脂質(zhì)體磁性復(fù)合納米顆粒的制備與發(fā)展 楊文清123513

脂質(zhì)體磁性復(fù)合納米顆粒的制備與應(yīng)用

楊文清123513摘要：造影劑輔助的核磁共振成像是目前腫瘤診斷的最好方法之一。但是由于核磁共振成像內(nèi)在的低靈敏性以及造影劑的非特異性，導(dǎo)致腫瘤早期診斷較為困難。文章將一種新的腫瘤靶向核磁造影劑納米粒子應(yīng)用于早期腫瘤的影像診斷。這種新的腫瘤靶向核磁造影劑納米粒子由配體轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)、納米水平的正電脂質(zhì)體(Lip)載體和臨床常用的造影劑Magnevist(TfNiR_LipNBD_Magnevist)三部分構(gòu)成。另外轉(zhuǎn)鐵蛋白和脂質(zhì)體粒子上，亦標(biāo)記了熒光物質(zhì)用于確定轉(zhuǎn)鐵蛋白．脂質(zhì)體．造影荊納米粒子的靶向性，以及腫瘤的光學(xué)影像診斷。關(guān)鍵詞：腫瘤診斷；脂質(zhì)體；納米顆粒；磁性；靶向一、引言在科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的時(shí)代，新的技術(shù)和新的理論不斷涌現(xiàn)和完善。這些技術(shù)和理論快速地向各個(gè)領(lǐng)域滲透，給人類社會(huì)帶來新的生機(jī)，推動(dòng)社會(huì)向前發(fā)展。21世紀(jì)對(duì)社會(huì)發(fā)展最具影響力的技術(shù)是生物技術(shù)、信息技術(shù)和納米技術(shù)。率先發(fā)展起來的生物技術(shù)和信息技術(shù)已滲透到人們生活的各個(gè)領(lǐng)域，為大眾所熟悉；而上世紀(jì)90年代才發(fā)展起來的納米技術(shù)卻仍然披著神秘的面紗，等待著人們?nèi)ヌ剿?、去完善。納米技術(shù)(nanotectmology)是指在納米尺度空間內(nèi)操縱原子和分子，對(duì)材料進(jìn)行加工，制造出具有特定功能的產(chǎn)品或?qū)ξ镔|(zhì)及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，掌握其原子和分子運(yùn)動(dòng)規(guī)律和特性的一門綜合性的技術(shù)體系。EricDrexler教授在1986年首次正式提出納米技術(shù)一詞，對(duì)納米技術(shù)的發(fā)展起了指導(dǎo)性作用。目前納米技術(shù)已涉及從農(nóng)業(yè)到醫(yī)藥，從基礎(chǔ)到臨床，從診斷到治療，從納米生物材料到人工器官、機(jī)器人各個(gè)方面，進(jìn)而向診斷和治療的微創(chuàng)、微型、微量、快速、實(shí)時(shí)、遙距、動(dòng)態(tài)、智能化方向發(fā)展。納米醫(yī)學(xué)是納米科技的一個(gè)新分支，是運(yùn)用納米科技的理論與方法，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)上，開展醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐的新興邊緣學(xué)科。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，納米科技已經(jīng)得到成功的應(yīng)用，最引人注目的是作為藥物載體和傳感器載體。納米藥物載體研究始于30多年前，但一直受制于基礎(chǔ)研究進(jìn)度，產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)不成熟，到了上世紀(jì)90年代后才逐步走向市場(chǎng)，現(xiàn)在正呈加速發(fā)展?fàn)顟B(tài)。目前中國的納米藥物載體技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程比較快，不久的將來就可有納米醫(yī)藥產(chǎn)品問世。而其中最具有發(fā)展?jié)摿褪袌?chǎng)前景的是以納米脂質(zhì)材料制成的藥物載體。脂質(zhì)納米粒用作藥物載體具有下述顯著優(yōu)點(diǎn)：(1)載藥脂質(zhì)納米粒作為異物而被巨噬細(xì)胞吞噬，到達(dá)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等靶部位；連接有配基、抗體、酶底物所在的靶部位。(2)到達(dá)靶部位的載藥脂質(zhì)納米粒，可有載體材料的種類或配比不同而具有不同的釋藥速度。調(diào)整載體材料種類或配比，可投資藥物的釋放速度，制備出具有緩釋特性的載藥脂質(zhì)納米粒。(3)由于載藥脂質(zhì)納米粒的粘附性及小的粒徑，即有利于局部用藥時(shí)滯留性的增加，也有利于藥物與腸壁的接觸時(shí)間與接觸面積，提高藥物口服吸收的生物利用度。(4)可防止藥物在胃酸性條件下水解，并能大大降低藥物與胃蛋白酶等消化酶接觸的機(jī)會(huì)，從而提高藥物在胃腸道中的穩(wěn)定性。(5)載藥脂質(zhì)納米?？梢愿淖兡み\(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制，增加藥物對(duì)生物膜的透過性，有利于藥物透皮吸收與細(xì)胞內(nèi)藥效發(fā)揮。隨著靶向藥物的不斷發(fā)展，科學(xué)家希望通過特異性生物分子介導(dǎo)，合成出一類具有腫瘤靶向性的造影劑，以進(jìn)一步降低核磁共振成像技術(shù)的檢測(cè)極限，用于腫瘤的早期診斷。腫瘤靶向造影劑主要由配體、造影劑載體和造影劑三部分構(gòu)成。從理論上講，由于腫瘤表面抗原過度表達(dá)，腫瘤靶向造影劑可以特異性地聚集在腫瘤細(xì)胞表面，從而增強(qiáng)微小腫瘤病灶的核磁信號(hào)，實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷。文獻(xiàn)報(bào)道，納米尺度的陽離子脂質(zhì)體(Lip)可被用作藥物或基因治療的載體。在脂質(zhì)體的表面修飾上如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白(tf)或抗腫瘤表面抗原抗體等靶向配體，就可以特異性引導(dǎo)造影劑到達(dá)癌細(xì)胞。用于腫瘤靶向的靶向基團(tuán)一般需要具有體積小、毒性低、對(duì)腫瘤特異性結(jié)合能力強(qiáng)、無免疫原性等特性。腫瘤靶向脂質(zhì)體粒子不但能選擇性地運(yùn)載藥物或基因到癌細(xì)胞，而且更增加了脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在許多腫瘤，包括口腔、前列腺、乳腺、胰腺等癌細(xì)胞表面呈現(xiàn)高表達(dá)。比如，有研究表明在74％的乳腺癌、76％的肺腺癌、93％的肺鱗癌中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體呈現(xiàn)高表達(dá)。且轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)水平與腫瘤的增長(zhǎng)速度及預(yù)后成正比。因此，近年來基于轉(zhuǎn)鐵蛋白的腫瘤靶向藥物研發(fā)十分活躍，轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體、或單鏈抗體片段等被用來做靶向的基團(tuán)。本文利用陽性脂質(zhì)體粒子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和臨床上使用的核磁造影劑Magnevist構(gòu)建了轉(zhuǎn)鐵蛋白.脂質(zhì)體.Magnevist腫瘤靶向納米粒子(tfNIR-LipNBD-Magnevist)，來增強(qiáng)核磁共振影像的對(duì)比度，用于腫瘤的早期診斷。為了研究方便，我們還在轉(zhuǎn)鐵蛋白上標(biāo)記了近紅外熒光物質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)中，采用光學(xué)成像的方法，確定轉(zhuǎn)鐵蛋白.脂質(zhì)體一造影劑納米粒子的生物分布。光學(xué)成像方法簡(jiǎn)易，檢測(cè)靈敏度高(可達(dá)10-9-10-i2mol/L),沒有放射性，因此在動(dòng)物模型觀察基因表達(dá)、基因傳遞，以及手術(shù)中確定腫瘤的邊界上已有很好的應(yīng)用。光學(xué)影像受限制于熒光在體內(nèi)有限的穿透力，目前僅能提供較好的二維空間的影像。如果核磁共振高解析度成像和高靈敏度的光學(xué)成像相組合，可在分子水平上顯示某疾病特殊豐富的影像表位。一系列實(shí)驗(yàn)表明，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的靶向型核磁造影劑納米粒子，特異性地富集于腫瘤組織，顯著增強(qiáng)了核磁共振影像的對(duì)比度。二、 實(shí)驗(yàn)方法：2.1實(shí)驗(yàn)步驟陽離子脂質(zhì)體和DOTAP按1：1的比例(重量)混合溶解在氯仿溶液中(Lip),或在DOTAP：DOPE中再加入0.1%NBD—DOPE［熒光標(biāo)記脂質(zhì)體DOPE-N-(7-nitro-2-1-3-benzoxadiazol-4-y1)(AvantiPolarLipids,Alabaster,AL)］構(gòu)建帶有NBD熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體(LipNBD)。取3.6p1(精確度只能到0.1pl)LipNBD混合液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蠹尤?0pL含12plMagnevist造影劑(Berlex,Wayne,NJ)的水溶液重新水化LipNBD。每微升Magnevist造影劑含469.01pggadopentatatedimeglumine。震蕩10分鐘后用水調(diào)至175pl。將此混合液先用超聲降解(80-90w,10min),然后分別經(jīng)孔徑為0.2pm和0.1pm的聚碳酸脂薄膜過濾。最后加入25pl熒光劑Alexa680標(biāo)記的人轉(zhuǎn)鐵蛋白(TfNIR,5mg/mL)(Invitrogen,Carlsbad,CA),混勻后靜置l0分鐘以上。所有實(shí)驗(yàn)都用新鮮制備的探針。最終反應(yīng)物的體積為200pl。脂質(zhì)體、人轉(zhuǎn)鐵蛋白與Magnevist的比例為10：12.5:0.56(nmol/pg/mg)。另夕卜，為研究探針的細(xì)胞內(nèi)吞作用，用近紅外Alexa680熒光劑替代核磁共振造影劑構(gòu)建了Tf-LipNBD-dye探針。濃度為200pl探針內(nèi)含2plAlexa680熒光劑。2.2細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型我們用人乳腺癌MDA-MB-231-1uc(CaliperLifeSciences,Hopkinton,MA)培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物模型來測(cè)試我們新構(gòu)建的靶向納米核磁造影劑的有效性。MDA-MB-231-1uc細(xì)胞轉(zhuǎn)染了北美螢火蟲熒光素酶基因，表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%dx牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中。8到10周左右的胸腺缺陷型雌性裸鼠(Harlan,Indianapolis,IN)用于制作皮下腫瘤模型。1x107個(gè)細(xì)胞懸浮于100plDPBS中注射于裸鼠后背皮下。直徑0.4至1.2cm的腫瘤用于試驗(yàn)。三、 結(jié)果分析3.1TfNIR-LipNBD-Magnevist的細(xì)胞內(nèi)吞共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞和TfNIR-LipNBD-Magnevist分別培養(yǎng)5分鐘至2小時(shí)。TfNIR-LipNBD-Magnevist孵育的細(xì)胞顯示很強(qiáng)的T嚴(yán)近紅外熒光信號(hào)(圖1A,D1)和綠色LipNBD信號(hào)(圖1B,E1)。在和Magnevist

孵育的細(xì)胞中檢測(cè)不到任何熒光信號(hào)（圖1D2,E2）。LipNBD（綠色）和熒光染料（紅色）在孵育5分鐘后即能觀察到其在胞漿中的信號(hào)。熒光強(qiáng)度不斷增加，直至1小時(shí)后達(dá)到最大值。后，LipNBD和染料蓄積形成多個(gè)內(nèi)含體。這些內(nèi)含體主要位于胞漿的周邊區(qū)域。在2小時(shí)后更加明顯。相對(duì)僅有染料孵育的對(duì)照組,細(xì)胞對(duì)染料的攝取并不明顯。利用光學(xué)成像進(jìn)一步確定了探針在腫瘤細(xì)胞中的攝取。201J0O-二201J0O-二（圖1）利用核磁共振成像，當(dāng)探針Tf^R-LipNBD-Magnevist或Lip^D-Magnevist與細(xì)胞共孵育后，相對(duì)于Magnevist，細(xì)胞顯示明顯的信號(hào)增強(qiáng)和T1短縮。T1在與TfzR-LipNBD-Magnevist探針孵育時(shí)間減短至366ms，在與探針Lip^D-Magnevist孵育時(shí)為374ms，而與Magnevist孵育時(shí)為408ms。與TfNIR-LipNBD-Magnevist孵育的細(xì)胞較與Lip^^BD-Magnevist孵育的細(xì)胞顯示更高的信號(hào)強(qiáng)度。這些結(jié)果證明，Tf對(duì)于探針經(jīng)靶向性細(xì)胞的內(nèi)吞，具有重要作用。LipNBD-Magnevist和僅Magnevist介導(dǎo)產(chǎn)生的核磁信號(hào)強(qiáng)度和T1不同，反應(yīng)了腫瘤細(xì)胞膜和脂質(zhì)體的有效融合。3.2TfNiR-LipNBD-Magnevist介導(dǎo)的腫瘤影像對(duì)比度增強(qiáng)為了研究探針是否在體內(nèi)能夠特異性的富集在腫瘤，我們首先進(jìn)行了以TfNIR腫瘤內(nèi)積聚為目標(biāo)的光學(xué)成像。在靜脈注射探針TfNIR-LipNBD-Magnevis詬，近紅外熒光信號(hào)在10分鐘時(shí)便清晰可辨，90分鐘至2小時(shí)熒光的強(qiáng)度達(dá)到最大（圖2）。熒光強(qiáng)度和腫瘤的大小成正比，大的腫瘤（0.8cm直徑）在注射2天后仍可測(cè)到明顯的熒光信號(hào)。小的腫瘤，其熒光強(qiáng)度在24小時(shí)后已很微弱。雖然LipNBD能夠在體外被清晰地檢測(cè)到，但因綠色熒光較差的穿透能力，在體內(nèi)無法被檢測(cè)到。組織自發(fā)熒光也是體內(nèi)檢測(cè)LipNBD困難的另一個(gè)重要原因。在靜脈注射探針后，探針快速地分布到全身，并且很快被血流豐富的器官吸收，如肝、脾、肺、腦和骨髓。然而，探針很快從這些器官中代謝出去，與之不同的是，在腫瘤中探針?biāo)ネ说倪^程非常緩慢。腫瘤對(duì)探針的攝取，因轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合而增強(qiáng)。背景熒光在最初的快速增強(qiáng)之后，其背景也快速下降（圖2）。根據(jù)腫瘤的大小不同，在不同的時(shí)問點(diǎn)上（10分鐘至48小時(shí)）腫瘤的熒光強(qiáng)度和正常組織（對(duì)側(cè)腿肌肉）的熒光強(qiáng)度比為1.3至3.4。小于3mm直徑的腫瘤顯示較弱的熒光信號(hào)，可能是由血管系統(tǒng)差異造成的。含有熒光染料的Lip而沒有Tf交聯(lián)的探針并沒有使腫瘤組織的熒光增強(qiáng)。在無胸腺裸鼠實(shí)體瘤動(dòng)物模型同樣表明了核磁共振成像信號(hào)的增強(qiáng)。腫瘤直徑大小從0.4至1.2cm不等（共10只動(dòng)物）。相同的小鼠用來比較探針和僅用Magnevist時(shí)信號(hào)增強(qiáng)的不同。使用TfNIR-LipNBD-Magnevist探針或僅用Magnevist的實(shí)驗(yàn)相隔至少三天。靜脈注射TfNIR-LipNBD-Magnevist探針明顯增強(qiáng)了腫瘤成像對(duì)比度（圖3）。在注入10分鐘后可觀測(cè)到增強(qiáng)信號(hào)，并不斷增強(qiáng)，在90分鐘至2小時(shí)信號(hào)達(dá)釗高峰（圖3），達(dá)到高峰的時(shí)間與腫瘤的大小有關(guān)。之后，信號(hào)逐漸減弱。在腫瘤內(nèi)不同部位信號(hào)增強(qiáng)有很大的差異。在1至3小時(shí)內(nèi)，信號(hào)

增強(qiáng)的形態(tài)分布漸趨穩(wěn)定。腫瘤的一些區(qū)域增強(qiáng)很快，而另一些區(qū)域增強(qiáng)較慢。小的腫瘤，信號(hào)的增強(qiáng)在整個(gè)腫瘤中比較均勻。通常增強(qiáng)從周邊開始。使用Magnevist造影劑進(jìn)行核磁共振成像，腫瘤的影像對(duì)比度在給入Magnevist后比無造影劑的影像有輕微的增強(qiáng)(圖4)。最大增強(qiáng)效果通常在注入30至60分鐘后觀測(cè)到。信號(hào)增強(qiáng)度在3小時(shí)內(nèi)逐漸下降并回至給與造影劑之前的水平。單純Magnevist的藥物動(dòng)力學(xué)和T伴L(zhǎng)ip阻Magnevist探針表現(xiàn)不同。含Magnevist但無Tf交聯(lián)的脂質(zhì)體，相對(duì)于Magnevist或TfNIR-LipNBD-Magnevist表現(xiàn)出更弱的信號(hào)增強(qiáng)作用。圖2)圖3圖3)圖4)四、總結(jié)磁性脂質(zhì)體納米顆粒作為一種新興的磁性靶向藥物載體。脂質(zhì)體能夠降低藥物的毒性，保護(hù)被包封的藥物，且天然靶向性和通透性良好。磁性納米顆?？梢蕴峁岑煟殴舱裨煊癕RI等,脂質(zhì)體與磁導(dǎo)向的基核相結(jié)合提高了靶向作用，降低了血管阻塞的危險(xiǎn)性，通過進(jìn)一步偶聯(lián)抗體可以進(jìn)一步提高脂質(zhì)體磁性復(fù)合納米顆粒的特異性靶向能力，最終實(shí)現(xiàn)診療一體化的作用。除此之外，還有脂質(zhì)體與銀納米顆粒相偶聯(lián)等其他做法，總之脂質(zhì)體納米顆粒是一類極具開發(fā)潛力的藥物載體，其