新型冠狀病毒標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

新型冠狀病毒標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)（第五版）指導(dǎo)本市各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、各區(qū)疾病預(yù)防控制中心開展新型冠狀病毒肺炎病例的標(biāo)本采集和核酸檢測(cè)，特制定本技術(shù)指南。本指南不包括新型冠狀病毒分離和血清學(xué)等檢測(cè)。一、標(biāo)本采集（一）采集對(duì)象新型冠狀病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進(jìn)一步篩查檢測(cè)的環(huán)境或生物材料。（二）標(biāo)本采集要求1.從事新型冠狀病毒檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)（培訓(xùn)合格）和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。在標(biāo)本采集過程中，采樣人員的個(gè)人防護(hù)裝備要求：N95及以上防護(hù)口罩、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、雙層乳膠手套、防水鞋套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時(shí)更換外層乳膠手套。2.住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。3.出現(xiàn)癥狀的密切接觸者標(biāo)本由其就診的醫(yī)療機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。4.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，可結(jié)合病程及研究需求多次采樣。（三）標(biāo)本采集種類每個(gè)病例必須采集急性期呼吸道標(biāo)本，同時(shí)采集上、下呼吸道標(biāo)本；應(yīng)優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本（如支氣管或肺泡灌洗液，肺組織活檢標(biāo)本等），可根據(jù)臨床表現(xiàn)與采集樣本的時(shí)間間隔決定采集；重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本（如支氣管或肺泡灌洗液等）；出現(xiàn)眼部癥狀的病例，需采集眼結(jié)膜拭子標(biāo)本；出現(xiàn)腹瀉癥狀的病例，需留取糞便標(biāo)本；采集發(fā)病初期第一份血清和血漿（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）和發(fā)病后第3～4周第二份血清和血漿。死亡病例依據(jù)《傳染病病人或疑似傳染病病人尸體解剖查驗(yàn)規(guī)定》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)健委第43號(hào)令）中的相關(guān)規(guī)定采集尸體標(biāo)本，沒有條件進(jìn)行尸體解剖的，可采集呼吸道灌洗液或經(jīng)皮穿刺采集肺組織標(biāo)本。其他研究材料依據(jù)設(shè)計(jì)需求采集。標(biāo)本種類：1.上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液。2.下呼吸道標(biāo)本：包括深咳痰液、呼吸道吸取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本。3.血清和血漿標(biāo)本：每一病例都應(yīng)盡量采集急性期、恢復(fù)期的非抗凝血和抗凝血，分離血清和血漿。第一份非抗凝血和抗凝血應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）采集，第二份非抗凝血和抗凝血應(yīng)在發(fā)病后第3～4周采集。采集量要求5ml，建議使用真空采血管，抗凝血使用含有EDTA抗凝劑的真空采血管。血清標(biāo)本不進(jìn)行核酸檢測(cè)。4.眼結(jié)膜標(biāo)本：出現(xiàn)眼部感染癥狀的病例需采集眼結(jié)膜拭子標(biāo)本。5.糞便標(biāo)本：出現(xiàn)腹瀉癥狀的患者需采集糞便標(biāo)本約10克，如果不便于留取便標(biāo)本，可采集肛拭子。（四）標(biāo)本采集方法1.咽拭子：用兩根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，稍用力來回擦拭至少各3次，將拭子頭浸入含3ml病毒采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。2.鼻拭子：將一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml病毒采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。4.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml螺口塑料管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測(cè)前，加入2-3ml的病毒采樣液，或加入痰液等體積的痰消化液。也可以用痰液體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液液化。痰消化液儲(chǔ)存液配方：二硫蘇糖醇0.1g，氯化鈉0.78g，氯化磷0.02g，磷酸二氫鈉0.112g，磷酸二氫鉀0.02g，水7.5ml，調(diào)節(jié)pH7.4±0.2，室溫儲(chǔ)存。臨用前將儲(chǔ)存液以去離子水稀釋至100ml。5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集）。6.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管分支開口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50ml，總量100～250ml，不應(yīng)超過300ml。7．眼結(jié)膜標(biāo)本：眼結(jié)膜表面用拭子輕輕擦拭后，將拭子頭插入采樣管中，尾部棄去，旋緊管蓋。8．糞便或肛拭子標(biāo)本：如患者發(fā)病早期出現(xiàn)腹瀉癥狀，則留取糞便標(biāo)本約10g，或采集肛拭子到3ml病毒保存液中。糞便標(biāo)本可用病毒保存液稀釋混勻后，10000rpm在4℃條件下離心5min，吸取上清液備用。9.血清和血漿標(biāo)本：血清用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。血漿用含有EDTA抗凝劑的真空采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，分別收集血清和血球于無菌螺口塑料管10.其他材料：依據(jù)設(shè)計(jì)需求規(guī)范采集。（五）標(biāo)本分裝和包裝標(biāo)本采集后在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝成二份。除本單位檢測(cè)用標(biāo)本外，一份上送市疾病預(yù)防控制中心（XX市傳染病檢測(cè)樣本采集送驗(yàn)單），一份留待送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒預(yù)防控制所復(fù)核檢測(cè)。1.標(biāo)本分裝：所有標(biāo)本應(yīng)放在大小合適的耐冷凍、有墊圈的外螺旋蓋的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號(hào)、種類、姓名及采樣日期。2.標(biāo)本包裝：采集的病例標(biāo)本按照A類感染性物質(zhì)進(jìn)行包裝和運(yùn)送。病毒培養(yǎng)物采用A類，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN2814包裝運(yùn)送。環(huán)境標(biāo)本屬于B類，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN3373。（六）標(biāo)本保存用于檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，24小時(shí)內(nèi)能檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃保存；24小時(shí)內(nèi)無法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清可在4℃存放3天，可在-20℃以下暫存。標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融，并單獨(dú)保存標(biāo)本，避免反復(fù)凍融。（七）標(biāo)本送檢1.標(biāo)本運(yùn)送：樣本采集后應(yīng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室，如不能及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室必須在-4℃條件下暫存；運(yùn)送時(shí)使用冰袋保持低溫環(huán)境。樣本接收時(shí)需要核對(duì)被檢樣本姓名、性別、年齡、編號(hào)、樣本種類及檢測(cè)項(xiàng)目等信息。同時(shí)一起提交《XX市新型冠狀病毒肺炎檢測(cè)樣本采集送驗(yàn)單》（見附件）。2.運(yùn)送安全：按照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理辦法》（國(guó)務(wù)院424號(hào)令）和《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)健委第45號(hào)令）等有關(guān)規(guī)定執(zhí)行，辦理《準(zhǔn)運(yùn)證》，專人運(yùn)送。3.標(biāo)本和毒株管理：新型冠狀病毒標(biāo)本及其毒株應(yīng)有雙人專人管理，準(zhǔn)確記錄來源、種類、數(shù)量，編號(hào)登記，采取有效措施確保安全，嚴(yán)防發(fā)生無用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。二、新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和結(jié)果判定新型冠狀病毒檢測(cè)必須在符合生物安全要求的實(shí)驗(yàn)室由經(jīng)過相關(guān)技術(shù)安全培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作。常規(guī)檢測(cè)方法是通過實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR（realtimereversetranscriptionPCR，rRT-PCR）檢測(cè)病毒核酸和定型，陽性標(biāo)本進(jìn)一步通過新型冠狀病毒全基因測(cè)序鑒定。（一）標(biāo)本檢測(cè)病毒核酸的檢測(cè)方法主要有新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框架1a/b（ORF1a/b）和核殼蛋白（nucleocapsid，N）。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作和檢測(cè)。（二）結(jié)果判斷按照檢測(cè)試劑盒的說明書，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果CT值，判定目標(biāo)核酸檢測(cè)結(jié)果的陰陽性。在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)病例陽性，需滿足以下條件中的一個(gè)：1.同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標(biāo)（ORF1a/b、N）特異性rRT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽性；2.如果出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽性的檢測(cè)結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測(cè)，如果仍為單靶標(biāo)陽性，判定為陽性。3.兩種標(biāo)本rRT-PCR同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢測(cè)中均出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性的檢測(cè)結(jié)果，可判定為陽性。4.陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括：樣本質(zhì)量差，XX口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。rRT-PCR檢測(cè)結(jié)果陰性，但臨床表現(xiàn)和流行病毒學(xué)特點(diǎn)提示是新型冠狀病毒感染。三、實(shí)驗(yàn)室生物安全新型冠狀病毒暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進(jìn)行管理。從事新型冠狀病毒檢測(cè)的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，并取得相應(yīng)資格和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能，實(shí)驗(yàn)室開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后并符合生物安全要求后開展檢測(cè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)采取相應(yīng)的生物安全防護(hù)。具體要求如下。（一）核酸提取：未經(jīng)培養(yǎng)的感染型材料的分裝和核酸提取應(yīng)做好個(gè)人三級(jí)生物安全防護(hù)、在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。（二）血清學(xué)檢測(cè)：進(jìn)行ELISA檢測(cè)血清抗體時(shí)，要求在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作；采用微量中和試驗(yàn)進(jìn)行血清抗體檢測(cè)應(yīng)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作。（三）病