疾病相關(guān)SHP2突變體的相分離是MAPK過(guò)度活化的基礎(chǔ)

疾病相關(guān)SHP2突變體的相分離是MAPK過(guò)度活化的基礎(chǔ)導(dǎo)讀非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）SHP2是由PTPN11編碼的，在正常發(fā)育RAS-有絲分裂原-活化的蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中發(fā)揮重要的作用。令人費(fèi)解的是PTPN11酶活化和失活的突變體為什么能夠?qū)е戮哂兄丿B臨床表現(xiàn)的人類發(fā)育紊亂。在本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)一種常見(jiàn)的、在這些疾病相關(guān)的SHP2突變體中共有的液-液相分離（LLPS）行為。SHP2LLPS是由保守的、折疊良好的PTP結(jié)構(gòu)域通過(guò)多價(jià)電子相互作用介導(dǎo)，并且通過(guò)構(gòu)象的改變由一種內(nèi)在的自體抑制機(jī)制調(diào)節(jié)。SHP2變構(gòu)抑制劑能夠減弱SHP2突變體的LLPS，提高SHP2PTP的活性。此外，疾病相關(guān)SHP2突變體能夠招募和激活LLPS中的WTSHP2，促進(jìn)MAPK的活化。這些結(jié)果不僅暗示LLPS以一種功能獲得的方式參與SHP2相關(guān)人類疾病的發(fā)病機(jī)制，也提供證據(jù)說(shuō)明PTP受LLPS調(diào)節(jié)，LLPS可能作為治療的靶向。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)ClosedOpenClosedOSHP2-MutantOSHP2-WTOSHP2-MutantOSHP2-WT結(jié)果1疾病相關(guān)SHP2突變體在細(xì)胞中形成離散的點(diǎn)為了探究疾病相關(guān)突變體如何影響SHP2細(xì)胞內(nèi)的功能，研究者在KYSE520細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)了6個(gè)mEGFP標(biāo)記的SHP2突變體（1個(gè)WT,3個(gè)NS/JMML突變體，以及2個(gè)NS-ML突變體），該細(xì)胞系是一種依賴SHP2的食道癌細(xì)胞系。SHP2-mEGFP的表達(dá)水平與內(nèi)源性SHP2具有可比性。重要的是，活細(xì)胞熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)所有與疾病相關(guān)的SHP2突變體都形成了離散的斑點(diǎn)，而SHP2WT在整個(gè)細(xì)胞中明顯散布（圖1A）。高內(nèi)涵成像分析顯示疾病相關(guān)SHP2突變體不僅在數(shù)量上，在斑點(diǎn)的平均大小上也超過(guò)了SHP2（圖1B）。在SHP2突變體中斑點(diǎn)的數(shù)量與平均斑點(diǎn)大小相關(guān)。此外，在一些其他細(xì)胞系中，包括HEK293T,A549，以及HUVEC，利用mEGFP-或者mScarlet-標(biāo)記的SHP2進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中也觀察到相似的突變體特異的斑點(diǎn)形成。為了排除所觀察到的斑點(diǎn)形成可能是由于外源性SHP2表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度升高，研究者進(jìn)一步在SHP2敲除的HEK293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)了mEGFP-標(biāo)記的SHP2突變體和WT。SHP2-mEGFP蛋白的表達(dá)水平與親代HEK293T細(xì)胞中SHP2的表達(dá)水平相同。研究者再次觀察到SHP2突變體中形成斑點(diǎn)，而SHP2中沒(méi)有。值得主要的是，兩個(gè)癌細(xì)胞系H661和CCF-STTG1都分別含有一個(gè)內(nèi)源性NS相關(guān)的SHP2或者NS-ML相關(guān)的SHP2突變體，也出現(xiàn)了SHP2斑點(diǎn)，而含有兩個(gè)WTSHP2等位基因的KYSE520經(jīng)免疫熒光檢測(cè)只是偶爾有SHP2斑點(diǎn)。研究者進(jìn)一步在更多生理設(shè)置的條件下檢測(cè)了SHP2斑點(diǎn)的存在，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ptpn11小鼠源性的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)以及Ptpn11小鼠源性的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)中SHP2斑點(diǎn)的數(shù)量具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在WTMEFs或者M(jìn)SCs中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)(圖1C、D、E、F)。在分別含有一個(gè)SHP2或者一個(gè)SHP2突變體的NS病人口腔黏膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了大量SHP2斑點(diǎn)，但是在兩個(gè)健康的捐贈(zèng)者中卻沒(méi)有(圖1G、H)。這些結(jié)果清楚的說(shuō)明在細(xì)胞內(nèi)疾病相關(guān)SHP2突變體具有更高的斑點(diǎn)形成傾向。圖1.細(xì)胞內(nèi)疾病相關(guān)SHP2突變體形成斑點(diǎn)。(A)KYSE520細(xì)胞中SHP2以及SHP2-mEGFP的活細(xì)胞成像，標(biāo)尺為10mm；(B)SHP2以及SHP2-mEGFP斑點(diǎn)高內(nèi)涵數(shù)據(jù)定量，***p<0.001；(C)Ptpn11以及對(duì)照小鼠源系MEF細(xì)胞中SHP2免疫熒光成像，標(biāo)尺10mm；(D)對(duì)圖C結(jié)果進(jìn)行定量分析，***p<0.001；(E)Ptpn11以及對(duì)照小鼠源系MSCs細(xì)胞中SHP2免疫熒光成像，標(biāo)尺10mm；(F)對(duì)圖E結(jié)果進(jìn)行定量分析，***p<0.001；(G)兩個(gè)努南綜合征患者和兩個(gè)健康個(gè)體源系口腔黏膜上皮細(xì)胞中SHP2免疫熒光成像，標(biāo)尺10mm；(H)對(duì)圖G結(jié)果進(jìn)行定量分析，***p<0.001。細(xì)胞內(nèi)疾病相關(guān)SHP2突變體的斑點(diǎn)表現(xiàn)出液滴樣的特征LLPS已經(jīng)成為許多生物學(xué)過(guò)程中一種基礎(chǔ)的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究者評(píng)估了SHP2突變體斑點(diǎn)是否具有任意液滴樣特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NS/JMML和NS-MLSHP2突變體的確形成斑點(diǎn)，斑點(diǎn)能夠移動(dòng)并且一旦相遇就自發(fā)融合（圖2A）。光漂白（FRAP）后的熒光恢復(fù)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明一旦光漂白，SHP2-mEGFP突變體斑點(diǎn)的免疫熒光在幾分鐘內(nèi)就恢復(fù)（圖2B、2C）。為了證實(shí)內(nèi)源性SHP2突變體形成的斑點(diǎn)在活細(xì)胞中是否具有液滴樣的特征，研究者利用CRISPR-Cpf1對(duì)H661細(xì)胞中帶有mEGFP的內(nèi)源性SHP2突變體等位基因進(jìn)行標(biāo)記，隨后進(jìn)行單克隆擴(kuò)增并且通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。在加工H661細(xì)胞的SHP2-mEGFP中觀察到與親代H661細(xì)胞內(nèi)源性SHP2一樣的濃縮形成。在加工H661細(xì)胞中內(nèi)源標(biāo)記SHP2-mEGFP的斑點(diǎn)通過(guò)FRAP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)具有濃縮的流動(dòng)性（圖2D）。這些結(jié)果提示促進(jìn)斑點(diǎn)形成的NS/JMML和NS-MLSHP2突變體也表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的液滴樣行為。圖2.細(xì)胞中疾病相關(guān)SHP2突變體的斑點(diǎn)表現(xiàn)出液滴樣特征。（A）兩個(gè)SHP2-mEGFP斑點(diǎn)的融合，標(biāo)尺5mm；（B）KYSE520細(xì)胞中對(duì)SHP2E76K-mEGFP進(jìn)行FRAP實(shí)驗(yàn)的代表性圖像，標(biāo)尺5mm；（C）SHP2-mEGFP斑點(diǎn)的FRAP數(shù)據(jù)定量分析；（D）H661（SHP2N58S）細(xì)胞中對(duì)內(nèi)源性標(biāo)記SHP2-mEGFP進(jìn)行FRAP實(shí)驗(yàn)的代表性圖像，標(biāo)尺10mm。疾病相關(guān)SHP2突變體能夠促進(jìn)體外SHP2的LLPS研究者進(jìn)一步探究了體外SHP2是否具有相分離的能力。研究者準(zhǔn)備了重組WT和多個(gè)疾病相關(guān)的SHP2突變體蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于SHP2WT，NS/JMML和NS-ML突變體形成液滴的能力更強(qiáng)（圖3A、B）。顯著的是，SHP2突變體在體外形成液滴的潛能與細(xì)胞內(nèi)形成斑點(diǎn)的能力相關(guān)（圖3C）。SHP2突變體的液滴在一段時(shí)間內(nèi)傾向于結(jié)合（圖3D）。此外，F(xiàn)RAP實(shí)驗(yàn)說(shuō)明當(dāng)進(jìn)行光漂白實(shí)驗(yàn)時(shí)，SHP2-mEGFP突變體液滴中的熒光能夠有效的恢復(fù)（圖3E），進(jìn)一步證實(shí)SHP2突變體在體外進(jìn)行典型的LLPS。研究者通過(guò)進(jìn)行不同濃度SHP2突變體和氯化鈉的液滴形成實(shí)驗(yàn)建立了SHP2WT和兩個(gè)疾病相關(guān)突變體SHP2和SHP2的相圖。研究者觀察到在接近細(xì)胞內(nèi)生理鹽水濃度125mMNaCl存在時(shí)，SHP2和SHP2能夠從0.25-0.5mM開(kāi)始進(jìn)行LLPS，而SHP2WT的LLPS從2-4mM時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)（圖3F）。研究者隨后在多個(gè)細(xì)胞系中檢測(cè)了內(nèi)源性SHP2的蛋白濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)SHP2蛋白的濃度大約在0.3-0.4mM。假設(shè)SHP2突變發(fā)生在PTPN11的一個(gè)等位基因上，內(nèi)源性SHP2突變體的濃度（0.15-0.2mM）接近體外SHP2突變體LLPS所需要的臨界濃度（圖3F）。然而細(xì)胞內(nèi)SHP2WT的蛋白濃度低于體外SHP2WTLLPS所需要的臨界濃度。這一發(fā)現(xiàn)幫助解釋了為什么細(xì)胞內(nèi)SHP2突變體傾向于形成斑點(diǎn)，而SHP2WT并沒(méi)有（圖1A）?？傊@些結(jié)果說(shuō)明了體外細(xì)胞內(nèi)疾病相關(guān)SHP2突變體和SHP2WT差異的LLPS行為。MSJMMLMutationsSHP2MSHP2D61GSHP2E76AshP2E76KNS-MLMutations5HP2-E76K蕓s罡SHP2-RJ98LSHP2-WTP*al#ricon€sfllraliwiiM>

42105Q25Q12S??0000MSJMMLMutationsSHP2MSHP2D61GSHP2E76AshP2E76KNS-MLMutations5HP2-E76K蕓s罡SHP2-RJ98LSHP2-WTP*al#ricon€sfllraliwiiM>

42105Q25Q12S??0000ooooomHB畤痣珞*Jt1-3E^-CQUraitsEB-urazPrettinwftewiraKWii笈42105D2SQ12S闞i一肌體OO-U6儂00O好00O弛。。OO圖3.疾病相關(guān)SHP2突變體促進(jìn)體外SHP2的LLPS。（A）在10%（w/v）PEG335存在時(shí)，8mM重組SHP2以及SHP2-mEGFP蛋白液滴形成的代表圖像，標(biāo)尺5mm；（B）OD600對(duì)SHP2以及SHP2mutEGFP的液滴形成進(jìn)行量化，***p<0.001（C）SHP2以及SHP2細(xì)胞內(nèi)以及體外LLPS能力的相關(guān)性；（D）SHP2的融合，標(biāo)尺5mm；（E）對(duì)SHP2-mEGFP液滴的FRAP數(shù)據(jù)進(jìn)行定量；（F）濃度范圍在0.125-8mM的SHP2、SHP2以及SHP2蛋白在20mMTris（pH8.0）10%（w/v）PEG3350、以及50—500mMNaCl條件下的相圖，藍(lán)點(diǎn)表示沒(méi)有相分離，紅點(diǎn)表示相分離。不同條件下SHP2的LLPS能力用色條表示。從關(guān)閉到開(kāi)放的構(gòu)象轉(zhuǎn)變促進(jìn)了$皿2的LLPS之前對(duì)SHP2WT、NS/JMML突變體以及NS-ML突變體的結(jié)構(gòu)和生物物理分析發(fā)現(xiàn)，開(kāi)放構(gòu)象的傾向程度與N-SH2/PTP結(jié)構(gòu)域界面動(dòng)態(tài)和溶劑曝光增加、以及N-SH2/PTP結(jié)構(gòu)域間由于突變導(dǎo)致的相互作用減低相關(guān)（圖4A、B）。有趣的是，基于氫/氘交換的質(zhì)譜分析結(jié)果（H/DX-MS）對(duì)SHP2突變體的開(kāi)放狀態(tài)進(jìn)行量化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHP2突變體液滴形成LLPS的能力與它們開(kāi)放構(gòu)象的傾向相關(guān)，無(wú)論是NS/JMML還是NS-ML突變體（圖4C、D）。這一結(jié)果暗示從關(guān)閉到開(kāi)放構(gòu)象的轉(zhuǎn)變能力決定了SHP2LLPS的潛能。為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，研究者利用了SHP2變構(gòu)體抑制劑SHP099,該抑制劑能夠在SHP2自體抑制/關(guān)閉的構(gòu)象中穩(wěn)定SHP2（圖4E）。的確，單分子熒光能量共振轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（smFRET）說(shuō)明SHP2主要在開(kāi)放狀態(tài)存在，然而，添加SHP009后能夠戲劇性的重塑SHP2的構(gòu)象圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)閉的構(gòu)象（圖4F）。有趣的是，添加SHP009能夠以劑量依賴的方式顯著減弱SHP2突變體的液滴形成（圖4G、H）。與此一致的是，SHP009處理也能減弱細(xì)胞中SHP2突變體斑點(diǎn)的形成（圖41、J）。此外，斑點(diǎn)降低的程度與SHP2抑制的程度相關(guān)，例如ET070,相較于SHP009具有更大的SHP2變構(gòu)抑制作用，對(duì)于體外SHP2突變體的LLPS具有更強(qiáng)的抑制作用（圖4G、H）,并且細(xì)胞內(nèi)的強(qiáng)度也大于SHP009（圖41、J）。研究者觀察到在Ptpn11MEFs中的SHP2和Ptpn11MSCs中的SHP2液滴的形成在ET070處理后明顯被抑制。相反，當(dāng)用刺激肽段2P-IRS-1處理時(shí)能夠促進(jìn)具有相對(duì)較弱LLPS能力的SHP2的液滴形成（圖4L、M），該刺激肽段包含bipTyr能夠與N-和C-SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使N-SH2結(jié)構(gòu)域和PTP結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用打開(kāi)（圖4K）。研究者接下來(lái)檢測(cè)了LLPS是否是SHP2的內(nèi)在特性以及開(kāi)放的構(gòu)象能否驅(qū)動(dòng)SHP2進(jìn)行LLPS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2P-IRS-1也能促進(jìn)體外SHP2凝結(jié)形成。顯著的是，用生長(zhǎng)因子例如bFGF以及EGF處理KYSE520細(xì)胞能夠誘導(dǎo)SHP2-mEGFP斑點(diǎn)的形成，表明當(dāng)關(guān)閉的構(gòu)象打開(kāi)時(shí)SHP2能夠進(jìn)行LLPS。NS/JMMLrmulalionsNS^MLmulatians.E76KQ5D6PItesY279CT468MR4&&LE76KSingleMolecdkfrFREISHPOM0-30l一口M5OM一S法CLOSEDO)占豆WKK--&SOMSONS/JMMLrmulalionsNS^MLmulatians.E76KQ5D6PItesY279CT468MR4&&LE76KSingleMolecdkfrFREISHPOM0-30l一口M5OM一S法CLOSEDO)占豆WKK--&SOMSO圖4.開(kāi)放構(gòu)象促進(jìn)SHP2的LLPS。（A）代表性的疾病相關(guān)SHP2突變體，NS/JMML突變體（藍(lán)色）以及NS-ML（綠色）；（B）代表SHP2和指定SHP2固有開(kāi)放構(gòu)象的體系；（C）體外LLPS能力與SHP2突變體開(kāi)放性的相關(guān)性；（D）在10%（w/v）PEG335存在下重組SHP2-mEGFP蛋白液滴的代表性成像，標(biāo)尺5mm；（E）圖示說(shuō)明變構(gòu)抑制劑SHP099將SHP2封鎖在一個(gè)關(guān)閉的構(gòu)象中；（F）單分子FRET結(jié)果展示SHP099導(dǎo)致SHP2E76A-87/266的構(gòu)象變化；（G和H）展示利用SHP099和ET070處理SHP2液滴，OD600測(cè)定液滴渾濁度的時(shí)間軌跡；（I和J）利用SHP099和ET070處理穩(wěn)定表達(dá)SHP2-mEGFP的KYSE520細(xì)胞，I圖對(duì)斑點(diǎn)/核進(jìn)行定量，J圖展示了SHP2-mEGFP的成像結(jié)果；（K）bis-P肽段與SHP2結(jié)合的卡通圖；（L）利用w/o有或無(wú)）1mMbis-P肽段處理SHP2蛋白，并且測(cè)定液滴的渾濁度，***p<0.001（M）DMSO或者1mMbis-P肽段處理SHP2液滴的成像結(jié)果，標(biāo)尺5mm。PTP結(jié)構(gòu)域能夠驅(qū)動(dòng)靜電相互作用介導(dǎo)的SHP2LLPS研究者接下來(lái)探究了SHP2相分離的分子基礎(chǔ)，與大多數(shù)進(jìn)行LLPS的蛋白不同，SHP2并不包含低復(fù)雜度的IDRs或者重復(fù)的多價(jià)模域。為了鑒定負(fù)責(zé)SHP2LLPS的結(jié)構(gòu)域，研究者準(zhǔn)備了重組全長(zhǎng)WTSHP2（FL-SHP2以及三個(gè)截?cái)囿wSHP2（SHP2DC,N/C-SH2,SHP2-PTR）圖5A）。值得注意的是，相對(duì)于FL-SHP2和其他突變體，催化的PTP結(jié)構(gòu)域LLPS的能力更強(qiáng)（圖5B、C）。通過(guò)融合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHP2-PTP的液滴發(fā)生融合。有趣的是，變構(gòu)抑制劑SHP009能夠有效的減弱全長(zhǎng)SHP2突變體的LLPS，但是不影響SHP2-PTP的液滴形成。因?yàn)镻TP結(jié)構(gòu)域的表面包含一些負(fù)向和正向的補(bǔ)丁，研究者接下來(lái)檢測(cè)了靜電相互作用是否參與調(diào)節(jié)SHP2LLPS。的確，SHP2-PTP的液滴形成對(duì)NaCl濃度升高高度敏感（圖5D）。為了進(jìn)一步查明調(diào)節(jié)SHP2-PTPLLPS的關(guān)鍵電荷補(bǔ)丁，研究者構(gòu)建了分布在SHP2-PTP表面不同電荷補(bǔ)丁的17個(gè)SHP2突變體，包括16個(gè)雙突變和1個(gè)單突變。研究者發(fā)現(xiàn)6個(gè)突變體（R362E/K364E,E523K/D437K,E447K/E481K,E441K/D437K,E447K/D451K,區(qū)能夠顯著降低SHP2-PTP液滴形成。其中E523/D437,E447/E481,E441/D437,E447/D4突變體分布在兩個(gè)負(fù)電荷的補(bǔ)?。∟CPs）上，而R362/K364以及R265坐落在兩個(gè)正電荷的補(bǔ)?。≒CPs）上。這些結(jié)果表明SHP2-PTP蛋白表面的多個(gè)NCPs和PCPs調(diào)節(jié)SHP2-PTPLLPS分子間靜電相互作用。不同電荷的補(bǔ)丁中，包含R362/K364的補(bǔ)丁可能發(fā)揮主導(dǎo)作用，因?yàn)镽362E/K364E突變體在不干擾整體結(jié)構(gòu)或者PTP活性的情況下能夠消除SHP2-PTPLLPS的能力（圖5E、F）。重要的是，引入疾病相關(guān)SHP2突變體，R362E/K364E突變體能夠整體地消除細(xì)胞內(nèi)不同SHP2突變體的斑點(diǎn)形成（圖5G）。

圖5.PTP結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)靜電相互作用介導(dǎo)的SHP2LLPS。(A)全長(zhǎng)圖5.PTP結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)靜電相互作用介導(dǎo)的SHP2LLPS。(A)全長(zhǎng)SHP2以及截?cái)囿wSHP2(SHP24C,N/C-SH2以及SHP2-PTP)cFOOMQS適丑mwdE口的圖示；(B)在10%(w/v)PEG3350存在時(shí)8mMFL-SHP2、SHP24C、SHP2-PTP、N/C-SH2的代表性成像，標(biāo)尺5mm；(C)在LLPS緩沖液(10%(w/v)PEG3350)中對(duì)8mMFL-SHP2、SHP24C、SHP2-PTP、N/C-SH2液滴濁度的定量，***p<0.001；(D)在指定濃度NaCl中SHP2-PTP形成液滴的代表性成像，標(biāo)尺5mm；(E)圖示說(shuō)明R362E/K364E突變體在SHP2-PTP(PDB:4DGP)表面將正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷；(F)PTP和PTPR362E/K364E微鏡圖像，標(biāo)尺為5mm；(G)KYSE520細(xì)胞中特定突變體SHP2-mEGFP的顯微成像，標(biāo)尺為10mm。LLPS刺激SHP2PTP活性，對(duì)于SHP2突變體誘導(dǎo)的ERK1/2過(guò)度活化是必不可少的SHP2是RAS-MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵的正向調(diào)節(jié)因子。由PTPN11突變體導(dǎo)致的NS和NS-ML綜合征屬于一個(gè)新分類的常染色體顯性綜合征家族，被稱為“RASopathies”。研究者發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的NS和NSML突變體SHP2,而不是SHP2能夠提高M(jìn)EK1/2和ERK1/2的磷酸化水平(圖6A)。值得注意的是，盡管LLPS缺陷的R362E/K364E突變體對(duì)SHP2PTP活性沒(méi)有影響，它們能夠減弱疾病相關(guān)SHP2突變體誘導(dǎo)的ERK1/2活化(圖6B、C)，表明疾病相關(guān)SHP2突變體的LLPS對(duì)于ERK1/2的過(guò)度活化是至關(guān)重要的。考慮到LLPS能夠在凝結(jié)物中局部濃縮分子加速反應(yīng)，研究者接下來(lái)檢測(cè)了LLPS是否能夠促進(jìn)SHP2的PTP活性。的確，酶學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在LLPS條件下SHP2突變體的液滴表現(xiàn)出更穩(wěn)健的PTP活性，相較于對(duì)應(yīng)突變體在溶劑條件下(圖6D)。DiFMUP去磷酸化的產(chǎn)物(DiFMU)，是SHP2體外合成的底物，在SHP2液滴中濃縮(圖6E)，提示在相分離的凝集物中SHP2PTP活性升高。圖6.LLPS刺激SHP2PTP的活性并且在SHP2突變體誘導(dǎo)的ERK過(guò)度活化中必不可少。（A）對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)SHP2以及SHP2HEK293T細(xì)胞中指定蛋白進(jìn)行免疫印跡；（B）對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)指定SHP2突變體HEK293T細(xì)胞中指定蛋白進(jìn)行免疫印跡；（C）對(duì)B中pERK/ERK水平進(jìn)行光密度檢測(cè)，*p<0.05;**p<0.01（D）在LLPS條件下，以對(duì)硝基苯磷酸鹽（pNPP）為底物的溶液中SHP2以及SHP2的磷酸化活性檢測(cè)；（E）DiFMUP底物中SHP2的液滴圖像。標(biāo)尺為5mm。NS-MLSHP2突變體的LLPS招募并且活化SHP2促進(jìn)ERK1/2的活化如圖6D所示，LLPS導(dǎo)致NS-ML突變體中的PTP活性升高，但是仍然弱于SHP2，并不能提供證據(jù)證明MAPK信號(hào)通路是通過(guò)NS-MLSHP2突變體活化的（圖6A、B）。考慮到NSML患者是基因雜合突變體的攜帶者，研究者接下來(lái)探究了NS-ML突變體SHP2表達(dá)的細(xì)胞中SHP2WT等位基因是否促進(jìn)ERK1/2的過(guò)度活化。研究者在HEK293T細(xì)胞中以1:1的比例轉(zhuǎn)染SHP2和SHP2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pERK1/2的水平明顯高于只有等量SHP2或者SHP2表達(dá)的細(xì)胞（圖7A）。有趣的是，WT和NS-MLSHP2的比例很重要，因?yàn)樵谟H代HEK293T或者SHP2KOHEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染時(shí)SHP2和SHP2的水平大約相等時(shí)ERK1/2最大程度的活化（圖7B、C）。此外，研究者構(gòu)建了Tet誘導(dǎo)的SHP2-mEGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)的KYSE520細(xì)胞系，并且用不同濃度的多西環(huán)素對(duì)SHP2-mEGFP的表達(dá)進(jìn)行滴定。當(dāng)SHP2-mEGFP的表達(dá)水平與內(nèi)源性SHP2相同時(shí)，pERK1/2的水平到達(dá)高點(diǎn)。這些結(jié)果表明WT和NS-ML突變體SHP2之間的相互作用是ERK1/2過(guò)度活化機(jī)制的基礎(chǔ)，正如敲入動(dòng)物模型和NS-ML患者特異的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（iPSCs）中報(bào)道的一樣NS-MLSHP2突變體能夠過(guò)度活化RAS-MAPK。研究者隨后探究了NS-ML突變體SHP2是否能夠形成凝集物招募SHP2并且促進(jìn)ERK1/2的活化。研究者的確觀察到在SHP2自身不足以形成液滴的條件下，SHP2已經(jīng)被分布到NS-ML突變體SHP2液滴中（圖7D）。盡管與單獨(dú)的突變體SHP2相比，WT/突變體SHP2混合物整體的液滴形成能力折中，顯著的一部分SHP2s在突變體SHP2液滴中富集。在光漂白后SHP2迅速恢復(fù)。值得注意的是，相較于每個(gè)蛋白的液滴，包含WT和NS-ML突變體SHP2混合物的液滴具有更強(qiáng)的PTP活性（圖7E）。研究者進(jìn)一步檢測(cè)了SH