中藥指紋技術(shù)

中藥指紋圖譜研究技術(shù)周玉新博士內(nèi)容一、中藥指紋圖譜技術(shù)概述二、中藥指紋圖譜研究指導(dǎo)原則三、指紋圖譜研究的相似度計算四、中藥指紋圖譜的研究方法與思路五、中藥指紋圖譜研究示例演示（實驗）一、中藥指紋圖譜技術(shù)概述（一）中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量（二）中藥指紋圖譜研究方法學(xué)（三）中藥指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展指紋圖譜穩(wěn)定性可控性安全性有效性1.中藥指紋圖譜與中藥安全、有效、穩(wěn)定的關(guān)系（一）中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量2.國內(nèi)中藥質(zhì)量評價現(xiàn)狀植物學(xué)方法： 原植物鑒定，顯微鑒定等植物化學(xué)方法： 理化鑒定分析化學(xué)方法： 儀器分析，色譜分析等藥理學(xué)方法： 生物鑒定法，生物等效等分子生物學(xué)方法: DNA指紋鑒定3.國外植物藥質(zhì)量評價概況標(biāo)準(zhǔn)制劑： 銀杏人參西洋參五味子 甘草黃芪貫葉連翹 定量測定結(jié)合主成分比例固定產(chǎn)地以生產(chǎn)質(zhì)量恒定制劑多種分析手段和方法包括藥材、中間體等指紋圖譜4.中藥指紋圖譜的意義

是全面反應(yīng)中藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥的質(zhì)量，尤其在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確，采用中藥指紋圖譜的方式，將有效地表征中藥質(zhì)量和穩(wěn)定性有利于中藥及其產(chǎn)品進(jìn)入國際市場5.中藥指紋圖譜建立的原則

系統(tǒng)性：指紋圖譜所反映的化學(xué)成分，應(yīng)包括中藥有效部位所含大部成分的種類，或指標(biāo)成分的全部特征性：指紋圖譜中反映的化學(xué)成分信息（具體表現(xiàn)為保留時間或位移值）是具有高度選擇性的，是這些信息的綜合結(jié)果穩(wěn)定性：指紋圖譜在規(guī)定的方法與條件下應(yīng)能作出相對一致的指紋圖譜

色譜特征的穩(wěn)定性：特征峰 特征區(qū) 特征參數(shù)色譜條件穩(wěn)定性：不同儀器的驗證 不同實驗室的驗證不同操作者的驗證☆品種鑒別--真?zhèn)巍罨磋b別--產(chǎn)地☆藥用部位的鑒別--根、莖、葉、花、果☆提取工藝☆藥材炮制☆限量成分的控制☆一致性--不同批次的產(chǎn)品.6.指紋圖譜研究目的品種種多多、產(chǎn)產(chǎn)地地多多;采收收、加工工不不一一致致－化化學(xué)學(xué)組組分分與與含含量量不不同同（產(chǎn)產(chǎn)品品品品質(zhì)質(zhì)優(yōu)優(yōu)劣劣不不同同））有效效組組分分種種類類繁繁多多、含含量量相相對對少少；非非有有效效組組分分成成分復(fù)復(fù)雜雜、含量量高高－分分析析檢檢測測困困難難（質(zhì)質(zhì)量量控控制制指指標(biāo)標(biāo)不不統(tǒng)統(tǒng)一一））基礎(chǔ)礎(chǔ)研研究究薄薄弱弱藥材材GAP建建設(shè)設(shè)滯滯后后7.建建立立中中藥藥指指紋紋譜譜所所面面臨臨的的問問題題8.對對策策加強強GAP藥藥材材種種植植基基地地建建設(shè)設(shè)加強強中中藥藥種種植植與與加加工工、、炮炮制制的的規(guī)規(guī)范范化化加強強中中藥藥化化學(xué)學(xué)成成分分的的基基礎(chǔ)礎(chǔ)研研究究應(yīng)用用現(xiàn)現(xiàn)代代分分析析技技術(shù)術(shù)手手段段進(jìn)進(jìn)行行中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜研研究究儀器器設(shè)設(shè)備備技術(shù)術(shù)人人員員研究究經(jīng)經(jīng)驗驗系統(tǒng)統(tǒng)性性問問題題穩(wěn)定定性性問問題題特征征性性問問題題9.中中藥藥指指紋紋譜譜研研究究過過程程中中面面臨臨的的問問題題色譜譜法法1.液液相相色色譜譜法法（（LC））2.氣氣相相色色譜譜法法（（GC））3.薄薄層層掃掃描描法法（（TLC））4.毛毛細(xì)細(xì)管管電電泳泳法法（（CE））其它它1.質(zhì)質(zhì)譜譜法法（（MS））及及色色譜譜與與質(zhì)質(zhì)譜譜聯(lián)聯(lián)用用2.X-衍衍射射法法3.近近紅紅外外法法（（NIR））等等（二二））中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜研研究究方方法法學(xué)學(xué)（三三））中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜技技術(shù)術(shù)的的發(fā)發(fā)展展應(yīng)用用范范圍圍儀器器設(shè)設(shè)備備與與軟軟件件指紋紋圖圖譜譜標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)二、、中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜研研究究指指導(dǎo)導(dǎo)原原則則（一一））目目的的和和要要求求（二二））中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)起起草草說說明明（三三））中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)的的建建立立中藥藥質(zhì)質(zhì)量量研研究究和和質(zhì)質(zhì)量量標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)的的一一個個重重要要內(nèi)內(nèi)容容加強中藥藥質(zhì)量管管理、提提高中藥藥質(zhì)量、、保證藥藥品安全全、有效效、穩(wěn)定定、可控控固定原料料藥（中中藥材））品種、、產(chǎn)地和和采收季季節(jié)的前前提下，，需制定定原料藥藥(中藥藥材)和和注射劑劑的指紋紋圖譜（一）目目的和要要求（二）中中藥指紋紋圖譜標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)起草草說明1.名名稱稱、漢語語拼音2.來來源（（產(chǎn)地、、采收期期、炮制制）按中藥的的命名原原則制定定藥材材：：產(chǎn)地、、采收期期、炮制制中間體：：提取工工藝或提提取物的的來源3.供供試試品溶液液的制備備有效成分分(專屬屬性成分分、指標(biāo)標(biāo)性成分分)的理理化性投投質(zhì)并結(jié)合合檢測方方法的要要求提取工藝藝參照物溶溶液的制制備對照品內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)提取取物中藥指紋紋圖譜檢檢測方法法的驗證證（1）檢檢測方法法測定方法法、儀儀器、、試試劑、、測測定條件件（2）驗驗證專屬性（（空白白試驗））精密度試試驗（RSD<3%））重復(fù)性與與重現(xiàn)性性試驗（（S<0.95）穩(wěn)定性試試驗（S<0.95））系統(tǒng)適應(yīng)應(yīng)性試驗驗6.指指紋紋圖譜的的相關(guān)性性（三）中中藥指紋紋圖譜標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的建建立注意事項項（1）所所有成分分應(yīng)在2小時左左右洗脫脫，并提提供2小小時的指指紋圖譜譜（2）可可建立各各個組分分的指紋紋圖譜（3）可可建立多多種方法法的指紋紋圖譜（4）可可選擇典典型樣品品的指紋紋圖譜，，或標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)提取物物的指紋紋圖譜，，或具有代代表性的的勾兌樣樣品的指指紋圖譜譜作為標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)指紋紋圖譜2.指指紋圖圖譜標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)的建立立（1）藥藥材、中中間體指指紋圖譜譜標(biāo)準(zhǔn)為為企業(yè)內(nèi)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)，列入入起草說明明（2）10批供供試品（3）標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)規(guī)定：供試品的的指紋圖圖譜與對對照提取取物（標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)提取取物的指指紋圖譜譜一致；；或供試試品的指指紋圖譜譜與對照照指紋圖圖譜（標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)圖譜譜）一致致；或通通過對各各特征峰峰的位置置（相對對保留時時間、比比移值等等）、豐豐度（積積分面積積或峰高高）及相相對豐度度、光譜譜特性（（顏色））等綜合合參數(shù)的的描述予予以確定定。指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)書寫格式液相色譜法【指紋圖譜】】照高效效液色譜法（（中國藥典一一部附錄VID），結(jié)結(jié)合指紋圖譜譜的要求測定定。色譜條件及系系統(tǒng)適用性試試驗如如以對照品做做系統(tǒng)適用性性試驗，則參參照中國藥典典書寫格式。。如以隨行對對照提取物做做系統(tǒng)適用性性試驗，則只只書寫所用儀儀器、色譜柱柱型號及有關(guān)關(guān)參數(shù)和各項項具體試驗條條件。對照品溶液的的制備如如有對照品品則照中國藥藥典書寫格式式。供試品溶液的的制備精精密吸取供供試品溶液、、對照品溶液液（或?qū)φ沼糜锰崛∥锶芤阂海└鱔Xml，分別流入入液相色譜儀儀，測定。本品指紋圖譜譜的主要特征征供試試品指紋圖譜譜與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)所附的對照照指紋圖譜（（或隨行對照照提取物指紋紋圖譜）經(jīng)計計算軟件計算算，相似度大大于XX，，符合要求（（或相似度小小于XX，，不符合要求求）。三、指紋圖譜譜研究的相似似度計算（一）、指紋紋圖譜相似度度評價原則與與方法（二）、指紋紋圖譜相似度度計算原理（三）、指紋紋圖譜相似度度評價軟件（一）、指紋紋圖譜相似度度評價原則與與方法原則：整體性、模糊糊性、特征性性方法：直接觀察、計計算機輔助相相似性計算1.引用用參數(shù)2.數(shù)據(jù)據(jù)獲取途徑3.相似似度算法（二）、指紋紋圖譜相似度度計算原理1.引用用參參數(shù)①保留時間間(RT)②峰高(Height)③峰面積(Area)④峰面積百百分比（Area%）⑤相對保留留時間（RatioofRetentionTime,RRt）⑥積分相對對比值（RatioofArea,RA）2.數(shù)據(jù)據(jù)獲取取途徑（1）圖形/圖像轉(zhuǎn)化成成ASCII數(shù)據(jù)（2）截片數(shù)數(shù)據(jù)（3）色譜數(shù)數(shù)據(jù)3.相似似度度算法法夾角余弦算法法相關(guān)系數(shù)算法法優(yōu)化算法法1.軟件件開發(fā)原則2.市市售/常用用軟件件簡介介3.相相似度度軟件件使用用過程程中應(yīng)應(yīng)注意意的問問題（三））、指指紋圖圖譜相相似度度評價價軟件件1.軟軟件件開開發(fā)發(fā)原原則則系統(tǒng)獨獨立性性(2)計計算方方法的的科學(xué)學(xué)性(3)數(shù)數(shù)據(jù)接接口通通用性性(4)操操作過過程及及應(yīng)用用的實實用性性2.市市售/常用用軟件件簡介介浙江大大學(xué)陳陳一一宇教教授中南大大學(xué)梁梁逸逸增教教授沈陽藥藥科大大學(xué)畢畢開順順教授授西北大大學(xué)李李華教教授二軍大大Waters3.相相似度度軟件件使用用過程程中應(yīng)應(yīng)注意意的問問題數(shù)據(jù)接接口與與數(shù)據(jù)據(jù)類型型數(shù)據(jù)的的校正正算法的的選擇擇四、中中藥指指紋圖圖譜的的研究究方法法與思思路（一））、研研究方方案設(shè)設(shè)計（二））、樣樣品的的選擇擇與收收集（三））、供供試品品的制制備（四））、指指紋圖圖譜色色譜條條件研研究的的思路路（五））、相相似度度值的的研究究與指指紋特特征（一））、研研究方方案設(shè)設(shè)計資料收收集與與整理理文獻(xiàn)、、工藝藝資料料、質(zhì)質(zhì)量標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)方案的的設(shè)計計（1））研究究對象象-有有效成成分（2））研究究方法法的選選擇-色譜譜法(HPLCGCTLC)及其其它方方法（3））研究究內(nèi)容容-根根據(jù)技技術(shù)要要求的的規(guī)定定：包包括““名稱稱、來來源、、制備備、檢檢測方方法、、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)規(guī)定定及起起草說說明””（二））、樣樣品的的選擇擇與收收集要求：：10個個批次次道地藥藥材與與GAP基基地藥藥材典型性性與代代表性性離散樣樣品的的剔除除（三））、供供試品品的制制備依據(jù)：：有效組組分的的物理理化學(xué)學(xué)性質(zhì)質(zhì)生產(chǎn)或或提取取工藝藝檢測方方法的的需要要（四））、指指紋圖圖譜色色譜條條件研研究的的思路路高效液液相色色譜法法HPLC氣相色色譜法法GC（1））檢檢測波波長的的選擇擇（簡））（2））柱柱溫的的選擇擇（略））（3））進(jìn)進(jìn)樣量量（簡））（4））色色譜柱柱的選選擇（重點點）（5））檢檢測成成分的的選擇擇（重點點）（6））流流動相相（梯梯度表表）的的選擇擇（重點點）1.高高效效液液相相色色譜譜法法HPLC示例：：蜂膠膠(BeePropolis)（1））檢檢測波波長的的選擇擇=280nm=360nm=254nm=210nm波長選選擇：：=280nm（4））色色譜柱柱的選選擇選用市市場上上較常常見的的填料料所填填充的的色譜譜柱，，例如如：Eka-Nobel的KromasiC18(5mm)，其其分離效效果好、、性能穩(wěn)穩(wěn)定，無無論是國國產(chǎn)填充充的Kromasi色色譜柱，，還是國國外公司司填充的的Kromasi色譜譜柱，在在分離效效果上基基本相同同。因此此對于大大多數(shù)中中藥注射射劑，可可選用Kromasi色譜柱柱。如選用乙乙腈-緩緩沖溶液液，應(yīng)根根據(jù)緩沖沖溶液的的特點，，選用相相應(yīng)的色色譜柱：：①如如為酸性性緩沖溶溶液，可可選用ZorbaxSB-C18色譜柱柱（pH<2））；②如如為堿堿性緩沖沖溶液，，可選用用EclipseXDB-C18色譜柱柱（pH>6））。示例：不不同的色色譜柱對對三七總總皂苷的的分離效效果LichosorbPolarisKromasilDiamonsilCarbosorb（5）檢檢測成分分的選擇擇（重點））示例：何何首烏何首烏生生品的液液相色譜譜圖（全全局圖））何首烏生生品的液液相色譜譜圖（局局部放大大圖）圖9上上海制制首烏指指紋圖譜譜北京良方方藥業(yè)制制首烏北京金象象藥店制制首烏北京壽春春堂藥店店制首烏烏指紋圖圖譜（6）流流動相（（梯度表表）的選選擇主要影響響因素1.起起始濃濃度2.梯梯度速速率3.流流速時間∕min水%（H+/OH-）*乙腈%*Ⅰ

01000552080600100Ⅱ

01000407030606040Ⅲ

08020406040605050Ⅳ

06040403070600100*為體積百百分比（（V/V）指紋圖譜譜流動相相梯度優(yōu)優(yōu)化*為體積百百分比（（V/V）梯度度表表初始色譜譜條件時間（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000600100時間（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000552080600100初始色譜譜條件的的設(shè)定依依據(jù)及目目的依據(jù)：化化合物極極性大小小。如未未知時，，假設(shè)有有效組分分中包含含各種極極性的成成分。目的：快快速確定定主要或或大部分分化合物物被洗脫脫時流動動相的組組成，為為優(yōu)化條條件的選選擇提供供依據(jù)。。優(yōu)化條件件的選擇擇選擇依據(jù)據(jù)：初始始色譜圖圖、梯度度洗脫表表及一定定的經(jīng)驗驗示例例：（1）淫羊羊藿總黃黃酮（40%））提取物物（2）鉤鉤藤總生生物堿（3）黃黃連藥材材（4）知知母總皂皂苷淫羊藿提提取物在在初始條條件下的的色譜圖圖淫羊藿提提取物第第一次優(yōu)優(yōu)化后的的色譜圖圖梯度速率率：初始：100/60min=1.7/min優(yōu)化：0~1.7CH3CN%CH3CN%MinMin初始條件件CH3CN%Min三七人人參西西洋參參CH3CN%Min起始濃度度：根根據(jù)初始始色譜圖圖中主要要色譜峰峰被洗脫時的的流動相相組成，，相應(yīng)減減少~20%。流速速：0.5~2.0ml/min2.氣氣相相色色譜法法（1）影影響色譜譜峰分離離程度的的因素色譜柱的的類型載氣流速速起始柱溫溫升溫速率率（2）研研究示例例樣品：廣廣藿香油油指紋圖圖譜研究究過程方案設(shè)計計檢測方法法（1）色色譜方法法廣藿香油油為廣藿藿香藥材材經(jīng)水蒸蒸汽蒸餾餾而得到到的揮發(fā)發(fā)油，均均為易揮揮發(fā)組分分，擬采采用氣相色譜譜法（GC）。（2）儀儀器：Agilent6890GC（3）色色譜柱的的選擇可供選擇擇的色譜譜柱：極極性非極性中等極性性（4）進(jìn)進(jìn)樣方式式的確定定手動自動頂頂空2.供供試品溶溶液的制制備取廣藿香香油適量量，加醋醋酸乙酯酯溶解，，即得。。注：對于于非極性性毛細(xì)管管色譜柱柱，如供供試品溶溶液中含含少量的的少，最最好干燥燥后進(jìn)樣樣。2.色色譜條件件的摸索索（1）對對梯度速速率及流流速進(jìn)行行微調(diào)-由粗到到精初始條件件流速速：3.0ml/min進(jìn)樣口溫溫度：250℃℃檢測口溫溫度：280℃℃初始柱柱溫溫：50 ℃升溫速速率：30℃/min第一次優(yōu)優(yōu)化流速速：2.0ml/min進(jìn)樣口溫溫度：250℃℃檢測口溫溫度：280℃℃初始柱柱溫溫：50 ℃升溫速速率：20℃/min第二次優(yōu)優(yōu)化流速速：1.0ml/min進(jìn)樣口溫溫度：250℃℃檢測口溫溫度：280℃℃初始柱柱溫溫：50 ℃升溫速率率： 10℃/min第三次優(yōu)化化流速速：1.0ml/min進(jìn)樣口溫度度：250℃℃檢測口溫度度：280℃℃初始柱柱溫：50 ℃升溫速率率： 5℃/min第四次優(yōu)化流速速：0.5ml/min進(jìn)樣口溫度：： 250 ℃檢測口溫度：： 280 ℃初始柱柱溫：50 ℃升溫速率率： 5℃/min（2）選擇細(xì)細(xì)化的初始條條件-由細(xì)到到精初始條件流速速：1.0ml/min進(jìn)樣口溫度：： 250 ℃檢測口溫度：： 280 ℃初始柱柱溫：50 ℃升溫速率率： 1.0℃/min第一次優(yōu)化流速速：1.0ml/min進(jìn)樣口溫度：： 250 ℃