽和度時(shí)，所需加入的固體克數(shù)S2，S1同前A,B為常數(shù)，與溫度有關(guān)0oC時(shí)，A＝0.27B＝70725oC時(shí)，A＝0.29B＝756一般方便方法是，直接查表獲得所需數(shù)據(jù),這時(shí)要注意表中所規(guī)定的溫度，加入固體硫酸氨后，溶液體積會發(fā)生變化，這種變化已考慮在表中數(shù)據(jù)中。酶結(jié)構(gòu)不同，所需鹽濃度不同。同種酶，來源不同，所需濃度也不同。酶濃度不同，雜質(zhì)成分不同，所需鹽濃度也有影響，這些情況一般要通過試驗(yàn)進(jìn)行摸索。鹽析時(shí)酶或蛋白質(zhì)溶液的pH應(yīng)調(diào)節(jié)到所需鹽析的酶或蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，因pH=pI時(shí)，溶解度最小。溫度維持在室溫左右，但對溫度敏感的酶應(yīng)在低溫下進(jìn)行。鹽析后的蛋白質(zhì)沉淀含有大量鹽分，一般用超濾、透析或?qū)游龇椒擕}，使酶或蛋白進(jìn)一步純化。二等電點(diǎn)沉淀原理（略）缺點(diǎn)：等電點(diǎn)時(shí)，分子表面的水膜仍然存在，使蛋白仍有一定的溶解度，沉淀不完全。在實(shí)際工作中，常與其他方法一起使用，單獨(dú)使用主要是從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。注意：在加酸或堿調(diào)pH時(shí)，要邊攪拌邊慢慢加入，以防止局部過酸或過堿。三有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑之所以能使酶等沉淀析出，主要是有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低，如20度時(shí)水的介電常數(shù)是80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶質(zhì)的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)的分子間的引力增大，相互吸引凝集，從而使其溶解度降低。對于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與溶液中的水相互作用，使分子周圍的水膜破壞，也會降低溶解度而沉淀析出。缺點(diǎn)：有可能破壞酶或蛋白質(zhì)的氫鍵等次級鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，原來在分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露于分子表面，形成疏水層，而使酶或蛋白沉淀析出，并可能引起酶或蛋白變性失活。常用的有機(jī)溶劑有：乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等.用量：一般為酶液體積的2倍左右，終濃度約為70％，但不同的酶和溶劑要分別考慮另外，使用時(shí)還要受到溫度、pH,I等的影響，要通過試驗(yàn)進(jìn)行確定。四復(fù)合物沉淀法（共沉淀法）在酶溶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，分離出沉淀后，再用適當(dāng)方法，將酶從復(fù)合物中重新析出的方法。能與酶形成復(fù)合沉淀物的物質(zhì)稱為酶（蛋白質(zhì)）沉淀劑。常用的有：單寧，聚丙烯酸等高分子聚合物。如：在以單寧為沉淀劑時(shí)，先將酶液調(diào)到一定的pH（一般控制在4－7，不同的酶所需的pH不同），然后加入一定量的單寧（通常為酶液的0.1－1％），即可形成酶與單寧的復(fù)合物沉淀。然后分離沉淀，沉淀復(fù)合物中的單寧可用丙酮或乙醇抽提而除去；也可用pH8－11的碳酸鈉或硼酸鈉等堿性溶液處理，使酶溶解出來，而單寧仍為沉淀；沉淀復(fù)合物也可用Tween60（聚氧乙烯山梨醇硬脂酸酯），Tween80（聚氧乙烯山梨醇油酸酯），分子量大于6000的PEG（聚乙而醇）或PVP（聚乙烯氮戊環(huán)酮）等進(jìn)行復(fù)分解反應(yīng)，這些大分子與單寧形成難溶的樹脂狀沉淀，而使酶游離出來，單寧復(fù)合物沉淀法適用于各種來源的蛋白酶，α－淀粉酶，果膠酶，纖維素酶等的大規(guī)模生產(chǎn)。以聚丙烯酸為沉淀劑時(shí)，將酶的pH調(diào)到3－5，然后加入適量的聚丙烯酸，反應(yīng)生成復(fù)合物沉淀，分離出沉淀后把pH調(diào)到6以上，則復(fù)合物中的酶與聚丙烯酸分開，此時(shí)加入鈣、鎂、鋁等離子，使之生成聚丙烯酸鹽沉淀，而酶游離出來，聚丙烯酸的用量一般為蛋白量的30－40％，聚丙烯酸鹽沉淀可用2N硫酸處理，這樣可回收聚丙烯酸循環(huán)使用.第六節(jié)按分子電荷的正負(fù)多少設(shè)計(jì)的分離方法按分子所帶電荷的差異建立的分離方法有吸附交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等，電荷差異主要表現(xiàn)在荷電多少，荷電性質(zhì)。一吸附交換分離法吸附色普法是指混合物隨流動相通過吸附劑時(shí)，由于吸附劑對不同物質(zhì)有不同的吸附力而使混合物分離的方法。這是最早期的一種色普分離技術(shù)，1903年俄國植物學(xué)家研究植物色素的提取物，用石油醚沖洗菊根粉柱，得到分離的黃色、綠色區(qū)帶，所以叫做色普分離法。1931年又有人用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的2種同分異構(gòu)體，顯示這一方法具有很高的分辨率。吸附色普法操作簡單，不需特殊的裝置，分離物質(zhì)的量小到毫克，大到上百克，主要用于某些分子量不大的物質(zhì)的分離純化，個別的（如羥基磷灰石）也適用于大分子的分離提純，應(yīng)用范圍較廣。此法雖較古老，但目前仍有其實(shí)用意義吸附過程的本質(zhì)是：吸附是表面的一個重要特征之一，任何兩個相都可以形成表面，其中一個相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在其表面上的密集現(xiàn)象稱為吸附。在固體－氣體之間，固體－液體之間，吸附液體以氣體之間的表面上，都可以發(fā)生吸附現(xiàn)象。凡能夠?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì)，都稱為吸附劑，聚集于吸附劑表面的物質(zhì)叫吸附物，吸附是發(fā)生在表面上的表面現(xiàn)象，所以需要了解固體的表面特征。為什么分子能在固體表面停留一定的時(shí)間？這是因?yàn)楣腆w表面上的分子（離子或原子）和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相等，在分子內(nèi)部，分子之間相互作用力是對稱的，其力場相互抵消。而處于固體表面的分子所受到的力是不對稱的，向內(nèi)的的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層受到的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運(yùn)動中碰到固體表面時(shí)，受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。在不同條件下，吸附劑與被吸附物之間的作用，即有物理作用的性質(zhì)，又有化學(xué)作用的特征，物理作用又叫范德華吸附，是分子間相互作用的范德華力引起的，其特點(diǎn)是無選擇性，吸附速度快，吸附過程是可逆的伴隨放出的能量較小，吸附不牢，吸附的分子是單層或多層的，化學(xué)吸附主要是由化學(xué)鍵的作用引起的，如電子的轉(zhuǎn)移、分子與表面共用電子對等。其特點(diǎn)是有選擇性，吸附速度慢，不易解吸，放能大，一般吸附的分子是單層的。物理吸附和化學(xué)吸附可以同時(shí)發(fā)生，在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化。由于吸附過程是可逆的，因此被吸附物在一定條件下可以解吸出來，在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，稱為吸附平衡。根據(jù)吸附機(jī)制不同吸附交換分離法大體上可以分為三種物理吸附法羥基磷灰石吸附法離子交換吸附法（一）物理吸附法在吸附的本質(zhì)中已述及。常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、磷酸鈣、淀粉等，不同的吸附劑處理活化方法稍有差異，如硅膠的吸附能力主要和其含水量有關(guān)，含水量小于1％時(shí)，吸附活性最高，大于20％時(shí)吸附活性最低，加熱使其失水的過程稱為活化。（二）羥基磷灰石吸附法羥基磷灰石是一種微晶型磷酸鈣，CaHPO4.2H2O,在pH7以上會慢慢變?yōu)榱u基磷灰石,Ca5(PO4)3OH,在無機(jī)吸附劑中，磷酸鈣是唯一的適用于生物活性大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸）的分離的吸附劑，其吸附原理是吸附劑表面的鈣離子與蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的基團(tuán)以及吸附劑表面的磷酸根離子與蛋白質(zhì)帶正電荷的基團(tuán)之間相互作用的結(jié)果。（三）離子交換層析法離子交換作用是指，一個溶液中的某一種離子，與一個固體中的另一個具有相同電荷的離子相互調(diào)換位置，即溶液中的離子跑到固體上去，把固體上的離子替換下來，這樣，溶液稱為流動相，固體稱為固定相。很早人們就知道了這種離子交換現(xiàn)象，如用砂礫來凈水，但真正了解這種現(xiàn)象的機(jī)制及在試驗(yàn)上的廣泛應(yīng)用則到了十九世紀(jì)以后。1950－1955年期間，出現(xiàn)了以聚丙乙烯為母體的陽離子和陽離子交換劑，使離子交換層析技術(shù)得到了迅速發(fā)展。1.離子交換劑由兩部分組成；載體介質(zhì)母核和離子交換基按支持介質(zhì)的不同有離子交換樹脂，離子交換纖維素，離子交換凝膠等。（1）離子交換樹脂這是最重要的一類交換樹脂，由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作為碳骨架，然后再引入所需要的酸性基或堿性基聚苯乙烯樹脂根據(jù)引入的可解離基團(tuán)的性質(zhì)又可分為兩類A:聚苯乙烯陽離子交換樹脂（又可分為強(qiáng)酸型、中酸型和弱酸型）－SO3H+強(qiáng)酸型（磺酸基）－PO3H+中酸型（磷酸根）－COOH弱酸型（羧基）這些交換劑在交換時(shí)H+被外來的陽離子所取代R-SO3H++Na+===R-SO3Na+

+H+B：聚苯乙烯陰離子交換樹脂（又可分為強(qiáng)堿型、中強(qiáng)堿型和弱堿型）－N+(CH3)3強(qiáng)堿型（含季胺鹽）含－N+(CH3)2(叔胺)，－N+CH3（仲胺），－NH2（伯胺）為弱堿型既含強(qiáng)堿型基團(tuán)，又含弱堿型基團(tuán)的為中強(qiáng)堿型樹脂。R-N+(CH3)3OH-+Cl+====R-N+(CH3)3Cl++OH-(2)離子交換纖維素這是在酶的分離純化過程中用的最廣泛、最多的一種離子交換劑，以纖維素為母核，再配上相應(yīng)的交換基團(tuán)，吸附容量大，對酶吸附力弱，在溫和條件下可洗脫出來，對酶的影響較小。（3）離子交換凝膠這是以交聯(lián)葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠為母核再引入交換基團(tuán)制成的，這類交換劑對蛋白質(zhì)和核酸等大分子有較高的結(jié)合容量，且流速比纖維素也快，特別適合分離大分子量的蛋白質(zhì)和核酸。2.離子交換劑類型的選擇（1）可參考電泳結(jié)果在中性或偏堿性條件下電泳，向陽極移動快的物質(zhì)（帶負(fù)電），在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附，反之可被陽離子交換劑吸附。所以陰陽離子交換劑的選擇，取決于被分離物質(zhì)所帶的電荷（2）被分離酶的穩(wěn)定性待分離酶在低于其等電點(diǎn)的pH下穩(wěn)定（酶帶正電荷），可選用陽離子交換劑，在高于其等電點(diǎn)的pH下穩(wěn)定，可選用陰離子交換劑，在高于或低于其等電點(diǎn)的pH下都穩(wěn)定的，兩者都可選用。（3）如果待分離的酶的PI<6或PI>9，選用強(qiáng)型交換劑，因?yàn)槿跣偷年栯x子交換劑在PH=6以下，弱型的陰離子交換劑在PH=9以上不帶電荷，失去交換能力，而強(qiáng)型的在廣泛PH范圍之內(nèi)，都保持解離狀態(tài)，如果待分離的酶可用強(qiáng)型又可用弱型，但酶不穩(wěn)定時(shí)，應(yīng)先選用弱型的。交換的多少以總交換量表示總交換量指：交換劑中可交換離子數(shù)，一般用單位重量（干樹脂）或單位容積（濕樹脂）交換劑所能交換的毫克當(dāng)量離子來表示，即毫克當(dāng)量/克或毫克當(dāng)量/毫升，總交換量是離子交換樹脂的特征，與操作條件無關(guān)。在實(shí)驗(yàn)條件下所得到的實(shí)際交換量叫“有效交換量”，其大小取決于活性基團(tuán)的親和力、洗脫劑濃度、離子強(qiáng)度、溫度、介質(zhì)PH等，緩沖液的PH取決于被分離酶的PI、穩(wěn)定性、溶解度等。應(yīng)使被分離酶與交換基團(tuán)帶相反電荷，其起始PH在待分離酶PI上下約1個PH單位為宜。并同時(shí)考慮影響有效交換量的其他因素。離子交換層析的基本操作過程離子交換劑的預(yù)處理－－－裝柱－－－平衡－－－上樣－－－洗脫－－－洗脫液分部收集－－－檢測－－－離子交換劑再生－－－保存。為了使交換劑充分溶脹，并除去雜質(zhì)，先要將離子交換劑在水中充分浸泡，一般用水泡一天（如果想縮短時(shí)間，可以煮脹，不同交換劑處理方法稍有差異），加水浸泡的目的之一是除去細(xì)顆粒，而后改用酸堿浸泡，目的是除去雜質(zhì)和使其帶上所需要的反離子，疏水性的離子交換劑可用2－4倍的2mol/LNaOH或2mol/LHCl浸泡處理，而親水性的離子交換劑用0.1－1mol/LNaOH和0.1－1mol/LHCl處理一般選用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LHCl處理，室溫下處理30分鐘，酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型，每次用酸或堿處理后，均應(yīng)用水洗滌至中性，再用堿或酸處理，最后用水洗至中性，經(jīng)緩沖液平衡后即可使用或裝柱。裝柱－－加樣（加樣量控制在柱床體積的1％－5％）－洗脫－收集－檢測。當(dāng)上述過程完成后，離子交換劑需再生，即用蒸餾水沖洗至中性，再按預(yù)處理的方法處理，收集于容器中加入防腐劑，冷藏保存。二電泳（略）

電泳法是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其含量(%)的方法。

聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：

①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。

②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機(jī)械性質(zhì)。一般說來，含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，機(jī)械性能適用于分離分子量范圍不1萬至100萬物質(zhì)，1萬以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠，而分子量特別大的可采用含丙烯酰胺4%的凝膠，大孔膠易碎，小孔膠則難從管中取出，因此當(dāng)丙烯酰胺的濃度增加時(shí)可以減少雙含丙烯酰胺，以改進(jìn)凝膠的機(jī)械性能。

③在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。凝膠無色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定。

④丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝膠。在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發(fā)劑和另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。凝膠的篩孔，機(jī)械強(qiáng)度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)決定。每100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，常用T%表達(dá)；凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)體總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，常用C%表示，a：丙烯酰胺克數(shù)；b：甲撐雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積（毫升）凝膠濃度過高時(shí)，凝膠硬而脆，容易破碎；凝膠濃度太低時(shí)，凝膠稀軟，不易操作。

交聯(lián)度過高，膠不透明并缺乏彈性；交聯(lián)度過低，凝膠呈糊狀。聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度，它不防止對流減低擴(kuò)散的能力，而且因?yàn)樗哂腥瓤臻g網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，某分子通過這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大小和形狀，這是凝膠的分子篩作用。由于這種分子篩作用，這里的凝膠并不僅是單純的支持物，聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類，前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的，后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液，pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就

可以用電泳技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作