CRKP碳青霉烯酶基因檢測及同源性分析

CRKP碳青毒烯酶基因檢測及同源性分析陳婭1,邱隆敏2【摘要】［摘要］目的了解某院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）碳青霉烯酶基因攜帶狀況，以及菌株間的同源性,為預(yù)防和控制CRKP的克隆傳播提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法收集2017年1—12月該院分離自臨床各科室的CRKP22株（K1~K22）,用藥敏紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法對藥敏結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，采用改良Hodge試驗(yàn)和CarbaNP試驗(yàn)檢測菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)酶菌株常見的碳青霉烯酶基因并測序，運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型（MLST）和腸桿菌科基因間一致重復(fù)序列PCR（ERIC-PCR）進(jìn)行同源性分析。結(jié)果22株CRKP對厄他培南、亞胺培南、美羅培南的耐藥率均為100%，對臨床其他常見抗菌藥物也高度耐藥；13株改良Hodge試驗(yàn)陽性，14株CarbaNP試驗(yàn)陽性。14株產(chǎn)酶菌株均攜帶KPC-2基因，K12菌株同時(shí)攜帶NDM-1基因。按MLST法可分為ST11（14株）、ST875（6株）、ST1964和ST571（各1株），按ERIC-PCR法分型可分為A型（15株）、B型（6株）及C型（1株）。分型結(jié)果相同的菌株中K1~K6同屬ICU,K7~K10同屬腦血管外科，K15~K21同屬新生兒科，對應(yīng)患者有共同住院時(shí)間，且患者存在轉(zhuǎn)科情況（K2、K8患者均由腦血管外科轉(zhuǎn)入ICU,K13、K14分別從ICU轉(zhuǎn)入血液內(nèi)科、腎內(nèi)科）。結(jié)論該院2017年存在ST11型和ST875型CRKP的克隆流行，需加強(qiáng)醫(yī)院感染預(yù)防與控制措施?！酒诳Q】中國感染控制雜志【年（卷），期】2019（018）006【總頁數(shù)】8【關(guān)鍵詞】［關(guān)鍵詞］耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌；肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶基因；同源性?論著?肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KPN)是革蘭陰性(G-)桿菌，需氧或兼性厭氧，屬于機(jī)會(huì)性病原體，廣泛分布于醫(yī)院的各種環(huán)境中，可引起患者多種組織器官的感染，常見的有血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等。B-內(nèi)酰胺類抗生素中，抗菌活性最強(qiáng)、抗菌譜最廣的是碳青霉烯類抗生素，因其只對細(xì)菌有殺傷作用，故對宿主毒性小，對頭孢菌素酶(AmpC酶)及超廣譜B-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum&-lactamases,ESBLs)作用效果穩(wěn)固，是治療大多數(shù)革蘭陽性(G+)菌、G-菌及耐藥菌感染的極佳藥物。但近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)的檢出率逐步攀升，并已在全球多個(gè)國家散發(fā)和(或)流行［1-2］。CRKP的耐藥機(jī)制極其復(fù)雜，結(jié)合各個(gè)國家和地區(qū)的研究報(bào)道［3-4］,主要包括以下四個(gè)方面：(1)產(chǎn)碳青霉烯酶；(2)高產(chǎn)AmpC酶或ESBLs，且外膜孔蛋白(outermembraneporin,OMP)缺失或者OMP表達(dá)量減少；(3)青霉素結(jié)合位點(diǎn)缺失；(4)外排泵系統(tǒng)作用等，其中以產(chǎn)碳青霉烯酶最常見和重要。本研究收集2017年1-12月某大型三甲醫(yī)院分離自臨床各科室的CRKP，檢測碳青霉烯酶基因，并進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該院2017年存在ST11型和ST875型CRKP的克隆流行，現(xiàn)報(bào)告如下。1材料與方法1.1菌株來源收集某三甲醫(yī)院2017年1—12月臨床各科室分離的CRKP22株。菌株入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)為CRKP；(2)少數(shù)患者住院期間多次培養(yǎng)出CRKP，則納入該患者首次培養(yǎng)的CRKP；(3)CRKP感染患者住院資料完整。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922（購于大連寶公司），陽性對照菌為該院2016年發(fā)現(xiàn)的并經(jīng)測序確證的產(chǎn)KPC-2型CRKP和產(chǎn)NDM-1型CRKP。1.2主要儀器和試劑VITEK2Compact分析系統(tǒng)（生物梅里埃公司），高速離心機(jī)（德國Sigma公司），PCR擴(kuò)增儀、PowerPacBasic電泳儀、GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)均為美國伯樂Bio-Rad公司產(chǎn)品，厄他培南（ETP）、亞胺培南（IPM）及美羅培南（MEM）三種10凹/片的藥敏紙片均為Oxoid公司產(chǎn)品，IPM粉劑及ETP粉劑購自杭州默沙東公司，MEM粉劑購自深圳市海濱公司，細(xì)菌蛋白提取試劑盒、M-H培養(yǎng)基、酚紅、EDTA瓊脂糖Agarose、硼酸、Tris堿、GoldViewI型核酸染色劑均為北京索來寶產(chǎn)品，ZnSO4?7H2O（上海拜力公司），引物合成（上海生工），2xTaqPCRMasterMix（北京派拓公司），DNAMarker（2000bp）（寶日醫(yī)公司）等。1.3試驗(yàn)方法1.3.1藥敏試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果判斷參照2018版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（ClinicalandLaboratoryStandardInstitute,CLSI）[5]。藥敏紙片擴(kuò)散法（K-B法）采用K-B法測定菌株對IPM、MEM及ETP三種藥敏紙片的抑菌圈直徑。微量肉湯稀釋法通過微量肉湯稀釋法測定菌株對IPM、MEM和ETP的最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration,MIC）。1.3.2碳青霉烯酶檢測改良Hodge試驗(yàn)（modifiedHodgetesting,MHT）取適量大腸埃希菌ATCC25922的菌落置于生理鹽水中，用比濁儀配制為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?:10稀釋后分別均勻涂布于3個(gè)M-H瓊脂平板，干燥3~10min后，3個(gè)平板中央分別貼IPM、MEM及ETP藥敏紙片，從平板邊緣向紙片邊緣依次劃線接種待測菌株、陽性對照及陰性對照菌，直線至少長20-25mm,需氧（35±2：TC培養(yǎng)16-20h后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：待測菌株若產(chǎn)生碳青霉烯酶（MHT陽性），則大腸埃希菌ATCC25922的抑菌環(huán)周邊和待測菌株接種線交匯處有菌株增強(qiáng)生長的情況，呈蘋果蒂現(xiàn)象。CarbaNP試驗(yàn)CarbaNPA液為取2mL0.5%的酚紅溶液加入到16.6mL的實(shí)驗(yàn)室試劑用水中，再加入180pL10mmol/L的ZnSO4溶液，使每毫升的5g/L酚紅中含0.1mmol/L的ZnSO4,使將A液pH值調(diào)至7.8±0.1,CarbaNPB液為A液+6mg/mL亞胺培南，A、B液的顏色均為紅色或橘紅色。分別在2支離心管（a管、b管）中加入100pL細(xì)菌蛋白提取試劑，2支管中分別加入1-2個(gè)菌落的待測菌（空白對照組只含細(xì)菌蛋白提取試劑，不含待測菌），渦旋振搖5s后在a管中加入100pLA液，b管中加入100pLB液，將a管和b管均置入（35±2）C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,每30min觀察一次溶液顏色是否變化。判斷結(jié)果參照2018版CLSI標(biāo)準(zhǔn)［5］。1.3.3PCR擴(kuò)增耐藥基因運(yùn)用煮沸法提取菌株DNA模板，PCR擴(kuò)增以下耐藥基因：KPC、SME、IMI、NDM-1、IMP、SIM、VIM、OXA-48，弓物序列參照相關(guān)文獻(xiàn)［6-8］，由上海生工公司合成。擴(kuò)增體系為25pL體積，包括2xPCRMasterMix12.5pL、DNA模板2pL、100pmol/L上游引物0.1pL、100pmol/L下游引物0.1pL、加PCR超純水至25pL。PCR擴(kuò)增條件：94C3min預(yù)變性，94C30s變性，退火溫度（KPC、SME、IMI、NDM-1、IMP、SIM、VIM、OXA-4859、45、47、58、50、53、54、56C）30s退火，72C1min延伸，35個(gè)循環(huán)，72C10min再延伸。取5pL的PCR產(chǎn)物加入1.2%的瓊脂糖凝膠孔中，在0.5xTBE電泳液中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。將PCR擴(kuò)增陽性的產(chǎn)物送上海生工純化并測序，測序結(jié)果用MegAlign軟件與基因庫中的序列進(jìn)行比對。1.3.4同源性分析多位點(diǎn)序列分型(multilocussequencetyping,MLST)參照MLST官方網(wǎng)站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)上提供的KPN的7個(gè)管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)序列合成引物，擴(kuò)增體系同1.3.3，擴(kuò)增條件為94°C5min預(yù)變性，94°C50s變性，50°C30s退火，72°C50s延伸，30個(gè)循環(huán)，72°C10min再延伸。PCR產(chǎn)物送上海生工公司測序，將測序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫比對，得到等位基因編碼，將所得編碼按照gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB管家基因順序組合，在MLST數(shù)據(jù)庫中對比查找完全符合的ST型。腸桿菌科基因間一致重復(fù)序列PCR(enterobacterialrepetitiveintergenicconsensus-PCR,ERIC-PCR)基因引物序列為：ERIC-1:5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC3’;ERIC-2:5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3’。擴(kuò)增體系同1.3.3，擴(kuò)增條件為94C3min預(yù)變性，94°C30s變性，55°C30s退火，72°C1min延伸，35個(gè)循環(huán)，72C10min再延伸。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：如果菌株屬于同一類型，則電泳條帶的數(shù)量和位置相同［9］。2結(jié)果2.1菌株資料22株CRKP主要分離自新生兒科及ICU，分別占31.81%、27.27%,其余為腦血管科(18.18%)、其他科室(呼吸內(nèi)科、胸外科、全科病房、血液內(nèi)科、腎內(nèi)科各占4.55%）。22例CRKP感染患者中，11例年齡260歲，6例年齡＜28d；呼吸道感染者13例；所有患者均患2種或以上基礎(chǔ)疾??；20例患者住院期間有過22項(xiàng)的侵入性操作或治療；20例患者住院期間使用抗菌藥物種類22種。見表1。2.2藥敏結(jié)果22株CRKP對ETP、IPM和MEM耐藥率均為100%，對臨床其他常見抗菌藥物也保持高度耐藥，對氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南100%耐藥，對頭孢毗肟、呋喃妥因、頭孢替坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率＞60%，對復(fù)方磺胺甲惡唑、米諾環(huán)素、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星耐藥率為36%~50%，對多粘菌素尚有較好的敏感性（敏感率75%）?；A(chǔ)疾病包括：1肺部感染，2呼吸衰竭，3AECOPD,4氣胸，5肺挫傷，6肋骨骨折，7雙側(cè)胸腔積液，8胸腔閉式引流術(shù)后，9急性呼吸窘迫綜合征，10冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，11陳舊性心肌梗死，12高血壓，13腦梗死，14腦出血，15腦疝，16重度顱腦損傷，17繼發(fā)性癲癇，18化膿性腦膜炎，19梗阻性腦積水，20帕金森綜合征，21阿爾茨海默病，22慢性腎臟病，23急性腎衰竭，24泌尿系統(tǒng)感染，25糖尿病，26重癥急性胰腺炎，27急性梗阻性化膿性膽管炎，28低蛋白血癥，29貧血，30失血性休克，31感染性休克，32膿毒血癥，33MODS,34右股骨粗隆間骨折，35左髖關(guān)節(jié)置換，36壓瘡，37早產(chǎn)兒，38低出生體重兒，39新生兒呼吸窘迫綜合癥，40先天性心臟病，41新生兒窒息，42新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，43小腸穿孔，44彌漫性腹膜炎，45新生兒高膽紅素血癥，46新生兒敗血癥，47慢性肺心病，48慢性心力衰竭，49心律失常；侵入性操作或治療包括：A氣管插管/切開，B機(jī)械通氣，C深靜脈置管，D留置導(dǎo)尿管，E留置胃管，F(xiàn)留置引流管，G使用肛管，H手術(shù)，1針灸，J胸腔穿刺術(shù)，K腹腔穿刺術(shù)，L腰椎穿刺術(shù)，M骨髓穿刺術(shù)，N使用纖維支氣管鏡，O血液透析，P血漿置換，Q輸血；抗菌藥物包括：a頭孢口夫辛鈉，b頭孢孟多酯鈉，c頭孢噻肟鈉，d頭孢他啶，e拉氧頭孢，f頭孢米諾鈉，g頭孢曲松鈉/他唑巴坦鈉，h頭孢哌酮鈉/他唑巴坦鈉，i青霉素鈉，j氟氯西林鈉，k阿莫西林鈉/克拉維酸鉀，l哌拉西林鈉/舒巴坦，m哌拉西林/他唑巴坦，n左氧氟沙星，o莫西沙星，p美羅培南，q亞胺培南/西司他丁，r萬古霉素，s替加環(huán)素，t甲硝唑，u伏立康唑，v醋酸卡泊芬凈2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果K-B法和微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示，22株CRKP對IPM、MEM及ETP均耐藥。抑菌圈直徑和MIC值見表2。2.4碳青霉烯酶檢測結(jié)果采用MHT和CarbaNP試驗(yàn)檢測CRKP碳青霉烯酶，結(jié)果MHT陽性13株(K1-K9,K11-K14),CarbaNP試驗(yàn)陽性14株(K1-K14)。見圖1。2.5PCR擴(kuò)增耐藥基因及測序結(jié)果PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶檢測陽性菌株，經(jīng)測序結(jié)果顯示，14株產(chǎn)酶菌株均攜帶KPC-2基因，K12菌株同時(shí)攜帶NDM-1基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。所有菌株均未擴(kuò)增出SME、IMI、IMP、SIM、VIM及OXA-48基因。2.6同源性分析按MLST法22株CRKP可分為ST11、ST875、ST1964和ST571四種序列型，其中K1~K14為ST11型，K15~K17和K19~K21為ST875型，K18為ST1964型，K22為ST571型，MLST結(jié)果詳見表3。按ERIC-PCR法分型可分為A、B、C三種類型，其中K1~K14及K18為A型，K15~K17和K19~K21為B型，K22為C型，見圖3。2.7菌株來源科室、住院時(shí)間及其同源性檢測結(jié)果分型結(jié)果相同的菌株中K1~K6同屬ICU，K7~K10同屬腦血管外科，其中K1與K2,K2與K3,K3與K5,K8與K9,K9與K10均有共同住院時(shí)間，K8與K9病床相連，且患者存在轉(zhuǎn)科情況，K2、K8均由腦血管外科轉(zhuǎn)入ICU,K13、K14分別從ICU轉(zhuǎn)入血液內(nèi)科、腎內(nèi)科。新生兒科K15與K16及K17均有共同住院時(shí)間，K19、K20和K21均有共同住院時(shí)間，K20與K21有共同住院時(shí)間，見表4。3討論KPN碳青霉烯酶可水解包括碳青霉烯類抗生素在類的&-內(nèi)酰胺類抗生素，如頭孢菌素類、青霉素類及單環(huán)酰胺類，導(dǎo)致菌株對多種抗菌藥物耐藥，但其不能水解頭霉素類抗生素。中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)［10］顯示，2015年KPN對MEM的耐藥率為2.90%，對IPM的耐藥率為3.00%，僅過兩年，KPN對MEM及IPM的耐藥率分別上升至24.00%、20.90%，上升幅度在5倍以上，而感染CRKP后病死率高達(dá)47.90%［11］。本研究中22株CRKP對IPM、MEM、ETP的耐藥率均達(dá)100%，對臨床其他常用的抗菌藥物也高度耐藥。建議臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)患者的癥狀和體征，并結(jié)合藥敏結(jié)果，嚴(yán)格選擇抗菌藥物，避免濫用抗菌藥物。22株CRKP中有7株分離自新生兒科，6株分離自ICU;22例患者中，11例年齡＞60歲，6例年齡＜28d;所有患者均患2種或更多基礎(chǔ)疾病，20例患者住院期間有過＞2項(xiàng)的侵入性操作或治療，20例患者住院期間使用抗菌藥物種類＞2種，提示病情重、基礎(chǔ)疾病多、免疫力低、有創(chuàng)操作和（或）無創(chuàng)操作多、長期使用抗菌藥物和（或）聯(lián)用抗菌藥物的患者可能易感染CRKP，與巴西學(xué)者Dasilva等［12］的研究結(jié)論一致。對具有上述特征的患者，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)給予高度關(guān)注，盡量避免醫(yī)院感染的發(fā)生。22株CRKP中13株從呼吸道標(biāo)本中檢出，表明細(xì)菌容易侵入呼吸道，引起呼吸系統(tǒng)感染，臨床醫(yī)生應(yīng)加強(qiáng)患者氣道管理，及時(shí)送檢標(biāo)本，爭取做到早發(fā)現(xiàn)，早防控，早治療。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)24種KPN的KPC亞型（KPC-1和KPC-2后被證實(shí)為同一型別），其中KPC-2和KPC-3是國內(nèi)夕卜最常見型別，已在全球多個(gè)國家暴發(fā)流行［13-14］。本研究中，14株產(chǎn)酶菌株均攜帶KPC-2耐藥基因，其中K12同時(shí)攜帶NDM-1基因，提示該院碳青霉烯酶基因存在多態(tài)性，但同時(shí)攜帶KPC-2及NDM-1基因的菌株表現(xiàn)出的耐藥性與其他菌株無明顯差異，可能是NDM-1基因并未表達(dá)或僅僅低表達(dá)。攜帶碳青霉烯酶耐藥基因的14株CRKP,MLST分類屬于ST11型，與中國CRKP菌株的主要流行基因型和克隆型一致［15］。該院還存在ST875型CRKP的克隆流行，此型全部分布于新生兒科，與祝俊英等［16］研究結(jié)果不同，可能與不同地區(qū)抗菌藥物使用差異有關(guān)，且新生兒科的7株CRKP產(chǎn)酶試驗(yàn)均陰性，提示可能存在其他耐藥機(jī)制。此外該院還存在ST1964和ST571兩種序列型，但尚未在該院流行。研究［17］證實(shí)，CRKP的耐藥基因可位于以下基因元件上：包括可移動(dòng)的質(zhì)粒、整合子及插入序列等，可在不同患者、病區(qū)、醫(yī)院、地區(qū)，甚至不同菌種間進(jìn)行傳播，造成大范圍的流行。本研究同源性分析發(fā)現(xiàn)，K1~K14MLST均為ST11型，ERIC-PCR分型均為A型；K15~K17和K19~K21MLST均為ST875型，ERIC-PCR分型均為B型；K22菌株在兩種同源性分析方法中均獨(dú)立成一型，分別為ST571型和C型，以上菌株兩種同源性分析方法結(jié)果一致。分型結(jié)果相同的菌株中K1~K6同屬ICU,K7~K10同屬腦血管外科，其中K1與K2,K2與K3,K3與K5,K8與K9,K9與K10均有共同住院時(shí)間，且K8與K9病床相連，K2是由腦血管外科轉(zhuǎn)入，與腦血管外科的K7有共同住院時(shí)間，K8因病情加重后轉(zhuǎn)入ICU，與ICU的K2與K3均有共同住院時(shí)間，血液內(nèi)科的K13是由ICU轉(zhuǎn)入的，與ICU的K3有共同住院時(shí)間，而腎內(nèi)科的K14是由ICU轉(zhuǎn)入的，與ICU的K3、K5均有共同住院時(shí)間，提示該院ICU、腦血管外科、腎內(nèi)科和血液內(nèi)科病區(qū)間存在ST11型CRKP的克隆傳播。新生兒科分型相同的K15~K17和K19~K21中，K15與K16及K17均有共同住院時(shí)間，K19與K20和K21均有共同住院時(shí)間，而K20與K21有共同住院時(shí)間，說明2017年該院新生兒科存在ST875型CRKP暴發(fā)流行。針對此次ST11型和ST875型CRKP在該院的暴發(fā)流行，通過及時(shí)與相關(guān)科室溝通，隔離感染患者，加強(qiáng)醫(yī)務(wù)、保潔等人員的醫(yī)院感染防控意識(shí)，加強(qiáng)手衛(wèi)生管理，及清潔和消毒床單元和共用物品，已基本控制該院CRKP的進(jìn)一步播散。近年來，CRKP在全球各地散發(fā)和(或)流行時(shí)有發(fā)生，甚至在曾經(jīng)檢出率較低的歐洲國家也出現(xiàn)了流行，對CRKP的監(jiān)測與防控仍是一項(xiàng)非常重要的工作。臨床醫(yī)生應(yīng)了解CRKP的耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)特點(diǎn)，做好醫(yī)院感染防控，減少CRKP的傳播。[參考文獻(xiàn)]TangY,ShenP,LiangW,etal.Aputativemulti-repliconplasmidcoharboringbeta-lactamasegenesblaKPC-2,blaCTX-M-14andblaTEM-1andtrimethoprimresistancegenedfrA25fromaKlebsiellapneumoniaesequencetype(ST)11straininChina[J].PLoSOne,2017,12(2):e0171339.SatlinMJ,ChenL,PatelG,etal.Multicenterclinicalandmolecularepidemiologicalanalysisofbacteremiaduetocarbape-nem-resistantenterobacteriaceae(CRE)intheCREepicenteroftheUnitedStates[J].AntimicrobAgentsChemother,2017,61(4):2349-2365.LorenzoniVV,SilvaDDC,RampelottoRF,etal.Evaluationofcarbapenem-resistantEnterobacteriaceaeinatertiary-levelreferencehospitalinRioGrandedoSul,Brazil[J].RevSocBrasMedTrop,2017,50(5):685-688.MadkourLA,SolimanMS,HassanDM,etal.Detectionofcarbapenemase-producers:eva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