微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1目的與適用范圍本規(guī)程規(guī)定了微生物限度檢查方法和操作要求。本規(guī)程適用公司所需進(jìn)行微生物限度的檢查。2職責(zé)質(zhì)量保證部負(fù)責(zé)本規(guī)程的實(shí)施。3內(nèi)容引用標(biāo)準(zhǔn)：《中國藥典》2010年版二部。藥品微生物限度檢查法總則抽樣供試品一般按批號隨機(jī)抽樣。一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量。抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異常可疑的樣品，應(yīng)選有疑問的樣品，但因機(jī)械損傷明顯破裂的包裝不得作為樣品，凡已能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出長螨、長霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格，無需要再抽樣檢驗(yàn)。供試品保存供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，以防供試品中的污染菌因保藏條件所引起致死、損傷或繁殖。3.2.2.2供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)該保持原有包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟，包裝已開啟的樣品不得作為供試品。檢驗(yàn)供試品檢驗(yàn)項(xiàng)目按《中國藥典》2010年版二部微生物限度標(biāo)準(zhǔn)確定。檢驗(yàn)的全過程，均應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。除另有規(guī)定外，供試品制備成供試液后，應(yīng)在均勻狀態(tài)取樣。制成供試液后，應(yīng)該在60分鐘內(nèi)注皿操作完畢。培養(yǎng)除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30?35℃,霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為25?28℃,控制菌培養(yǎng)溫度為36℃±1℃。復(fù)檢菌數(shù)測定不合格者應(yīng)復(fù)檢，控制菌檢查以一次檢出為準(zhǔn)，不再復(fù)試，但應(yīng)保留檢出菌株一個(gè)月備查。復(fù)試項(xiàng)目以不合格項(xiàng)目為準(zhǔn)，作單項(xiàng)復(fù)試。復(fù)試需另取同批號樣品，復(fù)試2次。復(fù)試報(bào)告，以3次測定結(jié)果的平均值報(bào)告。檢驗(yàn)報(bào)告檢驗(yàn)報(bào)告以1g、1ml或10cm2為單位。測定菌數(shù)報(bào)告，依3.10.2.4菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告。控制菌按檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告，如未檢出控制菌時(shí)，報(bào)告為“按規(guī)定抽樣檢驗(yàn)結(jié)果未檢出XX菌”，如抽樣中任意一樣品檢出控制菌時(shí)，報(bào)告為“按規(guī)定抽樣，檢出XX菌，不符合藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”。培養(yǎng)基及其制備方法營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基34g,加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（虎紅瓊脂培養(yǎng)基）。取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基30g,加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）取膽鹽乳糖培養(yǎng)基36g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基54g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。磷酸鹽葡萄胨水培養(yǎng)基15.8g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。蛋白胨水培養(yǎng)基取蛋白胨水培養(yǎng)基15g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。枸櫞酸鹽培養(yǎng)基取枸櫞酸鹽培養(yǎng)基22g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。4-甲基傘形酮葡萄苷酸培養(yǎng)基（MUG）取4-甲基傘形酮葡萄苷酸培養(yǎng)基35g，加1000ml水，分裝，115℃高壓滅菌20分鐘。注：培養(yǎng)基（生物試劑）中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)。試液0.1%2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液。配制：取2,3,5-氯化三苯基四氮唑0.1g溶于100ml水，滅菌，備用。用途：供制備培養(yǎng)基用。無菌對氨基苯甲酸試液配制：取對氨基苯甲酸0.運(yùn)，加入含10ml水的具塞試管中，121℃滅菌20分鐘。用途：供磺胺類藥物檢驗(yàn)用。氫氧化鉀試液配制：取氫氧化鉀40g，加水溶解使成100ml。用途：供作V-P反應(yīng)試劑。-萘酚乙醇溶液用途：供作V-P反應(yīng)試劑。靛基質(zhì)試液取對二甲氨基苯甲醛5.08，加入戊醇（或正丁醇）75ml,充分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，或取對二甲氨基苯甲醛1.08，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入。稀釋劑0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃滅菌20分鐘。無菌磷酸鹽緩沖液（PH7.2）取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g,加水稀釋至1000ml,121℃滅菌20分鐘。指示液甲基紅指示液取甲基紅0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。澳麝香草酚藍(lán)指示液取澳麝香草酚藍(lán)0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml,變色范圍6.0?7.6（黃一藍(lán)）供試品的檢驗(yàn)量：每批供試品檢驗(yàn)量一般為10g或10ml，化學(xué)膜劑為100cm2,貴重的或微量包裝的供試品檢驗(yàn)量可酌減，但口服藥品不得少于3g，外用藥品不得少于5g。供試品須取自2個(gè)以上的包裝單位。供試液的制備液體供試品：取供試品101^，加入稀釋劑90ml，混勻，作為供試液。固體供試品：取供試品10g，置0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻后，作為供試液。腸溶膠囊（片）供試品：取供試品10g，置含有無菌磷酸鹽緩沖液（PH6.8）100ml的錐形瓶內(nèi)，于45℃水浴中，保溫，振搖，使溶解，作為供試液。含抑菌成分供試品的供試液制備方法：離心沉淀法:可溶性供試液：取供試液101m,置入刻度離心管中，以3000轉(zhuǎn)/分以上離心沉淀30分鐘，用毛細(xì)管吸取上清液棄掉，留下管底約2ml殘余液，將其全部洗入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢查?；鞈夜┰囈海喝」┰囈?0ml，置刻度離心管中，先以500轉(zhuǎn)/分離心沉淀5分鐘，取其上清液移入另一離心管中，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分以上離心沉淀30分鐘，棄去上清液，保留約2ml殘余液，全部洗入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢驗(yàn)。鈍化劑中和法：磺胺類藥物中和法：取規(guī)定量的供試液，加入含有無菌1%對氨基苯甲酸試液0.5ml的100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)即可。沉降法：取規(guī)定量的供試液，自然沉降5分鐘，吸取上層液于含1%的對氨基苯甲酸1ml的增菌液，作增菌培養(yǎng)即得。稀釋法將供試液種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具有抑菌作用的濃度。對照試驗(yàn)：陰性對照試驗(yàn)：測試檢驗(yàn)全過程中無菌技術(shù)的可靠性?？刂凭鷻z驗(yàn)陰性對照試驗(yàn)：供試驗(yàn)用稀釋劑10ml于增菌液中，按控制菌檢驗(yàn)方法檢查，無菌生長。3.9.2陽性對照試驗(yàn)：檢查供試品是否對控制菌生長產(chǎn)生干擾作用及檢查培養(yǎng)條件是否適宜。陽性對照試驗(yàn)：方法同供試品檢驗(yàn)，于供試液中加入一定量（50?100）的相應(yīng)對照菌，作為陽性對照試驗(yàn)。對照用菌株：大腸桿菌［CMCC(B)44102］、沙門菌［CMCC(B)50094］對照用菌液的制備：取陽性菌株的營瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18?20小時(shí)后，稀釋至10-6?10-7。對照菌的加入量為50?100個(gè)。(取稀釋液1ml注皿測定菌落數(shù))當(dāng)供試品未檢出控制菌時(shí)，而陽性對照試驗(yàn)也未能檢出，不能做出供試品未檢出控制菌的結(jié)論。陽性對照試驗(yàn)操作必須與供試品檢驗(yàn)操作嚴(yán)格分開，避免交叉污染。3.10檢查法：檢查前的準(zhǔn)備：用具的洗滌與滅菌。(a)試管：使用過的試管經(jīng)消毒后，將培養(yǎng)基倒出，用清潔液洗刷，用水沖洗4-5次，倒立，晾干備用。滅菌前，用棉塞塞上管口，牛皮紙包緊，扎緊。(b)吸管：使用過的吸管用清潔液浸泡數(shù)分鐘后，用水沖洗4-5次，晾干，備用。滅菌前，在吸管上端距0.5cm處塞入約2cm左右的適當(dāng)疏松棉花，用牛皮紙裹緊。(c)研缽：使用過的研缽用清潔液洗刷后，用水沖洗數(shù)次，晾干備用。滅菌前，用牛皮紙將缽體和錘包裹。(d)培養(yǎng)皿：使用過的培養(yǎng)皿經(jīng)消毒后，將培養(yǎng)基倒出，用清潔液洗刷，用水沖洗4-5次，倒立、晾干備用。滅菌前，根據(jù)消毒器內(nèi)經(jīng)大小用牛皮紙包數(shù)個(gè)培養(yǎng)皿，扎緊。(e)將上述包好的用具，放在121的高壓蒸汽消毒器中，滅菌30min后，放入微生物限度檢查室定點(diǎn)位置，備用。將所有已滅菌的培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管(1ml、10ml)、稀釋劑及供試品等移至無菌室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入操作間。將全部包裝(牛皮紙)去掉，編號。開啟無菌室紫外線殺菌燈和空氣過濾裝置并使用其工作30min。操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外線殺菌燈，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋，再用0.1%新潔爾滅或用75%乙醇棉球擦手，待干后，穿戴無菌衣、帽、口罩。操作前先用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口周圍，待干后將供試品瓶、盒、袋啟封，啟封后先檢查瓶蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍有無生霉、長螨的跡象，對肉眼可見疑似者，若經(jīng)證實(shí)為生霉、長螨即可判定為不合格，無須繼續(xù)檢驗(yàn)。細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)。檢驗(yàn)程序：干燥操作步驟:(a)供試液制備：經(jīng)陰性對照取樣后，按各類制劑制備供試液的方法制備。(b)稀釋及取樣稀釋：取1ml吸管1支，吸取混勻的1:10供試液(或原液，1:20供試液)1ml，在離稀釋劑液面上約1cm處，測管壁注入裝有9ml的稀釋劑的的試管中，混勻成1:100(或1:10，1:200)的稀釋液。吸樣：用上述吸管分別取1:10供試液(或原液，1:20供試液)1ml,注入2?3個(gè)平皿中，以另一支1ml吸管，按上述操作下一級的稀釋與吸取。(c)注皿與干燥事先將培養(yǎng)基融化，置45℃水浴中，備用，當(dāng)供試液及各稀釋液均注入平皿后，以上述培養(yǎng)基傾注入平皿，每平皿約15ml,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣液與培養(yǎng)基混勻后，置水平臺(tái)上待凝。培養(yǎng)基凝固后，在凈化條件下開蓋倒置或換滅菌的陶瓦蓋，使平板干燥，減少平板表面的水分，防止菌落蔓延生長，干燥時(shí)間一般在3h左右，干燥時(shí)間計(jì)入培養(yǎng)時(shí)限。(d)培養(yǎng)：將上述平板倒置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)。細(xì)菌于30?35℃培養(yǎng)48±2小時(shí)，霉菌于25?28℃培養(yǎng)72±2小時(shí)。菌落計(jì)數(shù)：(a)用肉眼直接計(jì)數(shù)，標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用5-10倍放大鏡檢查，是否遺漏。(b)若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，肉眼可分辨時(shí)，仍以1個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。(c)平板上有片狀菌落或花斑樣菌落蔓延生長以及平板受到污染的情況，該平板計(jì)數(shù)無效。(d)當(dāng)同一稀釋級使用2個(gè)平板時(shí)，應(yīng)采用2個(gè)平板菌落數(shù)的均值為平均平板菌落數(shù)，若2個(gè)平板菌落數(shù)相差在1倍以上時(shí)，該稀釋級不宜采用，但不包括2個(gè)平板菌數(shù)均在15個(gè)以下的情況(15個(gè)以下兩平板菌落數(shù)允許幅度0-4,1-7,2-9，4-12，5-14，6-15，7-17，8—18，9—19，10-20)。(e)當(dāng)同一稀釋級使用3個(gè)平板時(shí)，應(yīng)采用3個(gè)平板菌落數(shù)的均值為平均平板菌落數(shù)，若其中1個(gè)平板菌落數(shù)不能參與平均，但不包括平板菌落數(shù)均在10個(gè)以下的情況(10個(gè)以下平板最大與最小菌落數(shù)的允許幅度0-3,1-5,2-7,3-9，4-10,6-13,7-14)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌一般宜選取平均平板菌落數(shù)在30?300間的稀釋級，作為菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)，霉菌宜選取平均菌數(shù)在30?100之間的稀釋級作為菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)。(a)若有1個(gè)稀釋級的平均平板菌落數(shù)處在30?300(30?100)之間時(shí)，將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，為報(bào)告菌數(shù)。(b)若有2個(gè)稀釋級的平均平板菌落數(shù)處在30?300(30?100)之間時(shí)，按下式計(jì)算兩級比值。高稀釋級的平均平板菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)比值= 低稀釋級的平均平板菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)當(dāng)比值＜2時(shí)，以兩級的菌落數(shù)均值為報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)比值＞2時(shí)，以低稀釋級平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。(c)若有3個(gè)稀釋級的平均平板菌數(shù)處在30~300(30?100)之間時(shí)，采用后2個(gè)稀釋級計(jì)算級間比值。當(dāng)比值＜2時(shí)，以兩級的菌落數(shù)均值為報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)比值＞2時(shí)，以低稀釋級平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。(d)若各稀釋級平均平板菌數(shù)均在300以上，按最高的稀釋級的平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)，或適當(dāng)增加稀釋數(shù)，重作測定后報(bào)告結(jié)果。(e)若各稀釋級的平均平板菌落數(shù)均不在30?300之間，其中稀釋級的平均平板菌落數(shù)大于300,相鄰稀釋的平均平板菌落數(shù)又小于30時(shí)，以最接近30或300的稀釋級平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。(f)若各稀釋平均平板菌落數(shù)均小于30時(shí)，按最低稀釋級的平均板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)，但若應(yīng)用原液為供試液，當(dāng)1：10稀釋級與原液的平均平板菌落數(shù)相等或大于時(shí)，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測定。培養(yǎng)基稀釋法：取供試液(原液或1:10,1：100供試液)3份，每份各1ml,分別注入5個(gè)平皿內(nèi)(每皿積壓0.2ml),每個(gè)平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml,混的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)，以3份供試液菌數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。若各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1時(shí)，則報(bào)告菌數(shù)為小于10個(gè)。3.10.2.6報(bào)告數(shù)書寫(細(xì)菌數(shù)報(bào)告規(guī)則舉例)規(guī)則原液供試品稀釋倍數(shù)級間比值菌落數(shù)報(bào)告數(shù)書寫10-1 10-2 10-34.11365 164 201640016X103或160004.22760 295 461.63775038X103或380002890 271 602.22710027X103或270004.3239 202 351.72760028X103或28000236 196 421960020X103或200004.4不可計(jì)4650 5135130051X104或510004.5不可計(jì)305 123050030X103或300004.624 19 1224024X103或24022.327 7 —27027X103或270506 0 06<10(a)菌落數(shù)在100個(gè)以內(nèi)時(shí)，按實(shí)測數(shù)書寫報(bào)告。(b)菌落數(shù)大于100時(shí)，取二位有效數(shù)字，第三位數(shù)按有關(guān)數(shù)字處理規(guī)格處理，為簡便計(jì)，也可用10的指數(shù)報(bào)告。不得按計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告的情況(a)空白對照平板有菌生長，表明培養(yǎng)基已被污染；(b)各稀釋級平板上生產(chǎn)的菌落數(shù)不符合10倍遞增稀釋規(guī)律，菌數(shù)顯示混亂;(c)同一稀釋級的兩個(gè)平板上生長的菌落數(shù)均在15個(gè)以上，但菌數(shù)相差一倍以上；(d)菌落蔓延生長覆蓋整個(gè)平板無法計(jì)數(shù)；出現(xiàn)以上情況，該次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不得計(jì)數(shù)報(bào)告。大腸桿菌檢查法；檢驗(yàn)程序(見附頁)操作步驟(a)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量(10ml)的供試液，其中1份加入對照菌50?100個(gè)作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)18?24小時(shí)（必要可延至48小時(shí)）。陰性對照應(yīng)無菌生長。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml,分別接種至5mlMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時(shí)與24小時(shí)時(shí)，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽性對照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。當(dāng)陰性對照呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，并證明無菌生產(chǎn)，判未檢出大腸桿菌。供試液MUG陽性，靛基質(zhì)陽性，判檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。（b）如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取從試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)18?24小時(shí)，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌?；蛴芯渖L，應(yīng)挑選2?3可疑菌落作靛基質(zhì)試驗(yàn)（1）、甲基紅試驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇生成試（V-P）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）及革蘭染色、鏡檢，按表（3.10.3.3）規(guī)定判斷結(jié)果。（c）靛基質(zhì)試驗(yàn)（1）,取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。（d）甲基紅試驗(yàn)（M）,取可疑菌數(shù)或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄胨水培基中，培養(yǎng)48小時(shí)±2小時(shí)，于管內(nèi)加入甲基紅指示液數(shù)滴，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。（e）乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）,取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖礴水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)±2小時(shí)，于每2ml培養(yǎng)液中加入-萘酚乙醇試液1ml,混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml,充分振搖，在4小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。(f)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(C)，取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，一般培養(yǎng)48?72小時(shí)，培養(yǎng)基斜面有菌落生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變?yōu)殛幮浴?g)革蘭氏染色法、鏡檢試劑：結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g溶于95%乙醇20ml,與1%草酸銨溶液80ml混勻，靜置48h備用。革蘭氏碘液:先用3?5ml蒸餾水溶解2.0g碘化鉀，再加入磺片1.0g,待全溶后，加蒸餾水稀釋至300ml,備用。沙黃(蕃紅)染液：將沙黃0.25g溶于95%乙醇10ml中，待全溶解后再加蒸餾水至100ml,即可。染色法：用接種環(huán)沾取無菌水，置于潔凈載玻片上，再挑取少許菌苔，輕輕研開，使均勻。涂片自然風(fēng)干或微熱烤干，而后通過火焰2?3次以固定涂片。滴加結(jié)晶紫梁液，染色1分鐘，水洗，滴加磺液媒染1分鐘，水洗，甩干余水，滴加95%乙醇脫色，約20?30秒，水洗，吸干，滴加沙黃復(fù)染液，染1分鐘，水洗，待干，鏡檢。染色結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色，陰性菌呈紅色。結(jié)果判斷見下表：MUG-1革蘭氏鏡檢麥康凱瓊脂或EM瓊脂IMVic結(jié)果+ +檢出大腸桿菌 未檢出大腸桿菌+ -無菌生長未檢出大腸桿菌+ -G桿菌有菌生長-+—(1)檢出大腸桿菌- +G桿菌有菌生長++—(2)檢出大腸桿菌（a）對與MUG-1反應(yīng)不符合可疑菌株。如表中Q）出現(xiàn)++--或（2）出現(xiàn)-+--,均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG-1和IMVic試驗(yàn)。附圖：（見下頁）MUG管紫外觀察，顯熒光為陽性，MUG+；無熒光為陰性，MUG-oMUG管靛基質(zhì)顯色，MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅為陽性，I+；液面呈試劑本色為陰性，I-。附頁：大腸桿菌的檢驗(yàn)程序:EMB或麥康凱瓊脂報(bào)告報(bào)告無菌落生長36±1℃+判未檢出大腸桿菌有菌落生長普通肉湯瓊脂斜面革蘭氏染色鏡撿靛基質(zhì)試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)V-P試驗(yàn)枸檬酸鹽附頁：大腸桿菌的檢驗(yàn)程序:EMB或麥康凱瓊脂報(bào)告報(bào)告無菌落生長36±1℃+判未檢出大腸桿菌有菌落生長普通肉湯瓊脂斜面革蘭氏染色鏡撿靛基質(zhì)試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)V-P試驗(yàn)枸檬酸鹽36±1℃ 18~24h報(bào)告18~24h 36±1℃活螨檢查法設(shè)備和材料顯微鏡、雙筒實(shí)體顯微鏡放大鏡解剖針、發(fā)絲針、小毛筆載玻片、蓋玻片酒精燈培養(yǎng)皿或小搪瓷盤（內(nèi)襯黑色）30%甘油水螨的形態(tài)特征螨的體形微小，多在1mm以下，一般呈卵形或橢圓形、無頭胸、腹界限。幼螨足三對，若螨足四對，成螨足多數(shù)為四對。足通常由六節(jié)組成?？谄飨蚯巴怀觯３黍Q狀，由2-3節(jié)組成。須肢節(jié)數(shù)因種類而異，由1-2節(jié)到5節(jié)組成，一般呈爪或鉗狀，偶爾為長形。有些種類在軀體前端或兩側(cè)有1-2對眼。軀體兩側(cè)對稱，表面被有堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)的板，保護(hù)其內(nèi)部器官和支持肌肉固定。體表有剛毛，它的形狀、數(shù)目及彼此長短比例和排列位置因種類而異。螨類與蜘蛛、昆蟲（書虱），外形比較的近似，因此，必須注意它們之間的主要區(qū)別，見下表：螨與蜘蝗、昆蟲主要形態(tài)鑒別特征成螨（如腐食醋螨）蜘蛛昆蟲（如書虱）分類蛛形綱，蜱螨目蛛形綱，蜘蛛目昆蟲綱，嚙蟲目足4對4對3對觸角無無1對體段頭、胸、腹無界限分頭、胸部和腹部分頭、胸、腹三部檢查方法：（a）直檢法：取供試品先用肉眼觀察，有無疑似活螨的白點(diǎn)或其它顏色的點(diǎn)狀物，再用5-10倍放大鏡或雙筒實(shí)體顯微鏡檢視，有螨者，用解剖針或發(fā)絲針或小毛筆挑取活螨放在滴一滴甘油水的載玻片上，置顯微鏡下觀察。(b)漂浮法：將供試品放在盛大有飽和食鹽水的扁形稱量瓶或適宜的容器內(nèi)，加飽和食鹽水至容器的三分之二處，攪拌均勻，置10倍放大鏡或雙筒實(shí)體顯微鏡下檢查，或繼續(xù)加飽和食鹽水至瓶口處(為防止鹽水和樣品溢出污染桌面，宜將上述容器放在裝有適量甘油溶液的培養(yǎng)皿中)，用潔凈的載玻片蓋在瓶口上，使玻片與液面接觸，沾取液面上的漂浮物，置顯微鏡下檢查。(c)分離法：也稱烤螨法。將供試品放在特制的分離器或附有孔徑大小適宜的篩網(wǎng)的普法玻璃漏斗里，利用活螨避光、怕熱的習(xí)性，在漏斗的廣口上面放一個(gè)60?100W的燈泡，距離藥品約6cm處，照射1—2小時(shí)?；铗裳刂┒穬?nèi)的底部細(xì)頸內(nèi)壁向下爬，用小燒杯裝半杯甘油水，放在漏斗的下口處，收集爬出來的活螨?；铗训臋z驗(yàn)方法：螨卵極小，一般在0.1mm以正是，呈乳白色，橢圓形或卵圓形。須用10-20倍放大鏡或顯微鏡方可查見。螨卵常見于活螨的周圍，但在未檢出活螨的樣品中，亦有檢出螨卵者。一般在供試品中已經(jīng)檢出活螨的，不再進(jìn)行螨卵的檢查。對可疑供試品，未檢出活螨時(shí)，可注意檢查活螨卵。檢驗(yàn)方法：可采用檢驗(yàn)活螨項(xiàng)下的直檢法或漂浮法檢查。凡用上述兩種方法檢查，如發(fā)現(xiàn)可疑螨卵時(shí)，用發(fā)絲針小心挑取。取一塊凹形載玻片，在凹窩中央滴入2滴甘油水，將挑取物放入甘油水中，置顯微鏡下檢查，為確證挑取物是否為活螨卵，可將上述載玻片置培養(yǎng)皿中，加蓋，于22?30℃培養(yǎng)3-8天，每天上、下午定時(shí)用低倍顯微鏡觀察，如在甘油水液中孵出幼螨，則判斷為檢出活螨卵。供試品檢驗(yàn)報(bào)告(a)凡供試品按上述有關(guān)劑型項(xiàng)規(guī)定檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)活螨者，應(yīng)作檢出活螨報(bào)告。(b)在供試品中未檢出活螨，但檢出活螨卵時(shí)，可按檢出活螨處理。(c)為保留陽性結(jié)果備查，可將檢出的螨按下法處理保存；將活螨挑放在載玻片上，預(yù)先滴有1滴75%乳酸溶液中，加上蓋玻片。手持載玻片，在酒精燈小火焰上來回移動(dòng)，緩緩加熱片刻，使其適當(dāng)透化、即可鏡檢。鑒定后的螨體，可取下放入70%酒精中保存，或適當(dāng)處理。(d)發(fā)線針的制作：取長約1.5cm的頭發(fā)絲一根和長約10cm的小金屬棒一根，以頭發(fā)絲長度的一半緊貼在金屬棒的一端，用細(xì)棉線將其纏緊，然后粘上加拿大樹脂或油漆，晾干，即得。沙門菌的檢驗(yàn)方法(a)取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份100m1，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對照菌液作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)18?24小時(shí)，陰性對照應(yīng)無菌生長。取其余2份培養(yǎng)物各1ml,分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基10ml中，培養(yǎng)18?24小時(shí)。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂(或沙門、志賀菌屬瓊脂)培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂)培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18?24小時(shí)或延至40?48小時(shí)。當(dāng)陽性對照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時(shí)，供試品的平板無菌落生長，或有菌落但不同于表2所列特征時(shí)，可判為未檢出沙門菌。(b)如供試品平板生長的菌落特征有與表2所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，均應(yīng)挑選2?3個(gè)菌落分別接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面上，陽性對照同時(shí)接種該培養(yǎng)基，培養(yǎng)18?24小時(shí)后，陽性對照的斜