臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)

第六章

診斷酶學(xué)P136-176蚌埠醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室1教學(xué)目標(biāo)[教學(xué)時(shí)數(shù)]6學(xué)時(shí)[掌握]血清酶的分類(lèi)、生理變異、病生機(jī)制等，同工酶及其亞型測(cè)定，臨床診斷中常用的血清酶及其同工酶，重要血清酶的測(cè)定、原理及評(píng)價(jià)。[熟悉]酶的有關(guān)酶基本知識(shí)，酶活性濃度的測(cè)定技術(shù)及酶的免疫化學(xué)測(cè)定。2

第一節(jié)血清酶

3一、血清酶的來(lái)源根據(jù)酶的來(lái)源及其在血漿中發(fā)揮催化功能的情況，將其分為：P143一般代謝酶組織專(zhuān)一酶血漿特異酶非血漿特異酶外分泌酶細(xì)胞酶一般代謝酶組織專(zhuān)一酶血漿特異酶非血漿特異酶外分泌酶細(xì)胞酶血清酶4

名稱(chēng)

血漿特異酶

非血漿特異酶

外分泌酶細(xì)胞酶一般代謝酶組織專(zhuān)一酶來(lái)源肝消化腺或其它外分泌腺

各組織器官

（無(wú)器官專(zhuān)一性）

肝

（有器官專(zhuān)一性）

種類(lèi)凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纖溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等

胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等LDH、AST、ALT、CK、MDH等

OCT等

5二、血清酶的去路酶蛋白在血管內(nèi)的失活與降解（主要代謝去路）血清酶的半壽期（T1/2)：酶失活至原來(lái)活性一半所需時(shí)間。有助于了解同一疾病不同酶升高持續(xù)時(shí)間的差異。肝或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)血清酶的清除少數(shù)以酶原形式存在的血清酶類(lèi)（凝血酶原、纖溶酶原）在活化后迅速被肝清除，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)也可能參與血清酶（LD、AST、AMY、CK等）的清除。血清酶的排泄尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途徑，如胃蛋白酶原、淀粉酶（AMY）。轉(zhuǎn)入其它體液只有血清酶的來(lái)源與去路保持平衡，才能維持酶活性保持相對(duì)恒定。但一些病理情況往往促使這種平衡被打破，導(dǎo)致血清酶活性的變化。P1436三、血清酶變化的病理機(jī)制（一）合成異常合成減少合成增多肝損害導(dǎo)致合成酶的能力受損（ChE、LCAT）酶基因變異引起酶合成減少（銅氧化酶）增生性疾?。ü趋兰膊?，ALP)惡性腫瘤（前列腺癌，ACP)酶的誘導(dǎo)作用（乙醇，γ-GT）P1447（二）釋放增加（大多數(shù)血清酶增高的主要機(jī)制）細(xì)胞內(nèi)外酶濃度的差異對(duì)于非血漿特異酶，細(xì)胞內(nèi)外濃度差可在千倍以上，只要有少量細(xì)胞壞死或病變，血中酶濃度明顯升高。對(duì)血漿特異酶，細(xì)胞病變很少引起血中酶濃度明顯升高。酶的相對(duì)分子量（影響細(xì)胞內(nèi)釋出的關(guān)鍵）酶從細(xì)胞內(nèi)釋出的速度與酶的相對(duì)分子量成反比。如AMI時(shí)，血中最先升高的是CK（MW：85kD)，LD（MW：125kD)出現(xiàn)升高明顯延遲。酶的組織分布含酶量高且血流豐富的組織器官，其細(xì)胞內(nèi)酶進(jìn)入血流的可能性大；除少數(shù)組織專(zhuān)一性酶以外，大多數(shù)血清酶不能特異反映某個(gè)特定組織的病變。但同工酶的發(fā)現(xiàn)大大提高酶檢測(cè)的組織的特異性。酶在細(xì)胞內(nèi)的定位及存在形式線(xiàn)粒體酶不易從細(xì)胞中釋出，如ASTm的檢測(cè)往往反映肝細(xì)胞的損傷程度，且是AMI中最后升高的酶，用于判斷預(yù)后；有些酶在細(xì)胞內(nèi)與結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，較難釋放。ATPATP不足，細(xì)胞內(nèi)酶容易釋放。P1458（三）排出異常腎功能減退，血清AMY活性升高可能因酶排泄障礙而在血液中滯留。膽道梗阻，血清ALP升高的原因是梗阻區(qū)ALP合成加強(qiáng)，ALP排泄受阻而逆流入血。大多數(shù)酶，不存在以上的清除機(jī)制。P1459四、血清酶的生理差異（一）性別多數(shù)酶無(wú)差異，少數(shù)有差異男性高于女性：CK、ALP、γ-GT女性高于男性：LDH1（青年婦女）（二）年齡最明顯的例子是ALP，新生兒血清中ALP略高于成人，1～5歲增至成人的2～3倍，然后逐漸下降，到10～15歲，ALP又明顯升高，可達(dá)成人的3～5倍，20歲后降至成人值。（三）飲食血清中大多數(shù)酶不受進(jìn)食影響，故測(cè)定酶活性不一定需要空腹采血。（四）運(yùn)動(dòng)激烈的肌肉運(yùn)動(dòng)可使血清中多種酶，如CK、LD、AST、ALD、ALT等活性升高。（五）妊娠（六）其它P14510第二二節(jié)節(jié)酶活性性濃度度的測(cè)測(cè)定技技術(shù)P146-P16011酶活性性濃度度的測(cè)測(cè)定技技術(shù)酶活性性濃度度概念念酶活性性濃度度測(cè)定定連續(xù)監(jiān)監(jiān)測(cè)法法檢測(cè)測(cè)酶活活性濃濃度工具酶酶血清酶酶活性性濃度度測(cè)定定條件件的優(yōu)優(yōu)化酶活性性濃度度的單單位12一、酶酶活性性濃度度的概概念1.酶酶的特特性：：微量量性、高效性性等。直接測(cè)量非常困難（mmol/L或mg/dl）通過(guò)測(cè)定被加速化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率，來(lái)間接反映酶的濃度2.酶酶促反反應(yīng)SSEE+ESEPE+PV＝dsdt或V＝dpdtES133.酶酶活性性濃度度即酶所催催化的的化學(xué)學(xué)反應(yīng)應(yīng)的反反應(yīng)速速率，用酶促促反應(yīng)應(yīng)中單單位時(shí)時(shí)間內(nèi)內(nèi)底物物的減減少量量或產(chǎn)產(chǎn)物的的生成成量來(lái)來(lái)計(jì)算算。注意：只有當(dāng)當(dāng)酶所所催化化的反反應(yīng)速速度僅僅與[E]成成正正比，，而不不受其其它因因素影影響時(shí)時(shí)，即即在酶酶促反反應(yīng)的的零級(jí)期期，才能根根據(jù)酶酶所催催化的的化學(xué)學(xué)反應(yīng)應(yīng)速率率來(lái)確確切表表示酶酶活性性濃度度的大大小。。P14614實(shí)際上上是通通過(guò)檢檢測(cè)酶酶活性性濃度度間接接反映映酶的的量，，因?yàn)闉橹苯咏訖z測(cè)測(cè)酶的的質(zhì)量量濃度度要求求的實(shí)實(shí)驗(yàn)條條件及及技術(shù)術(shù)條件件非常常高，，價(jià)格格昂貴貴，不不適用用于臨臨床檢檢測(cè)，，因此此測(cè)定定酶活活性濃濃度是是臨床床酶學(xué)學(xué)分析析最為為常見(jiàn)見(jiàn)的方方法，，具有有迅速速、靈靈敏、、成本本低等等特點(diǎn)點(diǎn)。但僅在在上述述前提提下，，只能能在反反應(yīng)的的零級(jí)級(jí)期，，即只只有在在酶促促反應(yīng)應(yīng)的最最適條條件下下，才才能真真實(shí)地地代表表酶含含量。。因此此可根根據(jù)酶酶促反反應(yīng)進(jìn)進(jìn)程曲曲線(xiàn)，，采用用合理理的方方法進(jìn)進(jìn)行酶酶活性性濃度度的檢檢測(cè)。。15零級(jí)一級(jí)[P][S]V＝dpdt反應(yīng)級(jí)級(jí)數(shù)時(shí)間4.酶酶促反反應(yīng)進(jìn)進(jìn)程延滯期期線(xiàn)性期期非線(xiàn)性性期P147LagphaseZeroorderLinearphaseFirstorder酶促反反應(yīng)時(shí)時(shí)間進(jìn)進(jìn)程曲曲線(xiàn)16單試劑劑測(cè)定定體系系酶促促反應(yīng)應(yīng)進(jìn)程程曲線(xiàn)線(xiàn)P14817結(jié)論：為了計(jì)算酶酶活性濃度度，必須根根據(jù)線(xiàn)性反反應(yīng)期（零零級(jí)反應(yīng)期期）的反應(yīng)應(yīng)速率才能能準(zhǔn)確計(jì)算算出酶活性性濃度否則則將導(dǎo)致誤誤差。酶活性濃度度測(cè)定就是是要使酶促促反應(yīng)的初初速度達(dá)到到Vmax，即在過(guò)過(guò)量底物存存在下的零零級(jí)反應(yīng)期期的V，此此時(shí)V與[E]之間間有線(xiàn)性關(guān)關(guān)系。P14818二、酶活性性濃度測(cè)定定方法（一）按檢檢測(cè)方法分分類(lèi)1、量氣法法其原理是通通過(guò)測(cè)量一一封閉反應(yīng)應(yīng)系統(tǒng)中氣氣體變化后后的氣體體體積或壓力力，從而計(jì)計(jì)算出氣體體的變化量量適用于測(cè)定定在反應(yīng)中中產(chǎn)生或消消耗氣體體的酶2、分光光光度法酶促反應(yīng)的的底物與產(chǎn)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不不同，光吸吸收譜也有有差異，不不僅能在可可見(jiàn)光范圍圍測(cè)定有色色溶液的濃濃度，還能能在紫外光光波長(zhǎng)范圍圍測(cè)定特異異的帶有雙雙鍵或環(huán)狀狀結(jié)構(gòu)的無(wú)無(wú)色物質(zhì)3、熒光法法和放射性性核素法通過(guò)熒光光光度計(jì)測(cè)定定酶促反應(yīng)應(yīng)生成熒光光物質(zhì)的速速率，此速速率與酶濃濃度成正比比4、其它方方法P14619（二）按反反應(yīng)時(shí)間分分類(lèi)1、定時(shí)法（取樣法、、終點(diǎn)法、、兩點(diǎn)法））優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，測(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色計(jì)或分光光度計(jì)無(wú)需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇不考慮對(duì)酶活性的影響。缺點(diǎn)：無(wú)法知道在整個(gè)酶促反應(yīng)進(jìn)程中是否都是零級(jí)反應(yīng)。注意：應(yīng)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時(shí)期，確定線(xiàn)性時(shí)間；保證酶和底物在所選定的溫度下作用時(shí)間要精確。P14820定時(shí)法，早期測(cè)定定酶活性濃濃度的方法法，大多是是使酶作用用一段時(shí)間間，然后加加入強(qiáng)酸、、強(qiáng)堿、蛋蛋白沉淀劑劑等終止酶酶促反應(yīng)，，測(cè)定這段段時(shí)間內(nèi)底底物的減少少量或產(chǎn)物物的生成量量，計(jì)算酶酶促反應(yīng)的的平均速度度。連續(xù)監(jiān)測(cè)法法，即指連續(xù)測(cè)測(cè)定酶促反反應(yīng)過(guò)程中中某一產(chǎn)物物或底物濃濃度隨時(shí)間間變化的多多點(diǎn)數(shù)據(jù)，，求出酶促促反應(yīng)初速速度，間接接計(jì)算出酶酶活性濃度度的方法。。其是臨床床測(cè)定酶活活性濃度最最常用方法法。212、連續(xù)監(jiān)測(cè)法法（動(dòng)力學(xué)法法、速率法法）優(yōu)點(diǎn)：容易找到直直線(xiàn)區(qū)域，，選擇線(xiàn)性性反應(yīng)期來(lái)來(lái)計(jì)算酶活活性，不需終止反反應(yīng)。缺點(diǎn)：線(xiàn)性反應(yīng)期期因酶種類(lèi)類(lèi)和反應(yīng)條條件而異，，必須用實(shí)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)進(jìn)行確定，，必須選取取酶促反應(yīng)應(yīng)的最適反反應(yīng)條件，，需要有可可以連續(xù)監(jiān)監(jiān)測(cè)的設(shè)備備。P1493、平衡法法目前臨床應(yīng)應(yīng)用較少，，通過(guò)測(cè)定定酶促反應(yīng)應(yīng)開(kāi)始至反反應(yīng)達(dá)到平平衡時(shí)產(chǎn)物物或底物濃濃度的總變變化量來(lái)求求出酶活性性濃度的方方法。22三、連續(xù)監(jiān)監(jiān)測(cè)法測(cè)定定酶活性濃濃度（一）種類(lèi)類(lèi)1.直接法法不終止酶促促反應(yīng)條件件下，直接接通過(guò)測(cè)定定反應(yīng)體系系中底物或或產(chǎn)物理化化性質(zhì)的變變化（如：：A、熒光光、旋光性性，pH、、電導(dǎo)率、、粘度等）），從而計(jì)計(jì)算出酶活活性濃度。。評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)單，，但只有底底物與產(chǎn)物物之間，在在理化性質(zhì)質(zhì)方面有顯顯著性差異異時(shí)，才能能使用直接接法，只有有很少一部部分酶能用用直接法測(cè)測(cè)定。P14923（1）目目前以分光光光度法最最為廣泛，，利用340nm處吸吸光度的變變化測(cè)定各各種脫氫酶酶。NAD(P)++H+NAD(P)H

僅在260nm處有吸收峰

在260、340nm處有吸收峰340nm處A的變變化可以反反映反應(yīng)體體系中NAD(P)H量的增增減，進(jìn)而而反映酶活活性濃度。。（2）利用用一類(lèi)人工合合成的所謂色色原性底物，，其本身為無(wú)色色或微黃色，，酶作用后生生成有色化合合物。P14924（1）在原反反應(yīng)體系中加加入一些試劑劑，其只和酶酶反應(yīng)物迅速速作用，產(chǎn)生生可被檢出的的物質(zhì)，但該該試劑不和酶酶反應(yīng)，也不不影響酶的活活性。SPE+試劑可被檢出的物物質(zhì)（2）酶偶聯(lián)聯(lián)法目前應(yīng)用最多多，即在原反應(yīng)應(yīng)體系中加入入另一些酶試試劑，所進(jìn)行行的酶促反應(yīng)應(yīng)和被測(cè)酶反反應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)來(lái)。P14925（二）酶偶聯(lián)聯(lián)反應(yīng)反應(yīng)模式ABPExEi被測(cè)酶被測(cè)酶始發(fā)反應(yīng)始發(fā)反應(yīng)指示反應(yīng)指示酶指示反應(yīng)指示酶ABCPExEaEi輔助酶輔助反應(yīng)酶偶聯(lián)體系輔助酶輔助反應(yīng)P149261.酶偶聯(lián)聯(lián)反應(yīng)時(shí)相酶偶聯(lián)反應(yīng)一一開(kāi)始不能反反映酶活性，，在反應(yīng)中存存在幾個(gè)時(shí)相相。以臨床常常規(guī)酶學(xué)分析析中常見(jiàn)的ALT的檢測(cè)測(cè)為例，在該該酶偶聯(lián)體系系中的指示酶酶為脫氫酶，，反應(yīng)原理如如下：L-丙氨酸＋＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸酸α-丙酮酸＋NADH乳乳酸＋＋NAD+ALTLDH此時(shí)反應(yīng)的方方向由NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD，隨反反應(yīng)進(jìn)行，A應(yīng)隨之而下下降，通過(guò)檢檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物物A在340nm處A的的變化速率，，可以檢測(cè)指指示酶反應(yīng)。。P150ALT雙試劑劑法測(cè)定中，，首先使血清清與缺少α-酮戊二酸的的底物溶液混混合，37°C保溫5m，將將樣品中所含含的內(nèi)源性α-酮酸消耗完完。然后再加加入α-酮戊二酸啟啟動(dòng)ALT催催化的反應(yīng)。。27反應(yīng)一開(kāi)始加加入的試劑1中只有丙氨氨酸，不存在在α-酮戊二酸，，在此時(shí)相中中，存在于樣樣品中的干擾擾物質(zhì)（內(nèi)源源性α-酮酸）消耗耗完。加入試劑2（（即α-酮戊二酸））啟動(dòng)反應(yīng)，，在初始階段段，產(chǎn)物α-丙酮酸開(kāi)始始出現(xiàn)，并逐逐漸增多，但但處于較低水水平，指示酶酶反應(yīng)速度也也較低，不能能代表待測(cè)酶酶的Vx。隨著產(chǎn)物α-丙酮酸增加加到一定程度度，Ex和Ei反應(yīng)V相相同，達(dá)到穩(wěn)穩(wěn)態(tài)期。此階階段340nm處A出現(xiàn)現(xiàn)明顯的線(xiàn)性性變化。最后由于底物物的消耗，反反應(yīng)V逐漸減減慢，偏離線(xiàn)線(xiàn)性。P150282.酶偶聯(lián)反應(yīng)注注意事項(xiàng)(1)延滯期應(yīng)越短短越好，測(cè)定定時(shí)間要避開(kāi)開(kāi)此期。(2)不是所所有的酶都適適合用酶偶聯(lián)聯(lián)法進(jìn)行測(cè)定定，酶偶聯(lián)反反應(yīng)V應(yīng)超過(guò)過(guò)或等于Vx，Ei反應(yīng)應(yīng)必須是一級(jí)級(jí)反應(yīng)，即指指示酶反應(yīng)速速率和測(cè)定酶酶的產(chǎn)物B濃濃度成正比。。只有使用大大量的Ei及及其Km值很很小時(shí)才能做做到。(3)從經(jīng)濟(jì)濟(jì)方面考慮應(yīng)應(yīng)選用一些來(lái)來(lái)源容易且價(jià)價(jià)格便宜的酶酶（指示酶））制劑。(4)適當(dāng)?shù)牡闹甘久傅挠糜昧?，反?fù)實(shí)實(shí)驗(yàn)法確定，，即做到酶偶偶聯(lián)速率不隨隨酶量的增加加而升高，并并在所選的最最適條件下，，指示酶偶聯(lián)聯(lián)反應(yīng)速率和和酶活性濃度度成正比。P15029（三）干擾因因素(1)其他酶酶和物質(zhì)的干干擾(2)酶的污污染(3)非酶反反應(yīng)(4)分析容容器的污染(5)沉淀形形成解決方法之一一可通過(guò)試劑劑空白管檢出出并加以校正正，另一個(gè)有有效途徑就是是不用單一試試劑而改用雙雙試劑測(cè)定酶酶活性。P15130四、工具酶工具酶：酶學(xué)學(xué)分析中作為為試劑用于測(cè)測(cè)定化合物濃濃度或酶活性性濃度的酶。。指示酶和輔助助酶作為反應(yīng)應(yīng)系統(tǒng)中的試試劑。（一）工具酶酶（二）常用工工具酶常用工具酶多多為氧化還原原酶類(lèi)工具酶純度不不必要求過(guò)高高工具酶中雜質(zhì)質(zhì)的含量有一一定的限制P15231（三）工具酶酶參與的指示示反應(yīng)臨床生化檢驗(yàn)驗(yàn)中，很多項(xiàng)項(xiàng)目的測(cè)定往往往使用有工工具酶參與的的類(lèi)似的反應(yīng)應(yīng)原理－－共共通（通用））反應(yīng)途徑。。1.偶聯(lián)H2O2的工具酶及其其指示反應(yīng)葡萄糖尿酸膽固醇甘油丙酮酸葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶膽固醇氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶H2O2以H（e）為受體的指示酶以NAD(P)H為輔酶參與的指示酶觸酶POD(最常用）P1522H2O2+4-AAP+酚醌亞胺(紅色)+4H2OPOD32例：葡葡萄糖糖氧化化酶法法測(cè)定定血清清葡萄萄糖Glu＋O2＋H2OGA＋H2O2H2O2＋4-AAP＋＋酚H2O＋O2＋紅色色醌類(lèi)類(lèi)化合合物GODPOD葡萄糖糖氧化化酶（（glucoseoxidase，，GOD））利用用O2和H2O將Glu氧化化成GA，，并釋釋放H2O2，過(guò)氧氧化物物酶（（peroxidase，POD）在在色原原性氧氧受體體存在在時(shí)將將H2O2分解為為H2O和O2，并將將色原原性氧氧受體體4-AAP和和酚去去氫縮縮合為為紅色色醌類(lèi)類(lèi)化合合物，，即Trinder反應(yīng)應(yīng)。紅紅色醌醌類(lèi)化化合物物的量量與Glu含量量成正正比。。即POD催催化下下，H2O2氧化芳芳香族族胺色色素原原生成成有色色色素素，此此類(lèi)色色素原原供氫氫體包包括：：OT、DAB、ODA、TMB。332.NAD(P)+或NAD(P)H偶偶聯(lián)的的脫氫氫酶及及其指指示反反應(yīng)許多氧氧化還還原反反應(yīng)，，尤其其是作作為工工具酶酶如LD、、GLD、、G6PD等參參與時(shí)時(shí)，常常將底底物的的H去去除后后傳遞遞給NAD(P)+形成NAD(P)H。借借助NAD(P)H340nm處處特征征性的的光吸吸收，，借此此用分分光光光度法法檢測(cè)測(cè)。如：葡葡萄糖糖、尿尿素、、β-羥丁酸酸、甘甘油三三酯、、甲醇醇、血血氨、、ALT、AST、LD、、GLD、、CK、ALD、G6PD、、ICD等等。例：尿素＋H2O2NH3＋CO2NH3＋α-酮戊二酸＋NADH＋H+谷氨酸＋NAD+＋H2O尿素酶GLDP152P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+

34五、血血清酶酶活性性濃度度測(cè)定定條件件的優(yōu)優(yōu)化方法儀器設(shè)設(shè)備試劑自動(dòng)生生物化化學(xué)分分析儀儀參數(shù)數(shù)設(shè)置置標(biāo)本的的采集集、運(yùn)運(yùn)輸與與保存存P15335標(biāo)本的的采集集、運(yùn)運(yùn)輸與與保存存溶血：：細(xì)胞胞內(nèi)酶酶而言言，細(xì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)外濃濃度差差異大大；所所以應(yīng)應(yīng)及時(shí)時(shí)進(jìn)行行分離離，靜脈采采血后后應(yīng)在在1～～2h內(nèi)分分離血血清?？鼓齽﹦豪貌莶菟猁}鹽、枸枸櫞酸酸鹽、、EDTA抗凝凝的血血漿一一般不不用作作酶活活性測(cè)測(cè)定；；肝素素對(duì)ALT、AST、CK、、LD、ACP檢測(cè)測(cè)均無(wú)無(wú)影響響，可可用于于急診診；臨臨床多多用血清為首選選測(cè)定定標(biāo)本本。溫度：：大部部分酶酶在低低溫中中比較較穩(wěn)定定，一一般在在血清清分離離當(dāng)天天測(cè)定定，否否則應(yīng)應(yīng)放冰冰箱冷冷藏；；通常在在0～～4°C下使用用、處處理及及保存存，除了了一些些冷變變性的的酶；；液氮氮可作作為酶酶學(xué)測(cè)測(cè)定時(shí)時(shí)血清清標(biāo)本本及質(zhì)質(zhì)控長(zhǎng)長(zhǎng)期保保存的的方法法。P15536六、酶酶活性性濃度度單位位（一））酶活活性單單位慣用單單位用首先先報(bào)告告該種種酶測(cè)測(cè)定方方法的的臨床床酶學(xué)學(xué)家的的名字字來(lái)命命名其其單位位，即即使同同一種種酶因因方法法不同同而有有數(shù)種種活性性單位位，參參考值值差別別很大大。國(guó)際單單位1963年年，1IU＝1μmol/min（（25°C及其他他最適適條件件下））1976年年，1U＝1μmol/min（特特定條條件下下）1979年年，1Katal＝＝1mol/s（規(guī)規(guī)定條條件下下），，1U＝16.67nKatalP15637（二））酶活活性濃濃度單單位以每單單位體體積所所含的的酶活活性單單位數(shù)數(shù)表示示；各國(guó)學(xué)學(xué)者習(xí)習(xí)慣用用U/L表表示體體液中中酶催催化活活性濃濃度，，1U/L=16.67nKatal/L正常上上限（（upperlimitsofnormal，ULN）倍倍數(shù)把酶測(cè)測(cè)定值值轉(zhuǎn)換換為正正常上上限值值的倍倍數(shù)；；易于比比較解解釋來(lái)來(lái)自不不同方方法的的結(jié)果果，利利于各各實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室間間質(zhì)評(píng)評(píng)調(diào)查查；可將ULN進(jìn)一一步適適當(dāng)分分級(jí)，，制定定出輕輕度、、中度度及重重度增增加的的范圍圍，使使檢測(cè)測(cè)結(jié)果果更加加一目目了然然；P15638（三三））酶酶活活性性濃濃度度計(jì)計(jì)算算連續(xù)續(xù)監(jiān)監(jiān)測(cè)測(cè)法法檢檢測(cè)測(cè)酶酶活活性性濃濃度度時(shí)時(shí)，，使使用用摩摩爾爾消消光光系系數(shù)數(shù)（（ε）。。其其定定義義為為：：特特定定條條件件下下，，一一定定波波長(zhǎng)長(zhǎng)的的光光，，光光徑徑為為1.0cm時(shí)時(shí)，，通通過(guò)過(guò)所所含含吸吸光光物物質(zhì)質(zhì)的的濃濃度度為為1.00mol/L時(shí)時(shí)的的吸吸光光度度。。連續(xù)續(xù)監(jiān)監(jiān)測(cè)測(cè)法法測(cè)測(cè)定定在在線(xiàn)線(xiàn)性性范范圍圍內(nèi)內(nèi)每每分分鐘鐘吸吸光光度度的的變變化化（（ΔA/min））U/L＝ΔAmin×V×106ε×v×LΔA—吸光度變化106

—把mol換算成μmolv—樣品量（ml）L

—比色杯光徑（cm）V—反應(yīng)體系體積（ml）ε—摩爾消光系數(shù)（cm2

·mol-1）P15739自動(dòng)動(dòng)生生物物化化學(xué)學(xué)分分析析儀儀測(cè)測(cè)定定同同一一酶酶，，條條件件固固定定時(shí)時(shí)，，從從理理論論上上講講V，，v和和L均均為為固固定定值值，，ε為常常數(shù)數(shù)，，則則可可將將公公式式簡(jiǎn)簡(jiǎn)寫(xiě)寫(xiě)為為：：U/L＝ΔAmin×KV×106ε×v×LK=K為為酶酶活活性性濃濃度度定定量量系系數(shù)數(shù)主要要用用于于臨臨床床酶酶活活性性測(cè)測(cè)定定的的計(jì)計(jì)算算與與校校正正K值值設(shè)設(shè)置置應(yīng)應(yīng)考考慮慮酶酶的的參參考考值值上上限限及及測(cè)測(cè)定定時(shí)時(shí)間間兩兩方方面面，，這這些些均均與與儀儀器器測(cè)測(cè)定定的的噪噪音音有有關(guān)關(guān)。。P15840第三節(jié)節(jié)酶的免疫疫化學(xué)測(cè)測(cè)定41一、報(bào)告告方式酶活性濃濃度單位位：U/L質(zhì)量濃度度單位：：ng/ml，，μg/L二、優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)靈敏度高高特異性高高能用于檢檢測(cè)一些些不表現(xiàn)現(xiàn)酶活性性的酶蛋蛋白特別適用用于同工工酶的檢檢測(cè)樣品中其其他方法法不易測(cè)測(cè)出的少少量或痕痕量酶不受體液液中其它它物質(zhì)的的影響酶原或去去輔基酶酶蛋白P16042三、缺點(diǎn)點(diǎn)要制備足足夠量多多的提純純酶作為為抗原和和具有免免疫化學(xué)學(xué)性質(zhì)的的抗血清清步驟多，，操作繁繁瑣測(cè)定成本本高P16143第四節(jié)節(jié)同工酶及及其亞型型測(cè)定44一、概念念同工酶（（isoenzyme）同一種屬屬中由不不同基因因或等位位基因所所編碼的的多肽鏈鏈單體、、純聚體體或雜化化體，具具有相同同的催化化功能，，但其分分子組成成、空間間構(gòu)象、、理化性性質(zhì)、生生物學(xué)性性質(zhì)以及及器官分分布和細(xì)細(xì)胞內(nèi)定定位不同同的一類(lèi)類(lèi)酶。亞型（isoform）即指基因因在編碼碼過(guò)程中中由于翻翻譯后修修飾的差差異所形形成的多多種形式式的一類(lèi)類(lèi)酶，往往往在基基因編碼碼產(chǎn)物從從細(xì)胞內(nèi)內(nèi)釋入血血漿時(shí)因因肽酶作作用降解解而形成成。P16145二、分析方法法臨床同工酶的的分析可分為為兩步首先精確地分分離出某酶的的各同工酶組組分測(cè)定酶的總活活性和各同工工酶或亞型組組分的活性P16246二、分析方法法（一）電泳法法原理使用最為廣泛泛簡(jiǎn)便、快速、、分離效果好好、不破壞酶酶的天然構(gòu)象象可分為：乙酸酸纖維素薄膜膜電泳、聚丙丙烯酰胺凝膠膠電泳、等電電聚焦電泳及及毛細(xì)管電泳泳測(cè)定步驟為：：區(qū)帶分離、、活性顯色和和檢測(cè)結(jié)果方法同工酶氨基酸酸組成不同（（一級(jí)結(jié)構(gòu)不不同），pI不同，電泳泳遷移率也就就不同，電泳泳可將其分開(kāi)開(kāi)。P16347顯色染料偶氮染料四唑鹽離子型化合物物，易溶于水水，難溶于一一般的有機(jī)試試劑，利用其其進(jìn)行的偶合合反應(yīng)，生成成不同顏色的的偶氮色素進(jìn)進(jìn)行同工酶譜譜檢測(cè)受氫體作用，，四唑鹽可被被還原成紫紅紅色的formazan，常用的有有：NBT、、INT、MTT等。其其中NBT使使用最多。掃描定量光密度計(jì)熒光計(jì)P16348（二）色譜法法柱色譜法離子交換色譜譜親和色譜商品化微型色色譜柱P16449（三）免疫分分析法免疫抑制法免疫沉淀法其它免疫學(xué)方方法

利用同工酶的一種亞基與相應(yīng)抗體結(jié)合后，酶活性受到抑制，測(cè)定加與不加抗體前后樣品中酶活性的變化

利用分離提純的同工酶作抗原制備的抗體與含該型同工酶的待測(cè)樣品混合，在一定條件下抗原抗體復(fù)合物形成沉淀，離心后測(cè)定上清液中其它型別的酶活性，將加入抗體前測(cè)得的總活性減去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。免疫電泳、RIA、EIA和CLIAP16450（四）動(dòng)力學(xué)學(xué)分析法底物特異性分分析法抑制劑分析法法pH分析法熱失活分析法法（五）蛋白酶酶水解法P16551三、同工酶檢檢測(cè)意義提高酶診斷的的特異性提高診斷的靈靈敏度對(duì)某些疾病的的預(yù)后有評(píng)價(jià)價(jià)價(jià)值有些同工酶有有明顯的組織織分布和細(xì)胞胞內(nèi)定位差異異有些同工酶的的變化可在總總酶變化之前前發(fā)生線(xiàn)粒體酶的測(cè)定52第五節(jié)臨床常用血清清酶分析53一、轉(zhuǎn)氨酶（（Aminotransferases）及其同工酶酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶(Alanineaminotransferases，，ALT)/谷丙轉(zhuǎn)氨氨酶GPT天冬氨酸氨基基轉(zhuǎn)移酶(Aspartateaminotransferases，AST/谷谷草轉(zhuǎn)氨酶酶GOT1.催化反應(yīng)應(yīng)L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸α-草酰乙酸＋L-谷氨酸ALTAST兩種酶均需要要磷酸吡哆醛醛（VitB6）為輔基基，不含磷酸酸吡哆醛的酶酶蛋白為脫輔輔基酶蛋白，，無(wú)催化活性性。P166542.組織分布布ALT大量存存在于肝組織織，其次為腎、、心、骨骼肌肌等。其有兩兩種活性同工工酶，α(ALTs)、β(ALTm)，分別存在細(xì)細(xì)胞質(zhì)及線(xiàn)粒粒體中。肝細(xì)細(xì)胞中ALT大多存在細(xì)細(xì)胞質(zhì)，少量量在線(xiàn)粒體，，肝細(xì)胞壞死死時(shí)血清中以以ALTs為為主。AST存在多種器官官，按含量多多少為心、肝、骨骼肌和腎。。其有兩種同同工酶ASTs、ASTm，分別存在細(xì)細(xì)胞質(zhì)及線(xiàn)粒粒體中。細(xì)胞胞輕度損傷ASTs顯著著升高，而嚴(yán)嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)ASTm大量出現(xiàn)現(xiàn)于血清中。。血中AST升高多來(lái)自自心臟或肝臟臟損傷。P166553.標(biāo)本溶血標(biāo)本不能能用于檢測(cè)宜用血清，4℃冰箱中可貯存存1星期，活活性無(wú)明顯改改變。4.臨床意義ALT是反映映肝損傷的一一個(gè)靈敏指標(biāo)標(biāo)急性肝炎早期期升高，ALT>AST；急性肝炎恢復(fù)復(fù)指標(biāo)Deritis比值可用用于肝炎診斷斷、鑒別診斷斷及判斷轉(zhuǎn)歸歸酶膽分離是肝肝細(xì)胞壞死先先兆P16756AST主要用用于肝臟疾病病的診斷AMI發(fā)病6-8h即升升高，48-60h達(dá)高高峰，4-5d恢復(fù)正常常。由于A(yíng)ST在A(yíng)MI時(shí)升高遲于于CK，恢復(fù)復(fù)早于LD，，故目前診斷斷AMI價(jià)值值不大。急性肝炎，AST升高程程度不及ALT；慢性肝肝炎，特別肝肝硬化、慢性性活動(dòng)性肝炎炎時(shí)，AST升高程度超超過(guò)ALT。。P16757二、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶酶及其同工酶酶γ-谷氨酰轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyltranspeptid,γ-GT/GGT）1.催化反反應(yīng)又稱(chēng)：γ-谷谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶（γ-GTP/GGTP)一種含巰基的的線(xiàn)粒體酶，可催化γ-谷氨?；鶑膹腉SH或其其它含γ-谷谷氨酰基化合合物中轉(zhuǎn)移至至另一肽或氨氨基酸分子上上。GSH＋氨基基酸γ-谷氨酰氨氨基酸＋半胱胱氨酰甘氨酸酸GGTP167582.組織分分布腎臟中含量最最多，其次為為胰、肺、肝肝等。血清中中的GGT主主要來(lái)自肝膽膽。3.標(biāo)本GGT較穩(wěn)定定，室溫下可可放置2d，，4℃可存放1w，-20℃可儲(chǔ)存1y；RBC中中幾乎無(wú)GGT，因此溶溶血標(biāo)本可以以檢測(cè)。P167594.臨床床意義有助肝膽疾病病的鑒別診斷斷與ALP聯(lián)合合進(jìn)行肝臟疾疾病檢測(cè)膽道疾病，GGT陽(yáng)性率率高，而且升升高明顯，可可高達(dá)5-30ULN，，肝實(shí)質(zhì)疾病病是GGT一一般只是中度度升高，可達(dá)達(dá)2-5ULN。若ALP升高高而GGT正正常，則完全全排除ALP的肝來(lái)源，，若ALP和和GGT都增增加，則應(yīng)先先排除肝外引引起GGT增增加的原因，，一旦排除，，則GGT增增高為肝病所所致。(1)肝肝膽疾病檢出出陽(yáng)性率最高高的酶(2)用于于判斷惡性腫腫瘤有無(wú)肝轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移(3)乙醇醇、巴比妥類(lèi)類(lèi)藥物等可誘誘導(dǎo)GGT的的升高。P16860三、肌酸激激酶及其同工工酶和亞型肌酸激酶（creatinekinase，CK）1.催化化反應(yīng)CK催化肌酸酸和ATP或或磷酸肌酸和和ADP之間間的磷酸轉(zhuǎn)移移的可逆性反反應(yīng)，所產(chǎn)生的磷酸酸肌酸含高能能磷酸鍵，是是肌肉收縮時(shí)時(shí)能量的直接接來(lái)源。磷酸肌酸＋ADP肌酸＋ATPCKP168612.組織織分布廣泛分布于全全身，在骨骼骼肌含量最高高，其次是心心肌和腦。CK由兩種不不同亞基（M，B）組成成的二聚體，，細(xì)胞質(zhì)中存存在三種同工工酶：CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2)、CK-MM(CK3)，線(xiàn)粒體中中存在CK-Mt(CK4)，其電泳速速率最慢。CK同工酶又又可分為不同同亞型，CK-MM有三三種亞型，CK-MM1，CK-MM2，CK-MM3，電泳速率依依次減慢；CK-MB有有CK-MB2和CK-MB1兩種亞型。3.標(biāo)本本不得用溶血標(biāo)標(biāo)本，RBC中含有AK，可干擾測(cè)測(cè)定，引起測(cè)測(cè)定值偏高；；測(cè)定樣品宜宜用血清或肝肝素抗凝血漿漿，其它抗凝凝劑都抑制CK活性。P168624.臨床意義CK及其同工工酶和亞型是是目前臨床上上測(cè)定次數(shù)最最多的酶之一一，主要用于于心肌、骨骼骼肌和腦疾患患的診斷。(1)AMI的早期期診斷總CK在A(yíng)MI診斷中意義不大CK-MB為診斷AMI的金指標(biāo)CK-MM3/CK-MM1>1.0為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)（排除急性骨骼肌損傷）CK-MB2>1.9U/L或CK-MB2/CK-MB1>1.5為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)之一(2)全全身疾病特別別是肌肉疾病病時(shí)，CK極極度升高P16963四、乳酸脫氫氫酶及其同工工酶和亞型乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LD/LDH）1.催化反反應(yīng)LD催化乳酸酸氧化成丙酮酮酸，同時(shí)將將氫轉(zhuǎn)移給輔輔酶而成為NADH，依依條件不同而而有可逆性。。L-乳酸＋NAD+丙酮酸＋NADH＋H+pH8.8～9.8Ph7.4～7.8P169642.組織分分布

LD是一種含鋅的糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織中，以肝、心肌、腎、肌肉、RBC含量最高。LD是由兩種不同亞基（M和H）組成的四聚體，形成5種結(jié)構(gòu)不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。1.以L(fǎng)D1為主，主要在心肌，可占總LD活性50％以上，也存在于RBC內(nèi)；2.以L(fǎng)D5為主，以橫紋肌為代表，肝臟中也有；3.以L(fǎng)D3為主，存在于脾肺。一般成年人血中LD同工酶存在如下規(guī)律：LD2>LD1>LD3>LD4>LD5，部分正常兒童血中可見(jiàn)LD1>LD2。653.標(biāo)本本一般用血清，，用血漿需離離心去除血小小板（血小板板中含有大量量的LD），，采血后迅速速分離血清；；因RBC中中LD含量比比血清高100倍以上，，不宜用溶血標(biāo)標(biāo)本。LD4、LD5宜冷冷變性性，不不應(yīng)放放在冰冰箱中中，25℃放2-3d，LD活活性變變化不不大。。664.臨臨床意意義亞急性性心肌肌梗死死診斷斷有一一定價(jià)價(jià)值，，但其其特異異性差差；(1)診診斷心心臟疾疾病心肌梗梗死和和心肌肌炎時(shí)時(shí)以L(fǎng)D1和LD2升高為為主，，大多多數(shù)AMI患者者血中中會(huì)出出現(xiàn)““反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)比率率”，，即LD1>LD2；(2)診診斷肝肝臟疾疾病肝細(xì)胞胞損傷傷時(shí)常常出現(xiàn)現(xiàn)LD5>LD4;急性肝肝炎時(shí)時(shí)LD1LD2相對(duì)下下降，，LD5升高；；慢性性肝炎炎時(shí)LD5升高，，且LD1<LD3；肝硬硬化時(shí)時(shí)為L(zhǎng)D2下降和和LD5升高；；肝癌癌時(shí)LD5升高，，但LD1>LD3；(3)診診斷骨骨骼肌肌疾病病骨骼肌肌損傷傷時(shí)常常出現(xiàn)現(xiàn)LD5>LD4;P17067五、堿堿性磷磷酸酶酶及其其同工工酶堿性磷磷酸酶酶（alkalinephosphatase，ALP/AKP）1.催催化反反應(yīng)一種含含鋅的的糖蛋蛋白，，在堿堿性環(huán)環(huán)境中中（pH10.0））可以以水解解各種種天然然及人人工合合成的的磷酸酸單酯酯化合合物。。2.組組織分分布ALP廣泛泛存在在于各各組織織器官官中，，其含含量以以肝臟臟為最最多，，其次次為腎腎、胎胎盤(pán)、、小腸腸和骨骨骼等等。血血清中中的ALP主要要來(lái)自自肝臟臟和骨骨骼。。生長(zhǎng)期期兒童童血清清內(nèi)ALP主要要來(lái)自自成骨骨母細(xì)細(xì)胞和和生長(zhǎng)長(zhǎng)中的的骨軟軟骨細(xì)細(xì)胞，，少量量來(lái)自自肝。。P170683.標(biāo)標(biāo)本本空腹采采血，避免免脂肪肪餐的的影響響；樣樣品用用血清清，不能用用明顯顯溶血血標(biāo)本本；在室室溫或或冰箱箱放置置，活活性逐逐漸升升高，，可增增加5-10％％，應(yīng)應(yīng)在采采血當(dāng)當(dāng)日測(cè)測(cè)定。。4.臨床意意義很多骨骨骼疾疾病如如變形形性骨骨炎等等患者者血中中ALP升升高，，我國(guó)國(guó)常用用于早早期診診斷佝佝僂病病和軟軟骨病病。(1)診診斷骨骨骼性性疾病病(2)診斷斷肝膽膽系統(tǒng)統(tǒng)疾病病，尤尤其是是黃疸疸急性肝肝炎時(shí)時(shí)ALP增增高達(dá)達(dá)2-5ULN，肝肝硬化化、膽膽石癥癥和腫腫瘤引引起的的膽汁汁淤積積，ALP增高高達(dá)5-20ULN。90％％以上上肝外外膽道道阻塞塞患者者血清清ALP升升高，，升高高程度度和阻阻塞程程度、、病變變程度度成正正比。。P17069六、酸酸性磷磷酸酶酶及其其同工工酶酸性磷磷酸酶酶（acidphosphatase，ACP）1.催催化反反應(yīng)作用類(lèi)類(lèi)似ALP的磷磷酸酶酶（最最適pH在在7.0以以下））2.組組織織分布布ACP存在在于人人體不不同組組織，，如前前列腺腺、紅紅細(xì)胞胞、血血小板板、腎腎臟、、肝臟臟、脾脾臟、、胃、、肌肉肉及骨骨髓中中，以以前列列腺含含量最最多。。正常常男性性血清清中ACP約有有1/3-1/2來(lái)來(lái)自前前列腺腺。3.標(biāo)標(biāo)本本血清或或肝素素抗凝凝血漿漿，37℃或偏堿堿時(shí)滅滅活很很快，，pH降至至6.5以以下，，酶比比較穩(wěn)穩(wěn)定。。