6FCM定量細胞參量和熒光探針修改課件

6FCM定量細胞參量和熒光探針修改51、沒有哪個社會可以制訂一部永遠適用的憲法，甚至一條永遠適用的法律?！莒尺d52、法律源于人的自衛(wèi)本能?！⒏袼鳡?3、人們通常會發(fā)現(xiàn)，法律就是這樣一種的網(wǎng)，觸犯法律的人，小的可以穿網(wǎng)而過，大的可以破網(wǎng)而出，只有中等的才會墜入網(wǎng)中。——申斯通54、法律就是法律它是一座雄偉的大夏，庇護著我們大家；它的每一塊磚石都壘在另一塊磚石上?！郀査谷A綏55、今天的法律未必明天仍是法律。——羅·伯頓6FCM定量細胞參量和熒光探針修改6FCM定量細胞參量和熒光探針修改51、沒有哪個社會可以制訂一部永遠適用的憲法，甚至一條永遠適用的法律?！莒尺d52、法律源于人的自衛(wèi)本能?！⒏袼鳡?3、人們通常會發(fā)現(xiàn)，法律就是這樣一種的網(wǎng)，觸犯法律的人，小的可以穿網(wǎng)而過，大的可以破網(wǎng)而出，只有中等的才會墜入網(wǎng)中。——申斯通54、法律就是法律它是一座雄偉的大夏，庇護著我們大家；它的每一塊磚石都壘在另一塊磚石上?！郀査谷A綏55、今天的法律未必明天仍是法律?！_·伯頓FCM定量細胞參量和熒光探針

河北省腫瘤研究所

左連富一、細胞參量能夠被FCM定量分析的細胞參量很多,人們把這些可供檢測的細胞參量分為內(nèi)部和外部參量,同時又將內(nèi)部與外部參量分為功能性和結(jié)構(gòu)性參量。(見表7)筆者認為,當前我國西部貧困農(nóng)村地區(qū)義務(wù)教育還存在不少亟待解決的問題,概括起來主要有四方面。輟學(xué)現(xiàn)象仍然存在雖然各級政府、教育行政部門、學(xué)校,校長、教師做了大量工作,通過各種方法和手段,適齡兒童和少年基本上都能夠入學(xué),但入學(xué)后的輟學(xué)現(xiàn)象仍然存在。產(chǎn)生輟學(xué)現(xiàn)象的原因主要有四個。學(xué)生入學(xué)的思想基礎(chǔ)本來就不是很堅實的,許多學(xué)生入學(xué)是由于父母的意愿才進學(xué)校的。學(xué)生和家長對上學(xué)的目的和“前途”認識不足、缺乏信心。許多學(xué)生家長和個別的老師,把接受義務(wù)教育和考大學(xué)必然地聯(lián)系在一起,而對考大學(xué),許多家長對考的過程和考上后的結(jié)果,又都缺乏信心。外界的誘因使得許多學(xué)生過早步入了社會,開始了他們的謀生和為父母掙錢的生涯。這種現(xiàn)象在我國西部貧困農(nóng)村地區(qū)是非常普遍的。盡管黨和政府三令五申,用人單位不得使用童工,但每年從西部貧困農(nóng)村地區(qū)尤其是貧困農(nóng)村地區(qū)學(xué)校走出去而進入工廠的,卻有許多的童工。早婚現(xiàn)象是學(xué)生輟學(xué)的另外一個現(xiàn)實的原因。早婚現(xiàn)象在西部貧困農(nóng)村地區(qū)是非常普遍的,這種現(xiàn)象和陋習(xí)愈演愈烈。家庭情況好的,早點給孩子說親結(jié)婚,以便早點完成家長的任務(wù);家庭情況差的,那就讓孩子出去打工,早點掙錢娶媳婦。有的學(xué)生家長忙于農(nóng)活或經(jīng)商,對子女的學(xué)習(xí)無暇過問或根本就不過問;有的父母外出打工,照顧不了孩子。而孩子離開家長,一切由自己做主,再加上受社會上一些消極因素的影響,不思進取混日子,久而久之,就發(fā)展為逃學(xué)了。對《義務(wù)教育法》的意識比較淡薄盡管在動員適齡兒童入學(xué)和控制輟學(xué)率上,各級政府和學(xué)校以及教師都做了大量的工作,但做工作和被做工作的對象的《義務(wù)教育法》意識都是非常淡薄的。這種現(xiàn)象主要表現(xiàn)為四個方面。各級政府對《義務(wù)教育法》的意識比較淡薄。一方面,鄉(xiāng)村一級政府和組織很少宣傳《義務(wù)教育法》,對《義務(wù)教育法》的宣傳沒有責(zé)任感和義務(wù)感;另一方面,各級政府和組織以及相關(guān)工作人員出現(xiàn)違反《義務(wù)教育法》的現(xiàn)象,這種現(xiàn)象在我國西部貧困農(nóng)村地區(qū)是很常見的。學(xué)校依法“控輟”的工作做得不夠,甚至學(xué)校自身也出現(xiàn)一些違反《義務(wù)教育法》的現(xiàn)象。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn),學(xué)校在“控輟”工作中,盡管做了大量的工作,但好多工作并沒有運用《義務(wù)教育法》這個法律的武器來做,而運用最多的是一些其他方法,因此,工作的力度就顯得不夠。學(xué)生家長對《義務(wù)教育法》的意識非常淡薄。學(xué)生家長對《義務(wù)教育法》的意識淡薄主要表現(xiàn)在兩個方面:一是他們對自己的孩子或監(jiān)護人依法接受義務(wù)教育的責(zé)任沒有認識,甚至蠻橫地剝奪孩子接受義務(wù)教育的權(quán)利;二是他們不知道利用《義務(wù)教育法》維護孩子接受義務(wù)教育的權(quán)利。對于諸如學(xué)生隨意輟學(xué)打工、學(xué)校隨意開除學(xué)生等許多違反《義務(wù)教育法》的現(xiàn)象,很少有組織和個人來干預(yù)。教育教學(xué)質(zhì)量、效率較低在我國西部貧困農(nóng)村地區(qū),中小學(xué)教師整體素質(zhì)偏低。一方面,圖書資料匱乏,信息閉塞,教師繼續(xù)教育效率低下,教學(xué)任務(wù)繁重,再加上自己疏于學(xué)習(xí),影響到教師自身素質(zhì)的提高。因此,表現(xiàn)為教師知識結(jié)構(gòu)老化,視野狹窄,理論素養(yǎng)貧乏,教育觀念陳舊。農(nóng)村中小學(xué)因各方面條件相對較差,生活艱苦,比較難吸引高學(xué)歷、高水平的教師去工作,師資隊伍素質(zhì)不高的問題也較突出。許多教師把現(xiàn)在正在進行的基礎(chǔ)教育課程改革認為是搞運動,走形式,在自己的教學(xué)實踐中基本不使用新課程的理念,仍然使用陳舊的評價理念和方法。教師數(shù)量不足,分布不合理我國西部貧困農(nóng)村地區(qū)中小學(xué)教師隊伍數(shù)量嚴重不足,同時,學(xué)科不配套,結(jié)構(gòu)不合理。在教師非常缺的情況下,師范畢業(yè)生就業(yè)卻出現(xiàn)困難。當然,“自主擇業(yè),不包分配”是一個大趨勢,但這也給我國西部貧困農(nóng)村地區(qū)的教師資源帶來了許多困難。另一方面,教師的分布非常不合理,往縣城扎堆的現(xiàn)象非常突出。剛畢業(yè)的學(xué)生想辦法留縣城,已經(jīng)上班的教師也想盡辦法往縣城調(diào)。這樣,縣城學(xué)校的教師數(shù)量和偏遠鄉(xiāng)鎮(zhèn)學(xué)校的教師在數(shù)量上就產(chǎn)生了很大差距。1多維發(fā)展，確立教育目標新體系體育與健康課的教學(xué)應(yīng)以提高學(xué)生的身心健康水平為宗旨，與德、智、美等各育有機結(jié)合，促進學(xué)生身心全面發(fā)展。新課程確立的體育與健康課程目標體系，明確規(guī)定了以下課程總體標準：①增強體能，掌握和應(yīng)用基本的體育與健康知識和運動技能；②培養(yǎng)運動的興趣和愛好，形成堅持鍛煉的習(xí)慣；③具有良好的心理品質(zhì)，表現(xiàn)出人際交往的能力和合作精神；④提高對個人健康和群體健康的責(zé)任感，形成健康的生活方式；⑤發(fā)揚體育精神，形成積極進取、樂觀開朗的生活態(tài)度。這一目標體系避免了過去所用的套話、空話，顯得更加明確、具體，具有可操作性。就教學(xué)宗旨來看，體現(xiàn)了以學(xué)生運動技能培養(yǎng)為主的價值取向向?qū)W生身心和諧發(fā)展的多維價值取向的轉(zhuǎn)變。2多育并重，構(gòu)建教育內(nèi)容新體系新課程突破了以往以競技項目為主的內(nèi)容體系，從運動參與、運動技能、身體健康、心理健康、社會適應(yīng)等方面確立了課程內(nèi)容框架，從而極大地拓寬了體育課程的內(nèi)容范疇。因此，選擇新課程教學(xué)內(nèi)容，要樹立“大體育”觀念，既考慮體育與健康課本身的教學(xué)內(nèi)容，又思考體育與健康同各種教育因素的有效銜接，從“動育、心育、食育、性育、勞育”等方面整體謀劃，科學(xué)設(shè)計?！皠佑保催\動技能教育。包含著對學(xué)生運動興趣、愛好、習(xí)慣、體育道德的培養(yǎng)和運動技術(shù)水平的訓(xùn)練，是體育與健康課的主體內(nèi)容；“心育”，即心理健康教育。實施體育與健康教育的整合是對體育認識的一次飛躍，心理健康教育肩負著學(xué)生健康知識的培養(yǎng)，健康生活方式和樂觀、進取、開朗、豁達的心態(tài)的形成等重要任務(wù)；“食育”，即飲食科學(xué)教育。人體的許多疾病都是“吃”出來的，關(guān)注學(xué)生的身體健康必須從關(guān)注飲食開始，因此，提高學(xué)生的食品衛(wèi)生和安全意識，培養(yǎng)科學(xué)的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)知識和飲食習(xí)慣，是體育與健康課的基本內(nèi)容；“性育”，即性知識教育。初中階段，正值學(xué)生生理發(fā)育成熟時期，加強青春期衛(wèi)生知識教育，讓學(xué)生掌握性科學(xué)，打破性神秘，既是衛(wèi)生教育的重要內(nèi)容，也是健康教育的重要組成部分；“勞育”，即勞動教育。它既是一門專門的課程，同時也是體育與健康的重要組成部門，通過組織學(xué)生參加社區(qū)服務(wù)勞動或自我服務(wù)性勞動，可以達到以勞健體、以勞益心的目的，對于增強學(xué)生體能，培養(yǎng)學(xué)生正確的勞動觀點和勞動態(tài)度都具有重要作用。3多方結(jié)合，創(chuàng)新教育途徑新體系新課程改革為體育與健康教育的實施開辟了更為廣闊的空間。在堅持以課堂教學(xué)為主渠道的前提下，加強體育與健康課教學(xué)與教育諸方面的有機結(jié)合，創(chuàng)新教育途徑，是實施新課程背景下，實現(xiàn)體育與健康教育目標的必然要求。①堅持課堂教學(xué)與課外實踐有機結(jié)合。課堂是學(xué)科教學(xué)的主陣地，必須將改革體育課與健康課堂教學(xué)作為實施體育與健康教育的中心環(huán)節(jié)；必須將各種課外實踐活動作為有益補充，通過開展各種形式的課外（趣味）體育活動、心理咨詢活動、競賽活動，為培養(yǎng)學(xué)生健康知識和參與體育活動的興趣、習(xí)慣和技能構(gòu)建有效載體。②堅持課標的規(guī)定性與內(nèi)容的選擇性的有機結(jié)合。新課程標準只規(guī)定了學(xué)生身心發(fā)展標準，而沒有規(guī)定具體的教學(xué)內(nèi)容，給學(xué)校和教師留有很大的選擇余地。③堅持體育與健康教育與教育諸方面內(nèi)容有機結(jié)合。將體育與健康教育滲透到教育過程的各個方面，既可以增強體育與健康教育的實效性，又有利于以體育德、以體增智、以體強身，以體益美，促進學(xué)生德智體美和諧發(fā)展。④堅持課程選擇與課程開發(fā)相結(jié)合。體育與健康教育涉及了廣泛的教育內(nèi)容，結(jié)合課堂教學(xué)內(nèi)容的選擇實施校本課程開發(fā)，有利于提高教學(xué)的針對性。⑤堅持學(xué)校、家庭與社區(qū)教育有機結(jié)合。4多元檢測，建立教育評價新體系科學(xué)的課程評價既是實施體育與健康課程的推動力，是調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)主動性和積極性的重要手段。①評價指標多元化。根據(jù)知識與技能、過程與方法及情感態(tài)度與價值觀的總體目標要求，建構(gòu)切合實際的評價量標體系，使評價不但關(guān)注學(xué)生體能訓(xùn)練指標，還體現(xiàn)學(xué)習(xí)興趣、過程參與、體育文明、心理健康、競技成績等方面內(nèi)容。②評價方法多元化。學(xué)生體育與健康的檢測，要充分調(diào)動各方面的力量，以評價量標體系為依據(jù)，采用自評、互評、師評相結(jié)合的方法進行。③評價手段多元化。要運用傳統(tǒng)的測量手段，測量學(xué)生的競技成績，要采用精確的測量儀器（如：學(xué)生體質(zhì)與健康測量儀），準確測定學(xué)生的體能指標，要運用檔案袋評價法，作好過程性資料的收集和評價，使檢測手段趨于科學(xué)化和現(xiàn)代化，提高檢測的準確性；④評價結(jié)論多元化。評價結(jié)果的呈現(xiàn)，采用量化評價與定性描述相結(jié)合的方式，將評價結(jié)果記入學(xué)生畢業(yè)及升學(xué)考核范圍，更增強了評價的調(diào)控功能，對體育與健康課程目標的實施也起到了極大的推動作用。6FCM定量細胞參量和熒光探針修改51、沒有哪個社會可以制訂1FCM定量細胞參量和熒光探針

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左連富FCM定量細胞參量和熒光探針

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左連富2

一、細胞參量

能夠被FCM定量分析的細胞參量很多,人們把這些可供檢測的細胞參量分為內(nèi)部和外部參量,同時又將內(nèi)部與外部參量分為功能性和結(jié)構(gòu)性參量。(見表7)一、細胞參量3流式細胞術(shù)可測量的細胞參數(shù)主要測量參數(shù)分為結(jié)構(gòu)和功能兩部分

*結(jié)構(gòu)參數(shù)*功能參數(shù)

細胞大小與形態(tài)氧化還原酶狀態(tài)

胞核與漿比值表面電荷和膜電位

色素顆粒酶活性

亞細胞成分PH值，膜的流動性

DNA.RNA.蛋白質(zhì)含量線粒體膜電位

細胞表面抗原DNA的合成能力

鹼性蛋白細胞內(nèi)和膜受體

染色體結(jié)構(gòu)細胞漿和膜的鈣離子

細胞表面糖元等細胞凋亡等流式細胞術(shù)可測量的細胞參數(shù)4

二、定量細胞熒光染色原理定量細胞熒光染色,要求細胞成分染色的均勻性,保證染色做到染料分子數(shù)與被染的某種參量成一定量效關(guān)系,在流式定量分析中,掌握好熒光染色液的濃度非常重要,為了更好地說明這個問題,可以下式表示：F=Q(I-eεCL)F表示熒光強度I表示激發(fā)光強度Q表示光量子產(chǎn)額ε表示消光系數(shù)C表示染液濃度L表示溶液厚度當激發(fā)光增強時,熒光強度相應(yīng)按比例增加,當熒光強度達到1.0時,繼續(xù)增強光密度,熒光強度不會增加,還會造成結(jié)合到細胞上的熒光素發(fā)生猝熄現(xiàn)象,一個熒光分子發(fā)射的熒光有可能被鄰近的分子吸收猝熄,由于這種猝熄現(xiàn)象,如再增加熒光染液濃度也不會使熒光強度增大。二、定量細胞熒光染色原理51.熒光染色與細胞參量結(jié)合的方式⑴以共價鍵結(jié)合方式的熒光染色，使DNA鏈的連結(jié)之間以原子結(jié)合方式被打開，形成與熒光染料分子共價結(jié)合的方式，例如FITC、PE(藻紅素、藻青素、德州紅)這種熒光染料沖洗過多，易造成熒光分子丟失。⑵插入性或稱嵌入性結(jié)合方式，熒光染料分子直接嵌入到核酸堿基對之間，這種方式結(jié)合緊密、穩(wěn)固,不易造成熒光染料分子的丟失，如溴化乙啶(EB)、碘化丙啶(PI)、7-氨基放線菌素D(7-AAD)等。⑶結(jié)構(gòu)親合方式，以靜電力結(jié)合，帶有正電荷的熒光分子與帶有負電荷的核酸中的磷酸相互吸引而結(jié)合，這種方式結(jié)合極弱，常造成熒光分子的丟失，例如：丫啶橙與核酸單鏈結(jié)合時,派若寧與單鏈核酸結(jié)合系以靜電力方式。1.熒光染色與細胞參量結(jié)合的方式62.定量熒光染色的評價標準⑴特異性：所用熒光染料與所感興趣的細胞成分是否為特異性結(jié)合。⑵量效關(guān)系：在相同的條件下，熒光染料分子與研究的細胞成分的結(jié)合是否具有一定的量效關(guān)系。⑶熒光顯微鏡下觀察，熒光的分布是否具有一個核形態(tài)結(jié)構(gòu)，熒光分布是否均勻一致，并可看到一些熒光顆粒。⑷流式定量分析評價，(以DNA為例)，在DNA組方圖上，G0/l峰與G2M峰是否成倍數(shù)關(guān)系。⑸熒光染料分子被光激發(fā)后，熒光強度是否與光強度、消光系數(shù)、量子產(chǎn)額成正比。2.定量熒光染色的評價標準7三、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)參數(shù)的FCM檢測

1.細胞大小與形狀、顆粒性質(zhì):

流式細胞術(shù)對細胞大小和形狀的檢測，是最常見的功用，使用光散射可對不染色的細胞或染色細胞進行體積大小和形狀的分析。已有作者采用前向散射即小角散射(0.5-1.5°)與側(cè)向散射(90°散射)對全血細胞的體積大小分布進行了研究，得到各亞群的二維體積分布圖，側(cè)向散射并獲得一些細胞顆粒性質(zhì)的有用信息。有人用一個10μm標準微球作為體積大小的標準。作為計算各群細胞體積的實際大小。根據(jù)FCM定量細胞大小，也可對死活細胞進行鑒別。活細胞體積一般比死細胞體積大，有作者對凋亡細胞的研究發(fā)現(xiàn)，隨細胞凋亡過程的進展，細胞皺縮，乃致形成核小體時前向散射減小，側(cè)向散射也減小。掃描流式細胞儀可對細胞進行形狀和面積核漿比值，核的位置等多參量的分析?？商峁┘毎螒B(tài)多種信息供參考。三、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)參數(shù)的FCM檢測8

2.細胞自發(fā)熒光參量FCM檢測:

大部分哺乳類動物細胞內(nèi)的吡啶或黃素類核苷酸都存在自發(fā)熒光，可用紫外光激發(fā)出藍色熒光或用藍光激發(fā)出綠色熒光。許多研究人員應(yīng)用FCM進行了細胞自發(fā)熒光的探討。有作者用氫離子激光488nm進行激發(fā)，對小鼠的淋巴細胞的自發(fā)熒光進行了測量，其自發(fā)熒光量相當于10000個熒光素分子與抗體結(jié)合發(fā)出的平均熒光強度相似。研究發(fā)現(xiàn)中性白細胞有較高的自發(fā)熒光，嗜酸性白細胞的自發(fā)熒光光譜中核黃素相似。在1987年日本學(xué)者就利用FCM對胃粘膜細胞自發(fā)熒光進行了探索，發(fā)現(xiàn)早期胃癌細胞的自發(fā)熒光比正常胃細胞自發(fā)熒光強，由此用于早期胃癌的診斷。2.細胞自發(fā)熒光參量FCM檢測:9在人類細胞中的一些色素(如黑色素、脂褐素、血色素等)和一些氨類物質(zhì)以及植物細胞中起光合作用的葉綠素均可在適當光譜線的激發(fā)下，而產(chǎn)生自發(fā)熒光。還有一些禽類、鳥類、魚類的有核紅細胞，在醛類固定劑固定后，其細胞核DNA均可產(chǎn)生較強的自發(fā)熒光。文獻中已報道了雞紅細胞用戊二醛固定48小時后，經(jīng)488nm的激發(fā)光激發(fā)而產(chǎn)生較強的自發(fā)熒光(詳見“FCM標準樣品及其作用”一章)。在人類細胞中的一些色素(如黑色素、10

四、細胞的外部結(jié)構(gòu)參量FCM檢測

測量細胞外部結(jié)構(gòu)參量必須用熒光染色，在熒光標記后才能通過FCM的檢測，以獲得細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的信息，下面重點介紹一些細胞外部參量和常用的熒光探針。

㈠細胞DNA參數(shù)的熒光標記FCM定量研究的一個最早的參數(shù)是細胞DNA含量。因此，對于標記DNA分子的熒光探針發(fā)展也最快(見表8)。四、細胞的外部結(jié)構(gòu)參量FCM檢測

111.溴化乙啶(EB)和碘化丙啶(PI)熒光染色:

EB和PI這兩種熒光染料的理化特性類似，同屬于插入性熒光染料，可選擇性的定量嵌入核酸(DNARNA)雙螺旋的堿基之間，其熒光發(fā)射均為橙紅色，如果都使用氬離子激光488nm激發(fā)，EB發(fā)射出的熒光波長在603-610nm，PI發(fā)射光譜波長在610-620nm范圍。PI發(fā)射波長較EB長10nm，所以PI、EB這兩種染料可以相互替代。但PI的特點是熒光發(fā)射強度大，其CV值較小，PI的最佳濃度為50μg/ml，用量較大，價格較貴。EB的最佳濃度為10μg/ml，用量小，價廉。這兩種染料都不能通過活細胞膜進入細胞內(nèi)與核酸結(jié)合，因此，可以用于鑒別死活細胞。在染色活細胞時，要采用膜打孔方法，把染料引入細胞內(nèi)，或?qū)⒓毎潭ǎ硗?，這兩種染料可與雙鏈的RNA也產(chǎn)生結(jié)合，所以在染色細胞DNA時，要用RNA酶處理細胞，以排除RNA對定量DNA含量精度的干擾。1.溴化乙啶(EB)和碘化丙啶(PI)熒光染色:12下面分別介紹EB、PI染色程序⑴EB染色分一步染色法和兩步染色法：①EB一步熒光染色:EB染液配制:EB10mgNP-400.3ml(或Triton-x-1001.0%)枸緣酸鈉1000mg，NaCl564mg蒸餾水（二蒸水）1000mlRNasel0mg調(diào)pH7.2-7.6。將制備好的單細胞懸液固定劑棄之，用PBS(或生理鹽水)漂洗1-2次，取1×106/ml細胞加入EB染液，置4℃冰箱染半小時即可上機分析。下面分別介紹EB、PI染色程序13

②EB兩步染色：染液配制A液：

EB10mg，生理鹽水650ml，枸緣酸鈉1.0g，Rnasel0mg，NP-400.6ml(或Triton-x-1001.0%)加水至1000ml，調(diào)pH7.20。B液：枸緣酸鈉15mg，蔗糖90g，EB1.0mg，蒸餾水1000ml。

取1×106/ml細胞，棄去固定劑洗滌2次，加入A液1.0ml，在4℃20分鐘棄之，再加入B液1.0ml,在4℃冰箱染20分鐘，上機分析。②EB兩步染色：14⑵PI染液PI染液配制濃度為50ug/ml，染液配制和染色步驟染色方法也可分一步法和兩步法與EB相同。⑶EB、PI染細胞DNA鑒別死活細胞EB、PI是染DNA特異性熒光探針，由于其不透過活細胞完整細胞膜，只能進入細胞膜有損傷的細胞。因此對死細胞可以標記，而活細胞不著色，近年來將EB、PI染色用于細胞凋亡(Apoptosis)或程序性細胞死亡(ProgramcelldeathPCD)的研究中。鑒別死活細胞多用PI染色。PI染液配制:A.5ug/mlPI去污劑染液:PI0.5mg，枸櫞酸鈉l00mg，NaCl156mg,NP-400.03%(或Triton-x-1001.0%)，Rnase10ug/mlml，蒸餾水l00ml。B.50ug/mlPI染液:以PBS配制pH7.2⑵PI染液15染色步驟：取培養(yǎng)單細胞樣品1×106/ml，洗去培養(yǎng)液，先加入50μg/mlPI染液1.0ml，先使死細胞染色10分鐘后，PBS離心洗滌棄之，再加入5μg/mlPI去污劑染液1.0ml，染20分鐘即可上機分析。分析后收集細胞仍可繼續(xù)培養(yǎng)。若無需再作培養(yǎng)，加入5μg/mlPI染色前，可以先用70%乙醇固定后再染色，F(xiàn)CM分析組方圖顯示出亮熒光的死細胞峰和淡染活細胞峰。于是，可對兩群細胞定量分析和計算死、活細胞的比率。首先用50μg/ml的PI染色僅染死細胞，而活細胞不著色，后用5μg/mlPI去污劑染色液，可以在活細胞膜上打孔，將PI引入細胞內(nèi)，但不損傷細胞活性，F(xiàn)CM分析后，收集細胞可作繼續(xù)培養(yǎng)。染色步驟：取培養(yǎng)單細胞樣品1×10616

2.光神霉素(MI)、色霉素A3(CA3)和橄欖霉素:

光神霉素是一個抗腫瘤的抗生素?zé)晒馊玖?。色霉素A3和橄欖霉素是抗生素類熒光探針，這三種熒光探針在結(jié)構(gòu)和與DNA的結(jié)合特性是類似的。這些染料與鎂離子結(jié)合,形成復(fù)合物后,都以非嵌入的結(jié)合方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合。同時在標記細胞DNA成分時,不與RNA結(jié)合,因此在對DNA特異性定量染色時,不需要用RNase處理細胞。2.光神霉素(MI)、色霉素A3(CA3)和橄欖17Criss-man等對這三種染料的熒光染色進行了詳細的研究,他們發(fā)現(xiàn),對酒精和戊二醛固定的細胞DNA最優(yōu)化的染色濃度在50-100ug/ml，pH在5-9.0的范圍,NaCl的濃度在0.15-1.0M,鎂離子15-20mM(MI、CA3

和橄欖霉素與DNA結(jié)合需要鎂離子形成復(fù)合物)。這三種染料的激發(fā)峰的波長大約都在440nm左右，使用氬離子激光器的457nm，氦氖激光的441nm和汞燈436nm都可激發(fā)這三種染料。光神霉素被激發(fā)后的最大發(fā)射光波長約在575nm，色霉素A3最大發(fā)射波長約在555nm，橄欖霉素發(fā)射波長約在545nm，但有一亞發(fā)射波長在480-500nm，MI和CA3發(fā)射光譜卻沒有亞發(fā)射波長區(qū)。Criss-man等對這三種染料的183.DNA染色赫斯特類熒光染料：

赫斯特(HoechstHO)類是抗原蟲的藥物性熒光染料。與DNA特異性結(jié)合,包括有H033258、H033324、H033378H033662。這些HO類熒光染料均以非嵌入方式與DNA鏈的A-T堿基對結(jié)合，以紫外光激發(fā)，發(fā)出亮的藍色熒光。H033342和H033258是使用最多的探針，而H033342是研究活細胞DNA熒光標記特異性最好的活性染料，活細胞染色時，應(yīng)考慮到所染細胞是否存在抗藥性問題，如果有耐藥性，染色效果不佳。krishan等,H033342活染研究了一株抗阿霉素的白血病細胞，分析發(fā)現(xiàn)染色效果極差，可能由于活細胞的鈣離子泵通道開放，將染料泵出細胞外，因此，在染活細胞時，使用一些影響鈣泵的試劑。3.DNA染色赫斯特類熒光染料：19

H033342活染細胞常用濃度5-15μg,(或終濃度2-5μg/ml將染液直接加入培養(yǎng)基中。在37℃溫育。)染色60分鐘，由于H033342常受到一些細胞類型外排作用的干擾。所以用于研究DNA異質(zhì)性定量分析不適宜。H033258常與CA3結(jié)合用于流式核型的分析。由于H033258特異性地與DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的A-T堿基對結(jié)合。CA3

特異性地與堿基對G-C結(jié)合，因此可以利用H033258和CA3作堿基組成的熒光染色，用于流式核型分析，Livermore研究組首先發(fā)展了這項技術(shù)。1989年Dean等采用雙激光流式細胞儀，激發(fā)波長為紫外光351/364nm和藍色激發(fā)光為458nm，分析了人的淋巴母樣細胞株GMB的核型。VanDilla等還采用H033258和CA3對DNA不同堿基對的結(jié)合，鑒別不同的細菌種類，這將對于臨床治療是十分有用的。H033342活染細胞常用濃度5-15μg,(或終20

4.4,6-二脒基二苯基吲哚(DAPI)：這種熒光探劑與赫斯特類的特性相類似。Stohr等已首先將DAPI引入FCMDNA分析的熒光標記，DAPI與DNA呈非嵌入方式結(jié)合。與DNA堿基對A-T特異性結(jié)合，許多研究者認為，DAPI這個熒光染料比其他熒光染料所測組方圖的變異系數(shù)都小，尤其在石蠟包埋組織DNA檢測中，所測組方圖的質(zhì)量好于其他染料染色的DNA組方圖。DAPI染液配制，先以蒸餾水配制成1.0mg/ml的母液，放冰箱暗處保存，染色時用PBS液稀釋為50μg/ml,在室溫下染15-20分鐘即可上機分析。4.4,6-二脒基二苯基吲哚(DAPI)：21

5.7-氨基放線菌素D(7-ADD)：

Zelenin等首先將7-ADD作為FCMDNA熒光探針,主要以插入方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合。其激光波長約為580nm，最大發(fā)射波長為660nm，由于其發(fā)射波長較長，這個染料可與藻紅蛋白(PE)結(jié)合，用一個單一光譜488nm的激發(fā)光源激發(fā)定量DNA和免疫熒光的雙參數(shù)流式分析。5.7-氨基放線菌素D(7-ADD)：22

6.丫啶橙(AO)DNA/RNA熒光染色：

AO是一種用于定量細胞優(yōu)良的熒光探針，AO染色細胞后，在熒光顯微鏡下，可見清晰的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，DNA呈黃綠色熒光，RNA呈桔紅色熒光。AO常用于標記細胞DNA/RNA的雙參數(shù)FCM定量分析，AO與核酸的結(jié)合有兩種方式：

①強結(jié)合方式，又稱插入性結(jié)合方式，A0分子插入在雙鏈核酸的堿基之間，每有一個A0分子與DNA鏈結(jié)合，雙鏈結(jié)構(gòu)就發(fā)生26度的構(gòu)型旋轉(zhuǎn)變化。這樣就限制了A0分子的插入數(shù)目。每隔三個堿基插入一個A0分子。這種方式的結(jié)合，主要以AO與DNA的結(jié)合。6.丫啶橙(AO)DNA/RNA熒光染色：23

②弱結(jié)合方式，即靜電吸引結(jié)合方式，帶正電荷的A0分子與帶負電荷的磷酸根結(jié)合，每個磷酸根的位點上均可結(jié)合一個A0分子，最大結(jié)合率為1:1，結(jié)合在0位上的A0分子親合力最強，這種結(jié)合方式主要是A0分子與單鏈的RNA結(jié)合。如果用488nm的藍綠光激發(fā)AO與DNA結(jié)合的發(fā)射波長值在530nm為綠色熒光，與RNA結(jié)合發(fā)射波長為640nm，為紅色熒光。在DNA/RNA雙參數(shù)分析時，必須確保所在RNA在原位上形成單鏈，而DNA雙鏈結(jié)構(gòu)不發(fā)生變性。采取酸變性可達到這種目的，一般采用EDTA處理，使RNA解鏈，AO染色過程中，也可使沒有解鏈的RNA繼續(xù)解鏈，由于A0分子量大，在活細胞AO染色時，不易進入細胞內(nèi)，可用去污劑在細胞膜上打孔，使AO進入細胞內(nèi)。用0.04-0.07%Triton-x-100短時間處理細胞即可。②弱結(jié)合方式，即靜電吸引結(jié)合方式，帶24

AO染色固定細胞的程序如下：

Ⅰ、AO液的配制：①AO貯備液分析純的AO染料50mg，放入50ml的蒸餾水中，配制后放入4℃冰箱保存，可用4個月。②AO工作液取AO貯備液10:1用蒸餾水稀釋，再用Tris緩沖液(Tris50mM，氯化鉀25mM，氯化鎂5mM)將AO稀釋到8.5μg/ml的終濃度。染色步驟：取1×106/ml細胞，洗去固定劑，加入2mlAO工作液，在室溫(23℃)下染30分鐘上機分析。

AO染色固定細胞的程序如下：25

Ⅱ、AO染色活細胞的程序：

先配制A液和B液，A液：Triton-x-1000.1%，HCl0.08M，NaCl0.15M。B液：A06μg/ml，EDTA-Nal0－3M，NaCl0.15M。枸櫞酸鈉緩沖液(0.2MNa2HP04、0.1M枸櫞酸鈉)。

Ⅲ、B液配制：將0.2MNa2HP0463ml和0.1M枸櫞酸鈉37ml相混合，然后加入NaClEDTA-Na和AO染料。調(diào)pH6.0(注:不含AO的B液可在冰箱保存數(shù)月，但加入AO后，必須在24小時內(nèi)使用，不能保存日期過長)染色步驟:①取1×106/ml的培養(yǎng)細胞。②加入A液0.4ml混勻靜放半分鐘，立即加入B液1.6ml，染10分鐘上機分析，染色過程須在冰浴中進行。Ⅱ、AO染色活細胞的程序：26

7.新的DNA熒光探針TOT和YOY：

TOT和YOY是最新開發(fā)的熒光探針，美國LOSAlamos國家實驗室流式細胞研究組首先開展了這項工作。Hirons等首先于1994年報道了他們的最新研究結(jié)果，認為TOT和YOY是近年來發(fā)現(xiàn)的DNA熒光染色發(fā)光更亮的熒光探針，具有高的量子產(chǎn)額。TOT和YOY是花青苷類的兩個新的熒光染料。以插入方式與DNA結(jié)合，是否與堿基對有特異結(jié)合還不清楚，但是，熒光強度與DNA含量有關(guān)，與堿基構(gòu)成無關(guān)。TOT和YOY在溶液中與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光強度更加增強，比溴化乙啶的熒光強50倍，比光神霉素的熒光強1000多倍，DNA組方圖的峰更窄，其CV值比PI和MI還要小。7.新的DNA熒光探針TOT和YOY：27

Rye等已報道了TOT熒光染料結(jié)合與熒光發(fā)光強度之比(Fbound/Ffree)為1100，YOY的F/F之比為3200，TOT的猝滅系數(shù)為112，量子產(chǎn)額為0.34，YOY的猝滅系數(shù)為84，量子產(chǎn)額為0.52。TOT或YOY用于FCMDNA熒光標記，其激發(fā)光波長為488nm和457nm，熒光發(fā)射波長為530nm和510nm，單獨用于染色體流式核型分析，可用紫外線和488nm激發(fā)光。Hirons等用TOT和YOY對乙醇固定CHO細胞DNA染色和GM130細胞株的染色體分析，F(xiàn)CM均得到較好分析結(jié)果。認為TOT和YOY對染色體染色，流式核型分析的質(zhì)量與HO/CA3染色的核型分析相似。

Rye等已報道了TOT熒光染料結(jié)合與熒光發(fā)28

TOT和YOY的染色方法：

首先在DMSO中配制濃度為1mM的貯備液，避光保存在0℃。取細胞懸液1×106/ml，洗去70%酒精固定劑。PBS離心洗滌，加入RNase消化液(PBS配制含5Oug/ml)37℃消化1小時,加入濃度為4.0×10-6M的TOT或YOY染色液1ml,在4℃染色4個小時,過濾后上機分析。TOT和YOY用于流式核型分析染色方法為,制備好染色體懸液加入TOT染液,濃度為5.0×10-6M,YOY染液的濃度為5.0×10-6M,但染色至少18小時。TOT和YOY的染色方法：29

㈡定量RNA熒光染色

RNA在生物遺傳、發(fā)育、繁殖中具有重要作用，擔負著遺傳信息的翻譯、轉(zhuǎn)運、傳遞等重要功能，因此，對生物細胞RNA的定量分析，對了解細胞正常功能和病理狀態(tài)下的變化具有重要意義。在細胞周期中,對正常二倍體細胞的G0，G1期細胞的分析研究單獨定量DNA是無法將其區(qū)別，細胞生物學(xué)研究早已證實，在G1期細胞不進行RNA合成，只有在G0期進行RNA合成，因此通過RNA定量分析，便可區(qū)別G0，G1期細胞，并可揭示細胞增殖功能狀態(tài)。㈡定量RNA熒光染色30

下面介紹RNA熒光染色:

1.派若寧(Pyronin.PY)RNA熒光染色：

派若寧是一種堿性熒光染料，它可與細胞漿、核仁中的RNA進行特異性結(jié)合(RNA多為單鏈結(jié)構(gòu))經(jīng)藍綠色光激發(fā)發(fā)出紅熒光。PY作為FCMRNA單參數(shù)定量分析是一種極好的熒光探針，激發(fā)波長與488nm相匹配，它發(fā)射的熒光波長為580nm。派若寧也可與解鏈的DNA單鏈結(jié)合，因此在派若寧熒光染色定量RNA含量時，防止DNA解鏈效應(yīng)發(fā)生，以避免RNA定量不精確或采用DNA酶先消化掉DNA，所測熒光量就代表RNA的含量。下面介紹RNA熒光染色:31PY熒光染色方法:①配制PY母液，PY1.0g溶于100ml蒸餾水，置4℃冰箱保存。②PY工作液：取1.0ml母液加入1mol/L，Ph4.7的醋酸緩沖液到l00ml，稀釋為0.01%濃度(lmol/LPh4.7醋酸緩沖液的配制:冰醋酸11.55ml+蒸餾水1000ml。無水醋酸鈉16.4g+蒸餾水至1000ml。然后取冰醋酸液255ml十245ml醋酸鈉，再加入200ml蒸餾水即成)。③DNA酶消化液配制:DNA酶0.05mg/ml，0.25mol/L枸櫞酸，2.5mol/L氯化鎂,20mol/LTris-HCL調(diào)Ph為6.0④取1×106/ml細胞，加入0.5mlDNA酶消化液，37℃消化20分鐘，棄去DNA酶液，加入0.01%PY工作液1.0ml，室溫下染色30分鐘，PBS洗去染液，再加入1.0mlPBS上機檢測。PY熒光染色方法:32

2.丫啶橙(AO)RNA熒光染色：

AO是DNA/RNA熒光標記的優(yōu)良探針，當FCMDNA/RNA雙參數(shù)定量分析時，AO只需要單一激發(fā)光488nm，當進行RNA單參數(shù)定量分析，可先將細胞DNA用DNase消化處理，DNA熒光就消失了，再進行RNAAO熒光染色，這時所測熒光量僅為RNA含量，詳細染色方法，請參見DNA含量的AO染色。AO染色的缺點是對管道的污染嚴重。2.丫啶橙(AO)RNA熒光染色：33

3.甲基綠－派若寧Y對RNA熒光染色:

甲基綠－派若寧Y都是堿性熒光染料，甲基綠對細胞核DNA染色具有特異性，這可能由于甲基綠的兩個正離子根與DNA中陰離子的磷酸根相一致，而且兩個正負離子距離相等，甲基綠與DNA分子的結(jié)合遠強于派若寧Y，這主要與化學(xué)結(jié)構(gòu)式中-N基因有關(guān)，還有一個堿性更強的三羥銨鹵根，而派若寧Y中只有一個-N基團，因此派若寧Y競爭不過甲基綠與DNA分子的結(jié)合。還有人認為，DNA和RNA的聚合程度不同，DNA聚合程度高，甲基綠著色，RNA聚合度低與派若寧Y結(jié)合。

3.甲基綠－派若寧Y對RNA熒光染色:34

但DNA發(fā)生解鏈后便失去與甲基綠結(jié)合的能力，所以在染色過程中，須防止DNA解鏈效應(yīng)的發(fā)生，甲基綠-PY對RNA的定量熒光染色，主要依據(jù)其化學(xué)物理特性，甲基綠與DNA分子結(jié)合能力強，可以屏蔽派若寧Y與DNA分子的結(jié)合，而達到PY－RNA染色，對RNA單參數(shù)定量分析的目的。在甲基綠-PY染色RNA時，必須嚴格控制染液的PH值，根據(jù)實驗證明，當-pH值高時，PY不著色，只有pH值在4.7時，PY對RNA具有特異親合性，當pH值極低時，甲基綠不著色，就起不到屏蔽PY與DNA結(jié)合的作用，甲基綠的pH值在5-7時都有很好的穩(wěn)定性，與DNA分子具有很強的特異性結(jié)合能力。

但DNA發(fā)生解鏈后便失去與甲基綠結(jié)合的35甲基綠-PY染色方法：①甲基綠染液的配制，濃度0.01%，pH值5-7。取甲基綠0.01g+蒸餾水l00ml，甲基綠配制后，以純氯仿提純，由于甲基綠中混有甲基紫成分，在染色時，需將甲基紫洗去。方法為:將甲基綠溶解后，放入分液漏斗中，加等量的純氯仿洗，先充分搖蕩數(shù)分鐘，室溫下靜置，待該液分為兩層，棄去下層的紫色氯仿，按此方法反復(fù)洗5-6次，直到洗不下紫色為止。②PY染液配制見前。③取1×106/ml單細胞樣品，加入甲基綠0.5ml，室溫下染色30分鐘，PBS離心洗滌一次。然后加入PY0.5ml，室溫下染30分鐘，PBS離心洗一次，加入PBS1.0ml上機分析。甲基綠-PY染色方法：36

以上介紹的幾種RNA熒光探針各具優(yōu)缺點，AO雖是RNA定量分析的優(yōu)質(zhì)熒光染料，但其染色過程復(fù)雜，并對儀器管道污染嚴重。PY不足之處是其熒光量與RNA含量缺乏嚴格的量效關(guān)系。還有作者報道用HO/PY標記DNA/RNA熒光染色雖然具有重復(fù)性。染色過程簡單，不污染管道，但需要雙激發(fā)光源，儀器操作復(fù)雜。以上介紹的幾種RNA熒光探針各具37

4.噻唑橙(ThiazoIeorangeTO)

是網(wǎng)織紅細胞RNA熒光染色新探針，計數(shù)網(wǎng)織紅細胞對于評價骨髓紅系造血活性以及對貧血性疾病的治療療效評價具有重要意義。FCM已被引入定量分析網(wǎng)織紅細胞RNA和計數(shù)網(wǎng)織紅細胞。派若寧Y、花青苷類DIOCl(3)、丫啶橙和硫黃素T等熒光探針被用于FCM分析網(wǎng)織紅細胞RNA的熒光染色。雖然這些熒光探針所檢測的網(wǎng)織紅細胞計數(shù)與手工光鏡下計數(shù)有較好的相關(guān)性，但均存在不足之處，PYDIOCl(3)和AO與RNA結(jié)合缺乏嚴格的量效關(guān)系。硫黃素T(ThioflavinT)雖有較強的量效關(guān)系，但其量子產(chǎn)額較低，染色步驟較繁，并與染料結(jié)合達到飽和狀態(tài)才能獲得精確的結(jié)果。另外，流式組方圖常有抬高于基線的拖尾現(xiàn)象，使資料分析困難，計數(shù)不準確。

4.噻唑橙(ThiazoIeorangeTO)38

Lee等開發(fā)合成了新的熒光探針-噻唑橙(TO)，F(xiàn)CM分析用TO標記網(wǎng)織紅RNA明顯優(yōu)于其他染料，TO熒光發(fā)射強，光量子產(chǎn)額大，染色程序簡單，數(shù)據(jù)分析比PY和DIOCl(3)更簡單，TO與甲基蘭計數(shù)網(wǎng)織紅的相關(guān)更好，相關(guān)系數(shù)為0.97，TO染色計數(shù)網(wǎng)紅細胞更精確，優(yōu)于甲基蘭染色的人工計數(shù)，膜滲透性好，可以作為活性熒光染料。

TO染色具體方法：①用甲醇液配制lmg/mlTO儲備液。儲備液用PBS稀釋為1:1000，稀釋液放在暗處室溫下至少可用1周。②取全血5μl加入1mlTO稀釋液，室溫下染色1小時，上機分析，用藍綠色488nm激發(fā)，發(fā)射熒光為530nm。

Lee等開發(fā)合成了新的熒光探針-噻唑39

㈢蛋白質(zhì)含量熒光染色1.總蛋白質(zhì)含量的熒光標記：

定量細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量分布，可以揭示不同細胞群體，并可了解一個細胞群體的生長繁殖和代謝狀態(tài)。細胞總蛋白質(zhì)含量的流式檢測，其常用的熒光探針多為酸性熒光染料，蛋白質(zhì)的熒光染色受著酸性熒光染料離子化狀態(tài)和染色溶液pH值的影響，當pH值為堿性，堿性蛋白質(zhì)與酸性染料結(jié)合。當pH值降低時，細胞的總蛋白被染色。㈢蛋白質(zhì)含量熒光染色40

因此，F(xiàn)CM檢測細胞總蛋白含量常用的熒光染料為異硫氰酸熒光素(FluoresceinisothiocyanateFITC)。FITC是一種酸性熒光染料，以共價鍵結(jié)合方式與蛋白帶有正電荷的位點結(jié)合，以氬離子激光的488nm激發(fā)，發(fā)出亮綠色熒光，F(xiàn)ITC染色pH值多偏于中性，而避免染液偏堿性。先配制FITC的染液濃度為lmg/ml，在純酒精中制備成為貯備液，使用時用PBS(pH7.2-7.4)稀釋成所需工作液0.05μg/ml，在FCM的定量細胞蛋白質(zhì)含量時，往往是雙參數(shù)分析，多采用FITC/PI或FITC/DAPI雙染色。因此，F(xiàn)CM檢測細胞總蛋白含量常41

2.功能蛋白質(zhì)的熒光標記：

流式細胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要進展之一，特別是FCM與單克隆抗體技術(shù)的有機結(jié)合，極大地推動了免疫學(xué)的發(fā)展，使傳統(tǒng)免疫學(xué)提高到定量免疫研究水平。特別是各種熒光探針標記的單克隆抗體，為FCM研究各種細胞膜和細胞內(nèi)各種功能性抗原、腫瘤基因蛋白等發(fā)揮著重要的作用。下面將介紹流式免疫技術(shù)中常用的免疫熒光探針。2.功能蛋白質(zhì)的熒光標記：42

在流式免疫技術(shù)中，熒光探針是極為關(guān)鍵的,對熒光試劑使用尤其是具有一些特殊要求。①熒光染料必須應(yīng)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)。②熒光染料對某一激發(fā)光的波長有較強吸收。③激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間要有較大的波長差別，以便使熒光發(fā)射強度與激發(fā)光所造成背景區(qū)分開。④易于與被標記的抗原、抗體和其他一些生物分子物質(zhì)結(jié)合，又不影響被標物質(zhì)的特異性。

在流式免疫技術(shù)中，熒光探針是極為關(guān)鍵的,43

FITC是免疫熒光標記最常用的熒光探針，它的一些理化特性已在蛋白質(zhì)熒光染色一節(jié)中敘及。FITC易溶于水，很容易以共價鍵方式標記在抗原、抗體等生物分子物質(zhì)上，有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)，與488nm激發(fā)波長相匹配。是免疫熒光標記的優(yōu)良染料，但也有一些缺點，F(xiàn)ITC發(fā)射熒光強度受pH值的影響，當pH值低時，熒光減弱，另外，F(xiàn)ITC受激發(fā)射的光譜波長常受到末染色細胞本身自發(fā)熒光的干擾，所以在測量時，必須排除減去本底熒光。FITC是免疫熒光標記最常用的熒光44

FITC被廣泛用于標記各種特異性抗體，如抗蛋白類、脂蛋白、糖蛋白、多核苷酸、脂類等及其他生物分子和非生物分子(例如熒光塑料微球)，利用被熒光標記的生物分子可以檢測生物細胞結(jié)構(gòu)和功能的多種參數(shù)。例如細胞內(nèi)或表面抗原、受體，基因蛋白產(chǎn)物，以及熒光原位雜交(FilmresceneeinSituHybridism、FISH)DNA探針檢測技術(shù)，對染色體上原癌基團，結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的變異進行分析。利用熒光標記的特異生物分子方法，為活細胞、死細胞中各種抗原、受體、基因等物質(zhì)的研究提供強有力的手段。FITC被廣泛用于標記各種特異性抗體45

近年來，除了FITC作為常用的免疫熒光的探針外，又開發(fā)合成了很多新的免疫熒光的染料。最主要的新熒光探針是藻膽蛋白族(Familyofphycobiliproteins)，主要包括三種類型①藻紅蛋白(PhyloerythrinPE)②藻青蛋白(Phylocyanin.PC)③別藻青蛋白(Allornwhey.amim.APC),藻膽蛋白是來自于光合青藻和紅藻菌類的自然熒光色素。藻膽蛋白很適合標記各類抗體,由于它的分子結(jié)構(gòu)是幾個帶有開鏈四吡咯色基的多肽混合物。近年來，除了FITC作為常用的免疫熒46標記抗原抗體具有以下特點：①不同類別的藻膽蛋白可以在廣泛的激發(fā)光譜下被有效的激發(fā)，但其熒光發(fā)射波長變化不大。②由于藻膽蛋白分子具有許多發(fā)光色基因，它的消光系數(shù)和光量子產(chǎn)額很高。③激發(fā)光和發(fā)射光易區(qū)別，這由于藻膽蛋白的斯特科斯(Stokes)位移大。④它易溶于水，不受pH的影響，熒光不易發(fā)生淬熄現(xiàn)象;⑤與抗原、抗體及生物分子偶聯(lián)形成的標記物，不造成抗體活性的降低。雖然藻膽蛋臼被廣泛用于免疫熒光探劑，但也存在一些不足，由于其分子量較大，對細胞內(nèi)分子抗原、受體等不易標記，與標記物結(jié)合后易形成色素脫落，標記后保存時間短等，也影響其推廣應(yīng)用。標記抗原抗體具有以下特點：476FCM定量細胞參量和熒光探針修改課件48

在藻膽蛋白熒光探針家族中，常采用的免疫熒光標記是藻紅蛋白，在藻蛋白中R-PE最常用，但有作者研究發(fā)現(xiàn)，在488nm光譜的激發(fā)下，S-PE溶液的熒光發(fā)射強度比FITC強19倍，比R-PE溶液發(fā)射熒光強2倍。因此S-PE可以與FITC或PI等熒光染料同時作為雙參數(shù)標記的優(yōu)良熒光探針。流式細胞術(shù)可同時對一群生物細胞內(nèi)外的抗原物質(zhì)進行免疫熒光的雙參數(shù)或三參數(shù)標記的檢測，在進行免疫熒光雙標記或多參數(shù)標記時，應(yīng)考慮到免疫熒光染料與激發(fā)光源，以及熒光染料之間的相互組合的問題，以避免使用一種光源波長(如488nm)激發(fā)兩種染料不匹配或引起光譜范圍有大的交叉，產(chǎn)生能量的轉(zhuǎn)移。在藻膽蛋白熒光探針家族中，常采用的49

在進行雙參數(shù)免疫熒光檢測時，要符合如下要求：①在兩種以上免疫熒光染色時，該熒光染料可被單一激發(fā)，可通過特殊分光器將發(fā)射光譜區(qū)分開。②或用雙激發(fā)光，通過發(fā)射光譜的不同，或發(fā)射光與發(fā)射時間上的不同區(qū)分開。③要求熒光染料不致于干擾被標記抗體的特異性。在進行雙參數(shù)免疫熒光檢測時，要符合506FCM定量細胞參量和熒光探針修改課件51

表中的雙熒光標記組合，F(xiàn)ITC和TRITC是最早使用的一組雙標記組合，可以用單一激發(fā)波長(515nm)激發(fā),前者發(fā)綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光，但其光量子產(chǎn)額相差較大，(FITC遠比TRIT量子產(chǎn)額大)，并在發(fā)射光譜之間有交叉，易發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。FITC和TexasRed作雙標記，采用雙激發(fā)光源和分光濾片，可以減少兩熒光發(fā)射光譜交叉重疊的影響，目前最常用于免疫熒光雙標記是FITC和PE可用單一氬離子激光，488nm激發(fā)PE發(fā)出較強的橙紅色熒光。表中的雙熒光標記組合，F(xiàn)ITC和TR52流式細胞術(shù)的質(zhì)量控制和影響因素流式細胞術(shù)的質(zhì)量控制和影響因素53一、標本的采集和固定方法的質(zhì)量控制

標本采集是十分重要的環(huán)節(jié)，在標本的采集過程，需注意：①手術(shù)切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時，要避免出血壞死組織。②標本采集后要及時固定或深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA降解，而造成測試結(jié)果的誤差。③固定劑要采用對組織細胞穿透性強的濃度。一、標本的采集和固定方法的質(zhì)量控制54例如70%的乙醇固定比75%以上的濃度固定效果好，高濃度的乙醇常造成細胞表面快速形成一個蛋白膜，致使細胞內(nèi)的物質(zhì)固定不良，有作者分析研究了自溶對DNA測定的影響，發(fā)現(xiàn)自溶的組織細胞常出現(xiàn)假性異倍體，且不固定的組織細胞隨時間的延長，DNA含量呈梯度降低，根據(jù)檢測的目的，選擇什么類型的固定劑，對流式檢測質(zhì)量也有顯著的影響，例如細胞DNA的分析，使用醇類固定劑較好而不選擇醛類固定劑，醛類固定劑明顯影響細胞DNA熒光發(fā)射強度，實驗證明，醛類固定劑對插入性熒光染料與核酸的結(jié)合有很強的干擾作用，其熒光強度僅相當于新鮮組織熒光強度的50-70%左右。

例如70%的乙醇固定比75%以上的濃度固定效果好，高濃度的乙55如果作流式免疫研究工作，采用新鮮組織是最好的選擇，在不能及時檢測又沒有低溫保存條件時，要根據(jù)所測物質(zhì)在細胞內(nèi)還是在細胞膜表面，在膜表面的抗原物質(zhì)，以醛類固定劑為宜，盡管醛類固定劑產(chǎn)生的非特異性熒光較強，但不宜采用醇類固定劑，因醇類固定劑可使細胞表面的糖蛋白、脂蛋白脫落丟失，失去標記的位點。如所測抗原物質(zhì)在細胞內(nèi)，可以使用醇類固定劑，這種固定方法簡便易行，無需特殊低溫冷凍條件，在一般冰箱(0-4℃)放置即可，能很好的保持細胞形態(tài)和生物化學(xué)成分不發(fā)生變性。

如果作流式免疫研究工作，采用新鮮組織是最好的選擇，在不能及時56二、單細胞懸液制備的質(zhì)量控制人體的末梢血液和骨髓細胞及淋巴組織是人體組織中缺乏細胞間連結(jié)裝置的組織，尤其是血和骨髓細胞是天然的單分散細胞材料，其中的細胞成分在生理狀態(tài)下呈單分散狀態(tài)，它是流式分析最合適的樣品來源，全血中含有多種有形成分，流式細胞檢測是以某一群細胞為檢測對象，因此在檢測前須將所測的某群細胞成分分離出來，例如，以淋巴細胞DNA定量分析為例，就須把淋巴細胞分離出來，而將其他有核細胞或紅細胞去除，對于血小板的分析樣品制備過程中須防止過高離心速度造成血小板膜的損傷，出現(xiàn)血小板凝集。二、單細胞懸液制備的質(zhì)量控制57新鮮實體組織單細胞樣品的制備，實體組織是流式分析工作的主要材料來源，但對其分散單細胞樣品的技術(shù)和方法，仍存在著很多問題，仍需大量的探索工作，就目前，國內(nèi)外對實體組織分散單細胞還沒有找到一個適用的又通用方法，甚至同樣組織，用于不同的實驗?zāi)康?，就需要不同的方法處理，或者每一種組織就是一個單獨的問題，因此必須根據(jù)實際情況，去選擇合適有效的單分散方法，選用的方法必須達到細胞產(chǎn)量高，細胞損傷小的目標，但實際工作中達到這個目標是困難的，多年來對于實體組織的分散解聚多采用酶學(xué)法，化學(xué)法、機械物理方法以及低滲脫核方法等，根據(jù)各種組織的特點，以及實驗?zāi)康牡牟煌?，可選擇不同的方法。新鮮實體組織單細胞樣品的制備，實體組織是流式分析工作的主要材58①選則酶學(xué)方法時，應(yīng)注選擇使用酶類型的問題，含有大量結(jié)締組織的組織器官，選擇膠原酶好，不宜選擇胃蛋白酶或胰酶，并要注意酶的活性條件和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時間，pH值，濃度等方面對酶活性的影響，酶學(xué)方法分散組織都有一定的應(yīng)用限制，特別用于流式免疫熒光實驗時，酶處理可能改變或丟失膜的抗原成分，從而影響分析結(jié)果，由于酶學(xué)方法分散下來的細胞產(chǎn)量低，用組織較多，還要注意酶的純度，活性單位，以及生產(chǎn)廠家對酶的污染。①選則酶學(xué)方法時，應(yīng)注選擇使用酶類型的問題，含有大量結(jié)締組織59②化學(xué)方法，往往單獨應(yīng)用分散組織效果不理想，應(yīng)與酶學(xué)方法綜合使用，分散效果更佳。③機械方法，常采用剪碎，網(wǎng)搓研磨，細針抽吸等，對細胞損傷大，產(chǎn)生的細胞碎片多，細胞團塊多，在使用機械法時，要給于組織適當?shù)膲毫?，這種適當?shù)膲毫π枰休^多的制樣實踐經(jīng)驗技術(shù)人員來操作。④低滲方法，其溶液是一種低滲液體，造成細胞膜的破壞，使細胞核自行釋放出來，是一個裸核懸液樣品，本方法簡便，可以改變樣品的變異系數(shù)，但要避免脫核時間過長，造成核膨脹碎裂。②化學(xué)方法，往往單獨應(yīng)用分散組織效果不理想，應(yīng)與酶學(xué)方法綜合60

以上幾種方法是目前對實體組織解聚常用的方法，往往不是單用，常常是一種或二種方法的結(jié)合使用，總的來說，對實體組織分散為單細胞還存在很多困難，因此還需要深入探討流式樣品的制備技術(shù)，制備出完整細胞產(chǎn)量高，細胞損傷小的合格懸液,獲得更好的流式檢測結(jié)果。以上幾種方法是目前對實體組織解聚常用61三、石蠟包埋組織單細胞制備的質(zhì)量控制石蠟包埋組織標本的材料選擇，應(yīng)經(jīng)病理醫(yī)師仔細檢查，選取無自溶，壞死的組織對腫瘤組織標本，選取含腫瘤組織細胞豐富的區(qū)域，且經(jīng)病理形態(tài)或細胞學(xué)核實病理診斷。切取適當厚度的石蠟組織片，大量研究證明，切取40-50μm厚度的切片是適宜的，過厚的組織片消化費時，消化下來的細胞數(shù)少，過薄的切片可產(chǎn)生大量的細胞碎片，影響檢測結(jié)果，使腫瘤異倍體的檢出率減少，我們研究了石蠟切片不同厚度(5,10,20,30,40,50μm)對流式分析DNA影響發(fā)現(xiàn)較薄的切片造成碎片較多,噪音增加,組方圖的基線提高,影響倍體分析的精度。三、石蠟包埋組織單細胞制備的質(zhì)量控制62在組織脫蠟的過程中，一定將蠟脫凈，殘留的石蠟可，影響酶的消化活性，檢查是否將蠟脫凈的方法是棄去二甲苯(Hedley強調(diào)用Histoclear，即組織清洗劑代替二甲苯脫蠟，效果更好)，加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，示蠟已脫凈梯度酒精(100%９５％70%50%)水化要充分,使組織還原到與新鮮組織相似的狀態(tài)。消化酶液要掌握適當?shù)臐舛?、pH值、溫度等，不造成酶的活性降低為宜，消化時間很重要，時間短細胞消化不下來，時間長，消化下來的細胞又被破壞，在制備石蠟包埋單細胞時，常規(guī)使用0.5%胃蛋白酶PH1.5。在組織脫蠟的過程中，一定將蠟脫凈，殘留的石蠟可，影響酶的消化63石蠟包埋組織的單細胞制備方法的建立，使流式細胞術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中得到更廣泛的應(yīng)用，但仍存在一些問題有待進一步解決，主要存在問題如下：⑴樣品中的碎片較多，所測得的DNA組方圖質(zhì)量不及新鮮組織好，組方圖的峰位較寬CV值偏大。⑵異倍體率減少，由于組方圖細胞峰CV值較大，一些近于二倍體的DNA異倍體峰被掩蓋。⑶S期細胞百分比不如新鮮組織的S期計算精確，S期細胞的計算偏高，這仍然與CV值較大有關(guān)石蠟包埋組織的單細胞制備方法的建立，使流式細胞術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中64⑷DNA二倍體標準不穩(wěn)定，Schutter等發(fā)現(xiàn)用新鮮正常組織的二倍體細胞或者用其他生物細胞DNA含量(例如，雞紅細胞，鱒魚血細胞等)作為石蠟包埋組織細胞DNA含量的標準不適用，石蠟包埋組織比新鮮組織細胞DNA熒光強度低，且樣品間的熒光強度不穩(wěn)定，解決DNA二倍體標準不穩(wěn)定的辦法，可將正常組織與腫瘤組織作為一個內(nèi)標的二倍體標準參照，可減少DNA倍體分析的誤差，對存檔中的石蠟包埋組織材料，可以采用正常組織石蠟包埋標本，作為一個外參的二倍體標準，但要求采用的外參二倍體樣品和腫瘤樣品中加入內(nèi)標準樣品(例如雞血細胞等)。⑷DNA二倍體標準不穩(wěn)定，Schutter等發(fā)現(xiàn)用新鮮正常組65四、脫落細胞樣品的采集脫落細胞樣品的采集要保證足夠的細胞數(shù)，在臨床實際工作中，可以收集到大量自然脫落的細胞標本，這些細胞標本經(jīng)簡單處理后，即可得到較好的單分散細胞，例如胸腹水，內(nèi)鏡刷檢細胞，膀胱沖洗液等，這些材料得到的流式檢測結(jié)果，要小心謹慎的分析解釋，結(jié)果的生物學(xué)意義，因這些材料獲得前結(jié)果常出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，因其中的白細胞常有變性，且樣品細胞數(shù)量少，制備出一個合格的單細胞樣品，其細胞數(shù)要求在1×106/ml，其雜質(zhì)碎片團塊重疊細胞應(yīng)小于2%以下，否則應(yīng)放棄檢測，對腫瘤細胞DNA異倍體的分析樣品中，至少應(yīng)有20%的腫瘤細胞存在，(因占主峰1/5以上的異倍體峰才可確認為異倍體)。四、脫落細胞樣品的采集66五、細胞懸液熒光染色的質(zhì)量控制

單細胞懸液樣品熒光染色對流式定量分析的精度很重要，目前常使用的熒光染料有EB、PI、DAPI、AO、FITC、PE等，對細胞染色時應(yīng)特別注意染料的特性及量效關(guān)系，定量細胞學(xué)熒光染色易受到多種因素的影響，以致造成不正確的測定結(jié)果，了解熒光染色的影響因素，將有助于在熒光定量細胞學(xué)分析中，盡可能避免測量誤差，并進行有效的校正措施，如下的一些常見影響因素需特別注意。

五、細胞懸液熒光染色的質(zhì)量控制67⒈溫度對熒光染色強度的影響：在一般情況下，環(huán)境溫度的升高對熒光染色有明顯的影響，溫度升高可造成溶液粘滯性增加，溶劑和熒光染料分子的動力增大使熒光猝滅的可能性增加，這就使熒光分子和其他分子之間的相互碰撞機率增加，因此，影響了熒光分子發(fā)光量子產(chǎn)額。一般認為，溫度升高時，熒光減弱，熒光減弱的百分比稱溫度系數(shù)，就一般熒光物質(zhì)而言，溫度系數(shù)大約為1%，如果溫度在20℃時，一般熒光染料即出現(xiàn)溫度猝滅效應(yīng)，隨溫度的升高，熒光猝滅作用越強以致造成完全猝滅，溫度在20℃以下，熒光分子發(fā)光量子產(chǎn)額的變化不明顯，基本上保持恒量，因此在熒光測定時要保持染色后的樣品在適當?shù)蜏丨h(huán)境下進行，盡可能減少樣品的照射時間，有條件時應(yīng)使樣品觀察室做到恒溫裝置，會得到更好的熒光定量結(jié)果。⒈溫度對熒光染色強度的影響：682.熒光染色液的濃度與熒光發(fā)射強度有直接比例關(guān)系：在溶液較稀時，熒光強度與濃度成正比關(guān)系，隨濃度加大，熒光強度也增大，當熒光染料達到一定濃度時，如繼續(xù)增加濃度不僅不會使熒光強度有相應(yīng)的增加，反而使熒光強度減低，這種因染料濃度增大使熒光量子的產(chǎn)額下降的現(xiàn)象稱為濃度猝滅現(xiàn)象，因此在研究濃度與熒光強度關(guān)系時，必須檢查所得的熒光值是曲線高峰前的濃度，還是曲線高峰后的濃度(方法是減少溶液濃度，如熒光減弱則為高峰前濃度)。濃度造成熒光猝滅原因,主要是締合分子形成,締合分子中的電子共振作用,而消耗了激發(fā)分子的能量而參與猝滅作用。2.熒光染色液的濃度與熒光發(fā)射強度有直接比例關(guān)系：69實驗表明，當溶液稀釋后，熒光染料分子之間的相互作用完全消失時,熒光量子產(chǎn)額最大，熒光強度發(fā)射最強，當溶液濃度增加時，熒光分子之間發(fā)生碰撞效應(yīng)，各能級間的干擾明顯增加，從而引起熒光量子產(chǎn)額下降，另一個主要原因由于熒光染料濃度增加過大時，造成熒光分子不均勻分布，靠近入射光面的吸收光強，而進入溶液深層時，光吸收越少，發(fā)出的熒光分子也越少，稱這種現(xiàn)象為內(nèi)濾光效應(yīng)(InterfilterEf-fect)。鑒于熒光染料濃度對熒光強度的影響之大，因此要選擇最合適的濃度，對于熒光定量檢測技術(shù)是極其重要的。實驗表明，當溶液稀釋后，熒光染料分子之間的相互作用完全消失時703.pH值對熒光發(fā)射強度的影響：熒光分子在溶劑中處于離子化狀態(tài)，因此，溶液中的氫離子濃度對熒光強度影響極大，熒光分子發(fā)光的最有利條件是其在溶劑中呈離子化或極化狀態(tài)，從而通過染料分子本身所具有的斥力作用盡可能避免分子之間的相互碰撞作用，每一種熒光分子的發(fā)光量的產(chǎn)額最高，都有自己合適的pH值。4.其他一些影響熒光強度的因素：像醛類固定劑(戊二醛，甲醛),可以干擾熒光染料與核酸分子的結(jié)合,像溶劑中的一些不發(fā)光的物質(zhì)(如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、鐵、銀離子等)均可造成熒光的猝滅現(xiàn)象。3.pH值對熒光發(fā)射強度的影響：71六、流式細胞儀器操作技術(shù)的質(zhì)控

為使流式細胞在整個實驗過程中，各種液流系統(tǒng)電子和各個光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整處于最佳工作狀態(tài)，能保證定量檢測的準確性和檢測精度，應(yīng)調(diào)整儀器的變異系數(shù)在最小范圍，分辯率在最好的狀態(tài)，為避免在測量過程中儀器條件的漂移，可能引起定量檢測的誤差，一個校正儀器的參考標準樣品的使用是必不可少的。

1.對流式細胞儀的線性校正

常使用不同大小的熒光微球來測量，儀器的線性會對細胞的定量分析的精度產(chǎn)生顯著影響，如果儀器處于非線性狀態(tài)，對定量細胞DNA含量和細胞周期分布有重要的影響，在定量分析時常常使用的是線性測量，所以對于校正儀器線性的精度尤為重要。六、流式細胞儀器操作技術(shù)的質(zhì)控722.流式細胞儀的變異系數(shù)(CV值)流式細胞儀的變異系數(shù)是光學(xué)元件校正，準值的精確度，CV值是評價儀器精度的很重要的指標，儀器是否準直。校正是通過一個非生物樣品(熒光微球)或生物細胞樣品(人淋巴細胞，雞細細胞等)的檢測來驗證，這校正儀器的樣品即為標準樣品，其物理性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)相對一致。對于這樣一個標準樣品，其CV值應(yīng)越小越好，CV值越小說明儀器準直校正的精度越高，對于一個非生物的熒光微球，一般CV值在2-3.0%左右。2.流式細胞儀的變異系數(shù)(CV值)73對于其他正常二倍體細胞含量的組方圖的CV值應(yīng)小于8%，如果大于8%，這個樣品應(yīng)舍掉，對于腫瘤細胞樣品的CV值可以大于8%，這與腫瘤細胞異質(zhì)性有關(guān)，對于生物細胞樣品本身的生化成分含量的異質(zhì)性大小，固定方法，處理程序和熒光染色等都可能造成CV值的變化。一般認為，實測結(jié)果CV值包括兩部分，一個CV值是使用標準樣品測得的儀器CV值，另一個CV值是實驗樣品所測得的值。對于其他正常二倍體細胞含量的組方圖的CV值應(yīng)小于8%，如果大74⒊對于校正儀器的標準樣品則有一些特殊要求：樣品要求物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不隨時間、溫度、壓力而變化，樣品所帶有的熒光物質(zhì)也要穩(wěn)定，樣品的形態(tài)大小一致。每個粒子不發(fā)生粘連，易長期保存，其光學(xué)特性，測量產(chǎn)生的各種參數(shù)與體積、大小呈比例關(guān)系，標準樣品對于成功操作儀器系統(tǒng)是極其重要的。⒋流式細胞儀的分選技術(shù)在細胞生物研究中具有很重要的價值，但由于光學(xué)電學(xué)流體力學(xué)，超聲振蕩裝置的操作更具有高度的操作精度，分選技術(shù)不能常規(guī)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)細胞標本的分選。⒊對于校正儀器的標準樣品則有一些特殊要求：樣品要求物理、化75七、流式細胞分析資料處理的質(zhì)量控制樣品的中碎片雜質(zhì)和團塊過多，所測細胞數(shù)僅占20%以下，組方圖的基線抬高，尤其不能進行細胞周期分析，盡管目前有計算機的硬件刪除或軟件補償來消除碎片和團塊的影響，也應(yīng)放棄不作分析處理。一個樣品細胞數(shù)檢測應(yīng)在1萬個細胞(不包括碎片、雜質(zhì)、團塊)如果單獨作DNA倍體分析而不作細胞周期的處理，小于1萬個細胞也可以，但異倍體細胞占總細胞數(shù)的10%以下時，不可盲目下結(jié)論，至少異倍體細胞占總細胞的20%以上，可以確定異倍體的存在。

七、流式細胞分析資料處理的質(zhì)量控制76正常二倍體細胞組方圖的CV值大于8%以上，因放棄細胞周期的分析，但腫瘤細胞CV值大于8%，這與腫瘤細胞DNA異質(zhì)性增大有關(guān)。對于一個正常人體的二倍體細胞群，G0/1期細胞占85-90%左右，S+G2M細胞占10-15%，但在同一個體的不同正常組織，細胞DNA含量也有漂移，在不同個體的同源組織也會出現(xiàn)10%的漂移。S期細胞計算準確性，S期細胞作為評價腫瘤的增殖活性又大量報道認為，S期有明顯的臨床預(yù)后意義，但由于在S期計算方面的誤差,而造成評價S期在腫瘤生物學(xué)行為不確切性，正常二倍體細胞組方圖的CV值大于8%以上，因放棄細胞周期的分77對于S期細胞計算較準確的方法，就是分別作兩次樣品的檢測，加入DNA倍體標準樣品檢測一次，不加二倍體標準的樣品檢測一次，GO/1峰應(yīng)是一個正態(tài)分布(或稱高斯分布)但實際測量過程,有部分組方圖有時會出現(xiàn)GO/1峰的右偏峰或脫尾(Teiling)現(xiàn)象，或出現(xiàn)一個右或左側(cè)的峭峰(Kurtosis)，造成S期細胞計算的不準確性，對于這樣峰位，除了可用計算機軟件加以消除外，可放棄S期的計算，對于二倍體腫瘤的S期細胞或G2M期細胞的計算，大多數(shù)作者認為不能作為真正二倍體腫瘤的S期，因其中包括了正常二倍體細胞的S期，可以采用一些特殊標記或多參數(shù)分析二倍體腫瘤的S期或單獨作為二倍體腫瘤樣品的檢測而不加二倍體內(nèi)標準。對于S期細胞計算較準確的方法，就是分別作兩次樣品的檢78DNA倍體標準的質(zhì)量控制：DNA倍體的標準是根據(jù)正常二倍體細胞DNA含量的分布范圍而確定的，對于二倍體的標準的選擇，應(yīng)遵照如下原則：

◆采用同個體同源正常組織。

◆同種固定方法。

◆相同的樣品處理方法。

◆同樣的染色方法,同步染色。

◆同樣的儀器檢測條件。

◆正常二倍體細胞作為內(nèi)標準。

DNA倍體標準的質(zhì)量控制：79

◆在不具備同個體，同源組織的情況下，可以使用雞紅細胞，或其他生物細胞為內(nèi)參標準，作為計算倍體的標準細胞，但這種標準細胞的使用，僅限于新鮮組織倍體的判定，對于石蠟包埋組織倍體標準，解決的辦法是將正常組織與腫瘤組織同時包埋于一個石蠟組織塊中，這樣正常組織作為一個二倍體內(nèi)標準，能減少DNA倍體分析的誤差。

◆在不具備同個體，同源組織的情況