基因操作完美課課件

2022/12/111基因操作第十八章2022/12/101基因操作第十八章22022/12/11第一節(jié)基因的克隆與表達(dá)第二節(jié)基因結(jié)構(gòu)分析第三節(jié)基因及基因表達(dá)的定量及定性分析第五節(jié)基因功能研究常用手段第四節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與研究策略22022/12/10第一節(jié)基因的克隆與表達(dá)第二節(jié)基因結(jié)232022/12/11基因操作技術(shù)的基本原理和步驟化學(xué)合成酶切片段RT-PCR文庫篩選目的基因載體原核、真核克隆、表達(dá)重組DNA載體原核細(xì)胞真核細(xì)胞表達(dá)生物活性蛋白構(gòu)建基因文庫序列分析體外基因突變瞬時表達(dá)定位、功能穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系遺傳修飾動物表達(dá)產(chǎn)物功能研究生產(chǎn)活性蛋白轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)染

連接32022/12/10基因操作技術(shù)的基本原理和步驟化學(xué)合成酶342022/12/11基因工程常用的工具酶酶的種類功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5'磷酸基和3'羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶I①合成雙鏈cDNA的第二條鍵②缺口平移制作高比活探針③DNA序列分析④填補3'末端反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA第一鏈多聚核苷酸激酶

催化多聚核苷酸5'羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶

在3'羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾切除末端磷酸基堿性磷酸酶42022/12/10基因工程常用的工具酶酶的種類功452022/12/11

識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，與相伴的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌防御機(jī)制——限制修飾體系（限制外源DNA，保護(hù)自身DNA）

HindⅢ流感噬血桿菌種屬d株第三種內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶命名：屬名、種名、株名限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）52022/12/10識別DNA的特異序列，并在識562022/12/11切割DNA后有粘端與平端之分或產(chǎn)生匹配末端識別位點常為回文結(jié)構(gòu)

AATGAATTCGTACCGTTACTTAAGCATGGC限制性核酸內(nèi)切酶5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’粘末端(Cohensiveendorstickyend）5’突出端EcoR15’---NCAG

CTGN---3’3’---NGTC

GACN---5’5’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’平末端Pvu2（bluntend）62022/12/10切割DNA后有粘端與平端之分或產(chǎn)生匹配672022/12/11PstI3609PvuI3735ScaI3846EcoRI4361HindIII29EcoRV185BamHI375SphI562SarI651BstZI939StyI1369PvuII2066oriTetAmprpBR322(4363bp)克隆用載體舉例rPstISalIXbaIHindIIIBamHISmaISphIoriAmprLacZPlacKpnISacIEcoRIpUC182686bppUCoriAmprSacI*BglIIPvuIIBamHIKpnINcoIXhoIEcoRIBstBIHindIIIpRSET(A,B,C)2.9kbF1oriPT7RBSATG6xHisXpressTMEpitopeEKMCSStop帶有6個組氨酸標(biāo)簽的原核細(xì)胞融合蛋白表達(dá)載體舉例pcDNA3.1-E2360bpPCMVBGHpAF1oriSV40oripUCoriSV40pANeoAmprT7loxHPmeI哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體舉例克隆用載體舉例常用基因工程載體舉例72022/12/10PstI3609PvuI37372022/12/118一、基本概念二、基因的獲取和克隆三、克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因的克隆與表達(dá)2022/12/108一、基本概念第一節(jié)基因的克隆與表達(dá)2022/12/119一、基本概念基因工程（geneticengineering）

特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)

指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)基因操作（genemanipulating）2022/12/109一、基本概念基因工程（genetic102022/12/11

指把一個生物體中的基因通過無性繁殖轉(zhuǎn)入另一個生物體內(nèi)的過程。通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆

克?。╟lone）基因克?。╣enecloning）

是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體102022/12/10指把一個生物體中的基因通過無10112022/12/11基因重組（generecombination）

是將不同基因片段連接起來構(gòu)成一個新的DNA分子的過程自然界不同生物之間的基因重組是經(jīng)常發(fā)生的人們受到啟發(fā)在20世紀(jì)70年代發(fā)展建立了體外基因重組技術(shù),可以人為的改變生物的遺傳信息胰島素、生長激素、干擾素、細(xì)胞因子及多種單克隆抗體等基因工程藥物已上市抗病、抗蟲、品質(zhì)改良的新品種種植面積大量增加，轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜的種植面積增加112022/12/10基因重組（generecombin11122022/12/11二、基因的獲取和克?。ㄒ唬┠康幕虻墨@得1.用PCR技術(shù)獲取基因2.用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-PCR）獲得基因3.從基因組文庫或cDNA文庫中獲取基因4．人工合成基因122022/12/10二、基因的獲取和克?。ㄒ唬┠康幕虻?2132022/12/11是根據(jù)DNA半保留復(fù)制和DNA聚合酶的特性建立起來的體外復(fù)制擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)1.用PCR技術(shù)獲取基因（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),

polymerasechainreaction）KaryB.Mulis1985年發(fā)明,獲1993年諾貝爾化學(xué)獎可將微量的目的DNA在體外擴(kuò)增100萬倍以上PCR技術(shù)132022/12/10是根據(jù)DNA半保留復(fù)制和DNA聚合酶13142022/12/11

由一對分別與5‘端和3’端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，合成復(fù)制模板DNA，使目的DNA得到擴(kuò)增PCR技術(shù)原理5引物A5引物B第二次循環(huán)第一次循環(huán)555555模板DNA55555555第二次循環(huán)第一次循環(huán)（接下頁）142022/12/10由一對分別與5‘端和3’端相互14152022/12/1125～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上5555555555555555第三次循環(huán)多次循環(huán)152022/12/1025～30次循環(huán)后，模板DNA的含15162022/12/11PCR反應(yīng)系統(tǒng)組分模板DNA（高溫變性）TaqDNA聚合酶（耐高溫）dNTP（底物）引物（DNA，人工合成）Mg2＋162022/12/10PCR反應(yīng)系統(tǒng)組分模板DNA（高溫變16用PCR技術(shù)獲取基因基因定向突變（site-directedmutagenesis）是進(jìn)行基因改造最常用的技術(shù)。5’---NGAATTCN---3’C．延伸，DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成指人工建立的利用體外合成或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短雙鏈RNA（21-23nt）抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù)定量或半定量分析基因時需設(shè)內(nèi)參照能在宿主細(xì)胞內(nèi)攜帶目的基因復(fù)制擴(kuò)增↓真核細(xì)胞：酵母、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞C．延伸，DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成Sanger法測定DNA序列熒光顯微鏡觀察TaqDNA聚合酶（耐高溫）長度:15-30mer（mer:核苷酸數(shù)）以mRNA為模板，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA（complementaryDNA，cDNA），再進(jìn)行的PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因關(guān)鍵技術(shù)RNA樣品的制備和電泳分離3’---NCTTAAGN---5’表達(dá)產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白，還帶有一段融合的其他的標(biāo)簽序列用于檢測和純化。表達(dá)系統(tǒng)簡單，容易操作172022/12/11模板DNA

DNA、RNA都可作模板

,如果是RNA，可以先反轉(zhuǎn)錄成cDNA再作模板。模板DNA用量為102-105拷貝,1ug人基因組DNA=3x105單拷貝用PCR技術(shù)獲取基因172022/12/10模板DNA17182022/12/11長度:15-30mer（mer:核苷酸數(shù)）(G+C)含量:40-60%,根據(jù)其含量計算退火溫度

Tm=4(G+C)+2(A+T)引物序列:一對引物之間不能有互補序列引物的3端:必須嚴(yán)格互補引物的5端:可以不嚴(yán)格,可以加酶,加標(biāo)記物,引入突變位點等引物的濃度:0.2-1umol/L特異性引物182022/12/10長度:15-30mer（mer18192022/12/11PCR的早期,用大腸桿菌DNA聚合酶I的Kleenow片段，此酶不能耐受高溫(93-95℃)，因此要不斷添加酶耐熱Taq酶來自水生棲熱菌(Thermusaquaticus),在72℃可以60核苷酸/S的速度延伸DNA鏈。其半衰期:92℃>2hr;95℃40min;97℃5minDNA聚合酶192022/12/10PCR的早期,用大腸桿菌DN19202022/12/11A．變性95℃，DNA模板變性成為單鏈，引物自身和引物間局部雙鏈消除B．退火，Tm值減-25℃，使引物與模板DNA結(jié)合互補成雙鏈C．延伸，DNA聚合酶在

72℃催化DNA的合成

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95℃延伸72℃退火Tm-5℃PCR儀25-30個循環(huán)202022/12/10A．變性95℃，DNA模板變20212022/12/11PCR的基本原理和操作程序212022/12/10PCR的基本原理和操作程序21222022/12/112.用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-PCR）獲得基因

以mRNA為模板，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA（complementaryDNA，cDNA），再進(jìn)行的PCR反應(yīng)模板為mRNA需逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)物為cDNART-PCR與PCR區(qū)別222022/12/102.用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-PCR）22232022/12/11RT-PCR的基本原理和操作程序232022/12/10RT-PCR的基本原理和操作程序23242022/12/11基因的體外突變DNA和RNA的微量分析DNA序列測定基因突變分析PCR的其他用途242022/12/10基因的體外突變PCR的其他用途24252022/12/113.從基因組文庫或cDNA文庫中獲取基因基因組文庫（genomicDNAlibrary）

含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體cDNA文庫（cDNAlibrary）含有某一組織細(xì)胞中的全部mRNA信息

基因文庫genelibrary252022/12/103.從基因組文庫或cDNA文庫中獲取25262022/12/11文庫構(gòu)建提取染色體DNA↓DNA片段↓插入適當(dāng)?shù)目寺≥d體↓轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增↓基因組文庫基因組文庫的構(gòu)建機(jī)械法或限制性內(nèi)切酶切割262022/12/10文庫構(gòu)建提取染色體DNA基因組文庫的26帶有6個組氨酸標(biāo)簽的原核細(xì)胞融合蛋白表達(dá)載體舉例●經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離由一對分別與5‘端和3’端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，合成復(fù)制模板DNA，使目的DNA得到擴(kuò)增表達(dá)產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白，還帶有一段融合的其他的標(biāo)簽序列用于檢測和純化。用PCR技術(shù)獲取基因小干擾RNA形成機(jī)理RNA酶保護(hù)試驗（RNaseprotectionassay，RPA）（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),polymerasechainreaction）nucleicacidprobe含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體原位雜交和熒光原位雜交（FISH）②缺口平移制作高比活探針指人工建立的利用體外合成或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短雙鏈RNA（21-23nt）抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù)原核細(xì)胞RNA聚合酶可以識別的啟動子從數(shù)據(jù)庫中檢索該標(biāo)志附近與該區(qū)域之中所有已

知的基因（連鎖分析或染色體分析）TheEstablishmentandApplicationofheredity-modifiedAnimalModel選出異常表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因已知蛋白質(zhì)功能和序列nucleicacidprobe自然界不同生物之間的基因重組是經(jīng)常發(fā)生的272022/12/11細(xì)胞總mRNA↓反轉(zhuǎn)錄酶

cDNA

↓插入合適載體↓轉(zhuǎn)入受體菌↓

cDNA文庫cDNA文庫的構(gòu)建帶有6個組氨酸標(biāo)簽的原核細(xì)胞融合蛋白表達(dá)載體舉例27202227282022/12/11基因文庫構(gòu)建示意圖282022/12/10基因文庫構(gòu)建示意圖28292022/12/114．人工合成基因

已知目的基因的堿基序列可用DNA合成儀合成基因片段，然后用其他反應(yīng)將基因片段連接起來優(yōu)點可修飾基因

可在基因兩端設(shè)計接頭可選擇各種宿主生物偏愛的密碼子292022/12/104．人工合成基因已知目的基因29302022/12/11用PCR技術(shù)人工合成的DNA片段302022/12/10用PCR技術(shù)人工合成的DNA片段30312022/12/11（二）目的基因克隆1.克隆載體（vector）攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子最常用的是被稱為質(zhì)粒的環(huán)狀雙鏈DNA分子能在宿主細(xì)胞內(nèi)攜帶目的基因復(fù)制擴(kuò)增有限制性內(nèi)切酶位點有篩選標(biāo)志，如抗藥基因具有單一的酶切位點作為克隆或多克隆位點質(zhì)粒載體的特點312022/12/10（二）目的基因克隆1.克隆載體（31322022/12/11Hind3Sph1Pst1Bamh1Smal1EcoR1MultipleCloningSite，MSC多克隆位點載體的分類1.按功能---克隆載體、表達(dá)載體2.按受體細(xì)胞---原核、真核3.按來源---質(zhì)粒、噬菌體、病毒PUC182686bpAmpRLacZOri質(zhì)粒載體的基本結(jié)構(gòu)322022/12/10Hind3MultipleClon32332022/12/11表達(dá)質(zhì)粒載體pET的結(jié)構(gòu)332022/12/10表達(dá)質(zhì)粒載體pET的結(jié)構(gòu)33342022/12/11目的基因克隆的基本過程342022/12/10目的基因克隆的基本過程34352022/12/11（三）目的基因的改造

基因定向突變（site-directedmutagenesis）是進(jìn)行基因改造最常用的技術(shù)。最常用方法是以雙鏈DNA為模板，經(jīng)加熱變性后，與含突變堿基的引物退火，利用PCR方法改變特定堿基，從而將突變堿基引入DNA序列中352022/12/10（三）目的基因的改造基因35362022/12/11PCR法（4引物法）設(shè)計引物分段PCR362022/12/10PCR法（4引物法）設(shè)計引物分段P36識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，與相伴的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌防御機(jī)制——限制修飾體系（限制外源DNA，保護(hù)自身DNA）利用RNaseA和RNaseT1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護(hù)的特性，分析受到保護(hù)的RNA片段的大小，估計待檢測mRNA的情況表達(dá)系統(tǒng)簡單，容易操作目的基因克隆的基本過程指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)表達(dá)系統(tǒng)簡單，容易操作特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)↓A．變性95℃，DNA模板變性成為單鏈，引物自身和引物間局部雙鏈消除發(fā)展基于RNAi原理的藥物。①合成雙鏈cDNA的第二條鍵是一種直接進(jìn)行基因定位的方法。優(yōu)點：可進(jìn)行自動化定量分析、降低假陽性指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)其半衰期:92℃>2hr;95℃40min;97℃5min含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體5’---NGAATTCN---3’研究或發(fā)現(xiàn)基因的新功能用途：鑒定RNA片段非放射性熒光標(biāo)記的DNA探針372022/12/11再次PCR獲得突變基因識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一37382022/12/11二、克隆基因的表達(dá)原核細(xì)胞：大腸桿菌真核細(xì)胞：酵母、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞1.常用表達(dá)系統(tǒng)382022/12/10二、克隆基因的表達(dá)原核細(xì)胞：大腸桿菌38392022/12/112.原核細(xì)胞表達(dá)載體pBV220、pET等,多種載體有商品化供應(yīng)原核細(xì)胞RNA聚合酶可以識別的啟動子原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄終止子原核細(xì)胞核糖體結(jié)合位點其他調(diào)控序列結(jié)構(gòu)特點克隆基因在原核生物中表達(dá)的必要條件是攜帶克隆基因的載體具備原核生物中所需要的以下表達(dá)調(diào)控序列:

392022/12/102.原核細(xì)胞表達(dá)載體pBV220、39402022/12/11表達(dá)質(zhì)粒載體pET的結(jié)構(gòu)402022/12/10表達(dá)質(zhì)粒載體pET的結(jié)構(gòu)40412022/12/11蛋白表達(dá)方式表達(dá)產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白，還帶有一段融合的其他的標(biāo)簽序列用于檢測和純化。最后應(yīng)用時，可能需要切除標(biāo)簽部分非融合表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物直接是單一目的蛋白融合表達(dá)412022/12/10蛋白表達(dá)方式表達(dá)產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋41422022/12/11原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點

表達(dá)系統(tǒng)簡單，容易操作成本低，易于大量生產(chǎn)生長周期短缺點

需要翻譯后修飾的蛋白不能用此表達(dá)系統(tǒng)422022/12/10原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點42432022/12/113.真核表達(dá)載體

主要包括質(zhì)粒載體和病毒載體，使用的調(diào)控表達(dá)元件最初多來源于病毒432022/12/103.真核表達(dá)載體主要包括質(zhì)粒載43442022/12/11真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點表達(dá)系統(tǒng)相對復(fù)雜成本高生長周期長優(yōu)點可表達(dá)需要翻譯后修飾的蛋白表達(dá)系統(tǒng)簡單缺點442022/12/10真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點表達(dá)系統(tǒng)相對44452022/12/11第二節(jié)基因結(jié)構(gòu)分析一、DNA測序二、DNA一級結(jié)構(gòu)的簡單分析452022/12/10第二節(jié)基因結(jié)構(gòu)分析一、DNA測序45462022/12/11一、DNA測序

1.Sanger法（雙脫氧末端終止法）

用4種2′,3′―雙脫氧核苷酸（ddNTP）代替部分脫氧核苷酸（dNTP）作為底物進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，從而獲得在不同部位終止反應(yīng)的大小不同的DNA鏈，經(jīng)高分辨率變性聚丙烯凝膠電泳分離，就可以對DNA序列進(jìn)行分析462022/12/10一、DNA測序

1.Sanger法（46已知目的基因的堿基序列可用DNA合成儀合成基因片段，然后用其他反應(yīng)將基因片段連接起來含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因原位雜交和熒光原位雜交（FISH）利用RNaseA和RNaseT1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護(hù)的特性，分析受到保護(hù)的RNA片段的大小，估計待檢測mRNA的情況定量或半定量分析基因時需設(shè)內(nèi)參照二、DNA一級結(jié)構(gòu)的簡單分析指人工建立的利用體外合成或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短雙鏈RNA（21-23nt）抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù)將待剔除的基因作為目的基因克隆到載體第五節(jié)基因功能研究常用手段TTACTTAAGCATGGC限制性核酸內(nèi)切酶命名：屬名、種名、株名●限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）由一對分別與5‘端和3’端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，合成復(fù)制模板DNA，使目的DNA得到擴(kuò)增↓長度:15-30mer（mer:核苷酸數(shù)）含有某一組織細(xì)胞中的全部mRNA信息PvuII2066特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)非放射性熒光標(biāo)記的DNA探針472022/12/11Sanger法測定DNA序列已知目的基因的堿基序列可用DNA合成儀合成基因片段，然后用其47482022/12/112.DNA自動化測序方法要點●基于Sanger法的基本原理●用標(biāo)記熒光染料的ddNTP●經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離●用熒光檢測儀檢測信號經(jīng)計算機(jī)分析●得到DNA分子序列482022/12/102.DNA自動化測序方法要點●48492022/12/11DNA自動測序結(jié)果舉例492022/12/10DNA自動測序結(jié)果舉例49502022/12/11二、DNA一級結(jié)構(gòu)的簡單分析主要方法●限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）

●

PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）

●

單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）502022/12/10二、DNA一級結(jié)構(gòu)的簡單分析主要方法50512022/12/11●粗略分析未知DNA片段●分析過長的DNA片段●大量篩選DNA樣本主要用途512022/12/10●粗略分析未知DNA片段51522022/12/11第三節(jié)基因及基因表達(dá)的定量及定性分析一、DNA的定性和定量分析二、RNA的定性和定量分析522022/12/10第三節(jié)基因及基因表達(dá)的定量及定性分52532022/12/11一、DNA的定性和定量分析1.Southern印跡（Southernblot）2.基因組PCR反應(yīng)3.熒光原位雜交532022/12/10一、DNA的定性和定量分析1.So53542022/12/11原理:

核酸分子雜交的堿基互補配對用途:

鑒定DNA片段步驟:

DNA分離→DNA變性→轉(zhuǎn)膜→雜交→洗膜→放射自顯影關(guān)鍵技術(shù):

核酸探針標(biāo)記和DNA的轉(zhuǎn)移。1.Southern印跡（Southernblot），DNA印跡542022/12/10原理:核酸分子雜交的堿54552022/12/11

在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)552022/12/10在DNA復(fù)性過程中，如果把不55562022/12/11核酸探針的標(biāo)記562022/12/10核酸探針的標(biāo)記56計算出模板DNA或mRNA的含量細(xì)胞內(nèi)異常雙鏈RNA→激活Dicer→短雙鏈RNA（21～23nt）→RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物→兩個可互補的單鏈RNA→與靶RNA互補結(jié)合→切割靶RNA→小干擾RNAPCR的基本反應(yīng)步驟表達(dá)系統(tǒng)簡單，容易操作帶有6個組氨酸標(biāo)簽的原核細(xì)胞融合蛋白表達(dá)載體舉例遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用成本低，易于大量生產(chǎn)基因組文庫（genomicDNAlibrary）基因工程（geneticengineering）DNA和RNA的微量分析最后應(yīng)用時，可能需要切除標(biāo)簽部分二、DNA一級結(jié)構(gòu)的簡單分析基因定向突變（site-directedmutagenesis）是進(jìn)行基因改造最常用的技術(shù)。●限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）Sanger法測定DNA序列細(xì)胞內(nèi)異常雙鏈RNA→激活Dicer→短雙鏈RNA（21～23nt）→RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物→兩個可互補的單鏈RNA→與靶RNA互補結(jié)合→切割靶RNA→小干擾RNA模板行PCR擴(kuò)增→電泳→檢測基因的表達(dá)量指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)計算出模板DNA或mRNA的含量可選擇各種宿主生物偏愛的密碼子572022/12/11探針種類

cDNA探針基因組DNA探針寡核苷酸探針和RNA探針探針標(biāo)記方法

化學(xué)法酶促法核酸探針的標(biāo)記nucleicacidprobe計算出模板DNA或mRNA的含量572022/12/10探針57582022/12/11①酶切與電泳③雜交與放射自顯影②DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜Southern印跡操作步驟582022/12/10①酶切與電泳③雜交與放射自顯影58592022/12/11Southern印跡技術(shù)的用途基因定位分析基因酶切圖譜分析基因突變分析基因重排592022/12/10Southern印跡技術(shù)的用途基因定59602022/12/112.基因組PCR反應(yīng)用途定性分析特定基因在基因組中存在與否定量或半定量分析優(yōu)點

靈敏度高缺點

容易出現(xiàn)假陽性定量或半定量分析基因時需設(shè)內(nèi)參照

602022/12/102.基因組PCR反應(yīng)用途60612022/12/113.熒光原位雜交優(yōu)點

非放射性熒光標(biāo)記的DNA探針探針特異性高,靈敏度好熒光顯微鏡觀察成本低一次可檢測多個基因

是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進(jìn)行檢測的技術(shù)612022/12/103.熒光原位雜交優(yōu)點是一種利用61622022/12/11二、RNA的定性與定量1.Northern印跡2.RT-PCR3.實時PCR4.RNA酶保護(hù)試驗5.芯片技術(shù)622022/12/10二、RNA的定性與定量1.North62632022/12/11原理：

與Southern印跡相同用途：

鑒定RNA片段步驟

與Southern類似關(guān)鍵技術(shù)

RNA樣品的制備和電泳分離

1.Northern印跡，RNA印跡632022/12/10原理：與Southern印跡63642022/12/11三種印跡技術(shù)的比較642022/12/10三種印跡技術(shù)的比較64652022/12/112.RT-PCR用途：

定量檢測基因的表達(dá)情況步驟：提取總RNA→逆轉(zhuǎn)錄成cDNA→以cDNA為模板行PCR擴(kuò)增→電泳→檢測基因的表達(dá)量關(guān)鍵點：提取的總RNA的質(zhì)量652022/12/102.RT-PCR用途：

定量65662022/12/113.實時PCR（realtimeRT-PCR）原理：根據(jù)熒光染料形成特異性熒光信號的強度，計算出模板DNA或mRNA的含量用途：

定量分析mRNA或DNA優(yōu)點：可進(jìn)行自動化定量分析、降低假陽性662022/12/103.實時PCR（realtime66672022/12/11實時PCR的基本原理672022/12/10實時PCR的基本原理67682022/12/11實時PCR的基本過程682022/12/10實時PCR的基本過程68692022/12/114.RNA酶保護(hù)試驗（RNaseprotectionassay，RPA）原理

利用RNaseA和RNaseT1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護(hù)的特性，分析受到保護(hù)的RNA片段的大小，估計待檢測mRNA的情況用途mRNA定量mRNA末端定位mRNA剪切部位內(nèi)含子位置的確定692022/12/104.RNA酶保護(hù)試驗（RNasep69702022/12/115.芯片技術(shù)類別

基因組芯片表達(dá)芯片（cDNA芯片）測序芯片

用途

表達(dá)芯片↘定量分析RNA

測序芯片↗702022/12/105.芯片技術(shù)類別基因組70712022/12/11基因芯片使用流程712022/12/10基因芯片使用流程71722022/12/11第四節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與研究策略一、定位克隆策略二、功能克隆策略三、表型克隆策略722022/12/10第四節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與研究策略72732022/12/11一、定位克隆策略

表現(xiàn)型(包括疾病)

↓

對應(yīng)的基因組區(qū)域

↓建立結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄圖

↓選出異常表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因

↓確定這些基因與疾病的關(guān)系732022/12/10一、定位克隆策略73742022/12/11定位候選克隆

大量定位克隆的基因序列已知（HGP的完成）

↓從數(shù)據(jù)庫中檢索該標(biāo)志附近與該區(qū)域之中所有已

知的基因（連鎖分析或染色體分析）

↓

用已知基因進(jìn)行致病改變的篩選.HGP：人類基因組計劃742022/12/10定位候選克隆大量定位克隆的基因74752022/12/11基因定位的基本方法體細(xì)胞雜交法將來源不同(人與鼠)的兩種細(xì)胞融合成1個新細(xì)胞。在融合過程中人類染色體逐漸丟失，最后只剩條或數(shù)條，即可定位基因752022/12/10基因定位的基本方法體細(xì)胞雜交法75762022/12/11原位雜交和熒光原位雜交（FISH）

是一種直接進(jìn)行基因定位的方法。例如用此法已經(jīng)將人α及β珠蛋白基因分別定位于第16號和第11號染色體上762022/12/10原位雜交和熒光原位雜交（FISH）76識別特異序列，切割DNA真核細(xì)胞：酵母、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞基因剔除小鼠建立流程示意圖以mRNA為模板，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA（complementaryDNA，cDNA），再進(jìn)行的PCR反應(yīng)基因組DNA探針研究或發(fā)現(xiàn)基因的新功能3’---NGTCGACN---5’最常用的是被稱為質(zhì)粒的環(huán)狀雙鏈DNA分子DNA自動測序結(jié)果舉例按受體細(xì)胞---原核、真核含有某一組織細(xì)胞中的全部mRNA信息帶有6個組氨酸標(biāo)簽的原核細(xì)胞融合蛋白表達(dá)載體舉例二、DNA一級結(jié)構(gòu)的簡單分析定性分析特定基因在基因組中存在與否（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),polymerasechainreaction）長度:15-30mer（mer:核苷酸數(shù)）外源基因通過轉(zhuǎn)基因過程插入到細(xì)胞的染色體中，使其在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，成為可以表達(dá)該外源基因的特定細(xì)胞株二、DNA一級結(jié)構(gòu)的簡單分析應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點進(jìn)行定位位點等772022/12/11連鎖分析

應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點進(jìn)行定位識別特異序列，切割DNA772022/12/10連鎖分析77782022/12/11定位克隆的基本程序繪制目的區(qū)域的物理圖譜疾病相關(guān)基因的確定①②782022/12/10定位克隆的基本程序繪制目的區(qū)域的物理78792022/12/11二、功能克隆策略

已知蛋白質(zhì)功能和序列

↓設(shè)計出核酸探針

↓獲得相應(yīng)遺傳病的致病基因

↓篩選特定的文庫792022/12/10二、功能克隆策略79802022/12/11三、表型克隆策略

從疾病的表型出發(fā)，比較疾病DNA與正常DNA水平上的不同，直接對產(chǎn)生變異的DNA片段進(jìn)行克隆，而不依賴于基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的信息802022/12/10三、表型克隆策略從疾病的表型80812022/12/11第五節(jié)基因功能研究常用手段一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)二、基因剔除技術(shù)三、基因沉默技術(shù)812022/12/10第五節(jié)基因功能研究常用手段一、轉(zhuǎn)基81822022/12/11遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofheredity-modifiedAnimalModel822022/12/10遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用The82832022/12/11轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）

——目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)

采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體832022/12/10轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因一、轉(zhuǎn)基因83842022/12/11建立轉(zhuǎn)基因動物的基本流程842022/12/10建立轉(zhuǎn)基因動物的基本流程84852022/12/11轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用研究特定基因在組織中特異表達(dá)研究或發(fā)現(xiàn)基因的新功能研究在胚胎期表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)和功能建立外源基因表達(dá)、調(diào)控的動物模型遺傳性疾病的研究探討生殖細(xì)胞的基因治療方法動物新品種的培育病毒性疾病的研究基因工程產(chǎn)品的制備852022/12/10轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用研究特定基因在組織中85862022/12/11細(xì)胞水平轉(zhuǎn)基因

外源基因通過轉(zhuǎn)基因過程插入到細(xì)胞的染色體中，使其在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，成為可以表達(dá)該外源基因的特定細(xì)胞株基本過程

外源基因片段克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒中→用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞→克隆化篩選→轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)→蛋白質(zhì)的提取和鑒定基因功能的研究細(xì)胞模型獲得外源基因產(chǎn)物主要用途862022/12/10細(xì)胞水平轉(zhuǎn)基因外源基因通過轉(zhuǎn)86872022/12/11二、基因剔除技術(shù)

指通過基因同源重組的過程定向地在活細(xì)胞中從基因組上移除特定基因的技術(shù)

基因靶向(genetargeting)滅活872022/12/10二、基因剔除技術(shù)指通過基因87882022/12/11基因剔除載體的構(gòu)建

將待剔除的基因作為目的基因克隆到載體

↓將一陽性篩選標(biāo)志基因插入到目的基因的中段

↓線性化重組載體，將一個陰性篩選標(biāo)志基因克隆此處

882022/12/10基因剔除載體的構(gòu)建將待剔除的基因作88892022/12/11基因剔除載體的構(gòu)建892022/12/10基因剔除載體的構(gòu)建89902022/12/11基因剔除小鼠建立流程示意圖902022/12/10基因剔除小鼠建立流程示意圖90912022/12/11三、基因沉默技術(shù)1.反義技術(shù)（antisense）根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計針對特定靶序列的反義核酸，從而抑制特定基因的表達(dá)類別反義RNA反義DNA核酶（ribozyme）912022/12/10三、基因沉默技術(shù)1.反義技術(shù)（ant91922022/12/112.RNA干涉（RNAinterference，RNAi）指由短雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源RNA降解的過程RNAi技術(shù)

指人工建立的利用體外合成或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短雙鏈RNA（21-23nt）抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù)922022/12/102.RNA干涉（RNAinterf92932022/12/11小干擾RNA形成機(jī)理

細(xì)胞內(nèi)異常雙鏈RNA→激活Dicer→

短雙鏈RNA（21～23nt）→RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物→兩個可互補的單鏈RNA→與靶RNA互補結(jié)合→切割靶RNA→小干擾RNA932022/12/10小干擾RNA形成機(jī)理

細(xì)胞93942022/12/11小干擾RNA形成機(jī)理示意圖

942022/12/10小干擾RNA形成機(jī)理示意圖94952022/12/11

過程

確定干擾靶點→合成siRNA→siRNA對目標(biāo)RNA的干擾。

應(yīng)用

篩選藥物靶點。發(fā)展基于RNAi原理的藥物。

952022/12/10

過程95962022/12/11基因操作知識點一覽圖962022/12/10基因操作知識點一覽圖96972022/12/11Hind3Sph1Pst1Bamh1Smal1EcoR1MultipleCloningSite，MSC多克隆位點載體的分類1.按功能---克隆載體、表達(dá)載體2.按受體細(xì)胞---原核、真核3.按來源---質(zhì)粒、噬菌體、病毒PUC182686bpAmpRLacZOri質(zhì)粒載體的基本結(jié)構(gòu)972022/12/10Hind3MultipleClon97982022/12/11二、克隆基因的表達(dá)原核細(xì)胞：大腸桿菌真核細(xì)胞：酵母、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞1.常用表達(dá)系統(tǒng)982022/12/10二、克隆基因的表達(dá)原核細(xì)胞：大腸桿菌98992022/12/11第二節(jié)基因結(jié)構(gòu)分析一、DNA測序二、DNA一級結(jié)構(gòu)的簡單分析992022/12/10第二節(jié)基因結(jié)構(gòu)分析一、DNA測序991002022/12/113.熒光原位雜交優(yōu)點

非放射性熒光標(biāo)記的DNA探針探針特異性高,靈敏度好熒光顯微鏡觀察成本低一次可檢測多個基因

是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進(jìn)行檢測的技術(shù)1002022/12/103.熒光原位雜交優(yōu)點是一種利1001012022/12/11連鎖分析

應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點進(jìn)行定位1012022/12/10連鎖分析應(yīng)用被定位的基因1011022022/12/11連鎖分析

應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點進(jìn)行定位1022022/12/10連鎖分析應(yīng)用被定位的基因1021032022/12/11細(xì)胞水平轉(zhuǎn)基因

外源基因通過轉(zhuǎn)基因過程插入到細(xì)胞的染色體中，使其在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，成為可以表達(dá)該外源基因的特定細(xì)胞株基本過程

外源基因片段克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒中→用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞→克隆化篩選→轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)→蛋白質(zhì)的提取和鑒定基因功能的研究細(xì)胞模型獲得外源基因產(chǎn)物主要用途1032022/12/10細(xì)胞水平轉(zhuǎn)基因外源基因通過1031042022/12/11

過程

確定干擾靶點→合成siRNA→siRNA對目標(biāo)RNA的干擾。

應(yīng)用

篩選藥物靶點。發(fā)展基于RNAi原理的藥物。

1042022/12/10

過程1042022/12/11105基因操作第十八章2022/12/101基因操作第十八章1062022/12/11第一節(jié)基因的克隆與表達(dá)第二節(jié)基因結(jié)構(gòu)分析第三節(jié)基因及基因表達(dá)的定量及定性分析第五節(jié)基因功能研究常用手段第四節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與研究策略22022/12/10第一節(jié)基因的克隆與表達(dá)第二節(jié)基因結(jié)1061072022/12/11基因操作技術(shù)的基本原理和步驟化學(xué)合成酶切片段RT-PCR文庫篩選目的基因載體原核、真核克隆、表達(dá)重組DNA載體原核細(xì)胞真核細(xì)胞表達(dá)生物活性蛋白構(gòu)建基因文庫序列分析體外基因突變瞬時表達(dá)定位、功能穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系遺傳修飾動物表達(dá)產(chǎn)物功能研究生產(chǎn)活性蛋白轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)染

連接32022/12/10基因操作技術(shù)的基本原理和步驟化學(xué)合成酶1071082022/12/11基因工程常用的工具酶酶的種類功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5'磷酸基和3'羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶I①合成雙鏈cDNA的第二條鍵②缺口平移制作高比活探針③DNA序列分析④填補3'末端反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA第一鏈多聚核苷酸激酶

催化多聚核苷酸5'羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶

在3'羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾切除末端磷酸基堿性磷酸酶42022/12/10基因工程常用的工具酶酶的種類功1081092022/12/11

識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，與相伴的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌防御機(jī)制——限制修飾體系（限制外源DNA，保護(hù)自身DNA）

HindⅢ流感噬血桿菌種屬d株第三種內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶命名：屬名、種名、株名限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）52022/12/10識別DNA的特異序列，并在識1091102022/12/11切割DNA后有粘端與平端之分或產(chǎn)生匹配末端識別位點常為回文結(jié)構(gòu)

AATGAATTCGTACCGTTACTTAAGCATGGC限制性核酸內(nèi)切酶5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’粘末端(Cohensiveendorstickyend）5’突出端EcoR15’---NCAG

CTGN---3’3’---NGTC

GACN---5’5’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’平末端Pvu2（bluntend）62022/12/10切割DNA后有粘端與平端之分或產(chǎn)生匹配1101112022/12/11PstI3609PvuI3735ScaI3846EcoRI4361HindIII29EcoRV185BamHI375SphI562SarI651BstZI939StyI1369PvuII2066oriTetAmprpBR322(4363bp)克隆用載體舉例rPstISalIXbaIHindIIIBamHISmaISphIoriAmprLacZPlacKpnISacIEcoRIpUC182686bppUCoriAmprSacI*BglIIPvuIIBamHIKpnINcoIXhoIEcoRIBstBIHindIIIpRSET(A,B,C)2.9kbF1oriPT7RBSATG6xHisXpressTMEpitopeEKMCSStop帶有6個組氨酸標(biāo)簽的原核細(xì)胞融合蛋白表達(dá)載體舉例pcDNA3.1-E2360bpPCMVBGHpAF1oriSV40oripUCoriSV40pANeoAmprT7loxHPmeI哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體舉例克隆用載體舉例常用基因工程載體舉例72022/12/10PstI3609PvuI3731112022/12/11112一、基本概念二、基因的獲取和克隆三、克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因的克隆與表達(dá)2022/12/108一、基本概念第一節(jié)基因的克隆與表達(dá)2022/12/11113一、基本概念基因工程（geneticengineering）

特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)

指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)基因操作（genemanipulating）2022/12/109一、基本概念基因工程（genetic1142022/12/11

指把一個生物體中的基因通過無性繁殖轉(zhuǎn)入另一個生物體內(nèi)的過程。通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆

克?。╟lone）基因克?。╣enecloning）

是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體102022/12/10指把一個生物體中的基因通過無1141152022/12/11基因重組（generecombination）

是將不同基因片段連接起來構(gòu)成一個新的DNA分子的過程自然界不同生物之間的基因重組是經(jīng)常發(fā)生的人們受到啟發(fā)在20世紀(jì)70年代發(fā)展建立了體外基因重組技術(shù),可以人為的改變生物的遺傳信息胰島素、生長激素、干擾素、細(xì)胞因子及多種單克隆抗體等基因工程藥物已上市抗病、抗蟲、品質(zhì)改良的新品種種植面積大量增加，轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜的種植面積增加112022/12/10基因重組（generecombin1151162022/12/11二、基因的獲取和克?。ㄒ唬┠康幕虻墨@得1.用PCR技術(shù)獲取基因2.用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-PCR）獲得基因3.從基因組文庫或cDNA文庫中獲取基因4．人工合成基因122022/12/10二、基因的獲取和克隆（一）目的基因的1161172022/12/11是根據(jù)DNA半保留復(fù)制和DNA聚合酶的特性建立起來的體外復(fù)制擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)1.用PCR技術(shù)獲取基因（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),

polymerasechainreaction）KaryB.Mulis1985年發(fā)明,獲1993年諾貝爾化學(xué)獎可將微量的目的DNA在體外擴(kuò)增100萬倍以上PCR技術(shù)132022/12/10是根據(jù)DNA半保留復(fù)制和DNA聚合酶1171182022/12/11

由一對分別與5‘端和3’端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，合成復(fù)制模板DNA，使目的DNA得到擴(kuò)增PCR技術(shù)原理5引物A5引物B第二次循環(huán)第一次循環(huán)555555模板DNA55555555第二次循環(huán)第一次循環(huán)（接下頁）142022/12/10由一對分別與5‘端和3’端相互1181192022/12/1125～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上5555555555555555第三次循環(huán)多次循環(huán)152022/12/1025～30次循環(huán)后，模板DNA的含1191202022/12/11PCR反應(yīng)系統(tǒng)組分模板DNA（高溫變性）TaqDNA聚合酶（耐高溫）dNTP（底物）引物（DNA，人工合成）Mg2＋162022/12/10PCR反應(yīng)系統(tǒng)組分模板DNA（高溫變120用PCR技術(shù)獲取基因基因定向突變（site-directedmutagenesis）是進(jìn)行基因改造最常用的技術(shù)。5’---NGAATTCN---3’C．延伸，DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成指人工建立的利用體外合成或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短雙鏈RNA（21-23nt）抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù)定量或半定量分析基因時需設(shè)內(nèi)參照能在宿主細(xì)胞內(nèi)攜帶目的基因復(fù)制擴(kuò)增↓真核細(xì)胞：酵母、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞C．延伸，DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成Sanger法測定DNA序列熒光顯微鏡觀察TaqDNA聚合酶（耐高溫）長度:15-30mer（mer:核苷酸數(shù)）以mRNA為模板，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA（complementaryDNA，cDNA），再進(jìn)行的PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因關(guān)鍵技術(shù)RNA樣品的制備和電泳分離3’---NCTTAAGN---5’表達(dá)產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白，還帶有一段融合的其他的標(biāo)簽序列用于檢測和純化。表達(dá)系統(tǒng)簡單，容易操作1212022/12/11模板DNA

DNA、RNA都可作模板

,如果是RNA，可以先反轉(zhuǎn)錄成cDNA再作模板。模板DNA用量為102-105拷貝,1ug人基因組DNA=3x105單拷貝用PCR技術(shù)獲取基因172022/12/10模板DNA1211222022/12/11長度:15-30mer（mer:核苷酸數(shù)）(G+C)含量:40-60%,根據(jù)其含量計算退火溫度

Tm=4(G+C)+2(A+T)引物序列:一對引物之間不能有互補序列引物的3端:必須嚴(yán)格互補引物的5端:可以不嚴(yán)格,可以加酶,加標(biāo)記物,引入突變位點等引物的濃度:0.2-1umol/L特異性引物182022/12/10長度:15-30mer（mer1221232022/12/11PCR的早期,用大腸桿菌DNA聚合酶I的Kleenow片段，此酶不能耐受高溫(93-95℃)，因此要不斷添加酶耐熱Taq酶來自水生棲熱菌(Thermusaquaticus),在72℃可以60核苷酸/S的速度延伸DNA鏈。其半衰期:92℃>2hr;95℃40min;97℃5minDNA聚合酶192022/12/10PCR的早期,用大腸桿菌DN1231242022/12/11A．變性95℃，DNA模板變性成為單鏈，引物自身和引物間局部雙鏈消除B．退火，Tm值減-25℃，使引物與模板DNA結(jié)合互補成雙鏈C．延伸，DNA聚合酶在

72℃催化DNA的合成

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95℃延伸72℃退火Tm-5℃PCR儀25-30個循環(huán)202022/12/10A．變性95℃，DNA模板變1241252022/12/11PCR的基本原理和操作程序212022/12/10PCR的基本原理和操作程序1251262022/12/112.用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-PCR）獲得基因

以mRNA為模板，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA（complementaryDNA，cDNA），再進(jìn)行的PCR反應(yīng)模板為mRNA需逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)物為cDNART-PCR與PCR區(qū)別222022/12/102.用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-PCR）1261272022/12/11RT-PCR的基本原理和操作程序232022/12/10RT-PCR的基本原理和操作程序1271282022/12/11基因的體外突變DNA和RNA的微量分析DNA序列測定基因突變分析PCR的其他用途242022/12/10基因的體外突變PCR的其他用途1281292022/12/113.從基因組文庫或cDNA文庫中獲取基因基因組文庫（genomicDNAlibrary）

含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體cDNA文庫（cDNAlibrary）含有某一組織細(xì)胞中的全部mRNA信息

基因文庫genelibrary252022/12/103.從基因組文庫或cDNA文庫中獲取1291302022/12/11文庫構(gòu)建提取染色體DNA↓DNA片段↓插入適當(dāng)?shù)目寺≥d體↓轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增↓基因組文庫基因組文庫的構(gòu)建機(jī)械法或限制性內(nèi)切酶切割262022/12/10文庫構(gòu)建提取染色體DNA基因組文庫的130帶有6個組氨酸標(biāo)簽的原核細(xì)胞融合蛋白表達(dá)載體舉例●經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離由一對分別與5‘端和3’端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，合成復(fù)制模板DNA，使目的DNA得到擴(kuò)增表達(dá)產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白，還帶有一段融合的其他的標(biāo)簽序列用于檢測和純化。用PCR技術(shù)獲取基因小干擾RNA形成機(jī)理RNA酶保護(hù)試驗（RNaseprotectionassay，RPA）（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),polymerasechainreaction）nucleicacidprobe含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體原位雜交和熒光原位雜交（FISH）②缺口平移制作高比活探針指人工建立的利用體外合成或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短雙鏈RNA（21-23nt）抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù)原核細(xì)胞RNA聚合酶可以識別的啟動子從數(shù)據(jù)庫中檢索該標(biāo)志附近與該區(qū)域之中所有已

知的基因（連鎖分析或染色體分析）TheEstablishmentandApplicationofheredity-modifiedAnimalModel選出異常表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因已知蛋白質(zhì)功能和序列nucleicacidprobe自然界不同生物之間的基因重組是經(jīng)常發(fā)生的1312022/12/11細(xì)胞總mRNA↓反轉(zhuǎn)錄酶

cDNA

↓插入合適載體↓轉(zhuǎn)入受體菌↓

cDNA文庫cDNA文庫的構(gòu)建帶有6個組氨酸標(biāo)簽的原核細(xì)胞融合蛋白表達(dá)載體舉例2720221311322022/12/11基因文庫構(gòu)建示意圖282022/12/10基因文庫構(gòu)建示意圖1321332022/12/114．人工合成基因

已知目的基因的堿基序列可用DNA合成儀合成基因片段，然后用其他反應(yīng)將基因片段連接起來優(yōu)點可修飾基因

可在基因兩端設(shè)計接頭可選擇各種宿主生物偏愛的密碼子292022/12/104．人工合成基因已知目的基因1331342022/12/11用PCR技術(shù)人工合成的DNA片段302022/12/10用PCR技術(shù)人工合成的DNA片段1341352022/12/11（二）目的基因克隆1.克隆載體（vector）攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子最常用的是被稱為質(zhì)粒的環(huán)狀雙鏈DNA分子能在宿主細(xì)胞內(nèi)攜帶目的基因復(fù)制擴(kuò)增有限制性內(nèi)切酶位點有篩選標(biāo)志，如抗藥基因具有單一的酶切位點作為克隆或多克隆位點質(zhì)粒載體的特點312022/12/10（二）目的基因克隆1.克隆載體（1351362022/12/11Hind3Sph1Pst1Bamh1Smal1EcoR1MultipleCloningSite，MSC多克隆位點載體的分類1.按功能---克隆載體、表達(dá)載體2.按受體細(xì)胞---原核、真核3.按來源---質(zhì)粒、噬菌體、病毒PUC182686bpAmpRLacZOri質(zhì)粒載體的基本結(jié)構(gòu)322022/12/10Hind3MultipleClon1361372022/12/11表達(dá)質(zhì)粒載體pET的結(jié)構(gòu)332022/12/10表達(dá)質(zhì)粒載體pET的結(jié)構(gòu)1371382022/12/11目的基因克隆的基本過程342022/12/10目的基因克隆的基本過程1381392022/12/11（三）目的基因的改造

基因定向突變（site-directedmutagenesis）是進(jìn)行基因改造最常用的技術(shù)。最常用方法是以雙鏈DNA為模板，經(jīng)加熱變性后，與含突變堿基的引物退火，利用PCR方法改變特定堿基，從而將突變堿基引入DNA序列中352022/12/10（三）目的基因的改造基因1391402022/12/11PCR法（4引物法）設(shè)計引物分段PCR362022/12/10PCR法（4引物法）設(shè)計引物分段P140識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，與相伴的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌防御機(jī)制——限制修飾體系（限制外源DNA，保護(hù)自身DNA）利用RNaseA和RNaseT1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護(hù)的特性，分析受到保護(hù)的RNA片段的大小，估計待檢測mRNA的情況表達(dá)系統(tǒng)簡單，容易操作目的基因克隆的基本過程指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)表達(dá)系統(tǒng)簡單，容易操作特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項技術(shù)↓A．變性95℃，DNA模板變性成為單鏈，引物自身和引物間局部雙鏈消除發(fā)展基于RNAi原理的藥物。①合成雙鏈cDNA的第二條鍵是一種直接進(jìn)行基因定位的方法。優(yōu)點：可進(jìn)行自動化定量分析、降低假陽性指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)其半衰期:92℃>2hr;95℃40min;97℃5min含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體5’---NGAATTCN---3’研究或發(fā)現(xiàn)基因的新功能用途：