蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)四蛋白質(zhì)的沉淀作用和等電點(diǎn)測(cè)定蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。2.了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。3.了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。4.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。5.掌握測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的基本方法。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!【實(shí)驗(yàn)原理】

一、沉淀作用

在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋怼５鞍踪|(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為可逆的沉淀反應(yīng)和不可逆沉淀反應(yīng)兩類。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!

1.可逆沉淀作用：在發(fā)生沉淀作用時(shí)，雖然蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀析出，然而其分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)并沒發(fā)生明顯的改變，仍保持原有的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。如除去沉淀因素，蛋白質(zhì)可重新溶解在原來(lái)的溶劑中。因此，這種沉淀作用稱為可逆沉淀作用。屬于此類的有鹽析作用，低溫下丙酮、乙醇使蛋白質(zhì)沉淀的作用，以及利用等電點(diǎn)的沉淀。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!

（2）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：在蛋白質(zhì)溶液中加入適量丙酮或乙醇，蛋白質(zhì)分子的水化膜被破壞而沉淀。若及時(shí)將蛋白質(zhì)沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質(zhì)沉淀則可重新溶解于水中。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!

（1）重金屬鹽類:能與蛋白質(zhì)分子中的巰基等基團(tuán)結(jié)合，生成不溶物而沉淀。（2）生物堿試劑:與蛋白質(zhì)結(jié)合形成不溶物而沉淀。植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物稱為生物堿（或植物堿）。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。

蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!【實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器、試劑】

1.實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)（卵清蛋白）、酪蛋白2.實(shí)驗(yàn)儀器試管及試管架；刻度吸管；吸耳球、膠頭滴管、pH試紙蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!【實(shí)驗(yàn)步驟】1、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)（1）鹽析加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過(guò)濾，向?yàn)V液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!【實(shí)驗(yàn)步驟】（3）某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。（4）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：取一支試管，加入2mL蛋白質(zhì)溶液，再加入2mL95%乙醇。觀察沉淀的生成。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!b.振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8ml，然后在第2、3號(hào)管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!

⑵向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.3、4.7、3.5.觀察管溶液的混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。注：觀察時(shí)，用“＋”,“－”表示沉淀的多少。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!

（1）鹽析作用：用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的過(guò)程。在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質(zhì)分子的水化膜被剝奪；同時(shí)蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，因而破壞了蛋白質(zhì)溶膠的穩(wěn)定因素，使蛋白質(zhì)沉淀析出。但中性鹽并不破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，因此，若除去中性鹽或減低鹽的濃度，蛋白質(zhì)就會(huì)重新溶解。

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2.不可逆沉淀作用：一些物理化學(xué)因素往往會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，尤其是空間結(jié)構(gòu)破壞，因而失去其原來(lái)的性質(zhì)，這種蛋白質(zhì)沉淀不能再溶解于原來(lái)的溶劑中。重金屬鹽，生物堿試劑、過(guò)酸、過(guò)堿、加熱、震蕩、超聲波和有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉定。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!二、等電點(diǎn)蛋白質(zhì)和氨基酸一樣都是兩性電解質(zhì)。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值，可使蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈或末端攜帶不同的電荷；在某一pH時(shí)其分子中的正電荷與負(fù)電荷數(shù)目相等，即凈電荷為零，該pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度往往較低容易沉淀析出。本實(shí)驗(yàn)借助觀察在不同pH溶液中的溶解度以測(cè)定酪蛋白的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!3.實(shí)驗(yàn)試劑

pH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液；3%硝酸銀溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；飽和硫酸銨溶液；硫酸銨結(jié)晶粉末；0.1mol/L鹽酸溶液；0.1mol/L氫氧化鈉溶液；0.05mol/L碳酸鈉溶液；0.1mol/L醋酸溶液；甲基紅溶液；0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液；醋酸溶液（mol/L）：1.0,0.1,0.01。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!

【實(shí)驗(yàn)步驟】（2）重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1～2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!

【實(shí)驗(yàn)步驟】（5）乙醇引起的變性與沉淀a.取3支試管編號(hào)，依下表順序加入試劑。蛋白質(zhì)沉淀與等電點(diǎn)共19頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!【實(shí)驗(yàn)步驟】2、酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定⑴取同樣規(guī)格的使館4支，按照下表順序分別精確加入各試劑，然后混勻。