臨床不孕癥相關(guān)的自身抗體檢測(cè)及應(yīng)用

臨床不孕癥相關(guān)的自身抗體檢測(cè)及應(yīng)用隨著人們生存環(huán)境和生活方式的改變，不孕不育已成為臨床常見的疾病之一，自20世紀(jì)80年代以來發(fā)病率增加了4%，我國約有10%~15%的已婚夫婦患有不孕不育［1］。其病因非常復(fù)雜，主要包括生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變、性激素分泌紊亂、免疫學(xué)異常等，其中輸卵管和卵巢等生殖系統(tǒng)器官組織病變是不孕不育的重要致病因素。對(duì)于此類病因，臨床可通過影像學(xué)及宮腔鏡等方式確診并治療，然而免疫學(xué)因素在不孕不育診治及監(jiān)測(cè)上的作用往往被忽視。近年來隨著生殖免疫技術(shù)的不斷發(fā)展，多種生殖免疫相關(guān)抗體被發(fā)現(xiàn)，這些抗體對(duì)于臨床不孕不育的診斷和治療有著至關(guān)重要的作用。首先，受精過程極其復(fù)雜，精子射入陰道后進(jìn)入輸卵管腔，精子頂體表面糖蛋白被生殖道分泌物中的α、β淀粉酶降解，同時(shí)頂體膜中的膽固醇與磷脂比率及膜電位發(fā)生變化，降低頂體膜的穩(wěn)定性，使精子獲能；獲能的精子運(yùn)行到輸卵管壺腹部與卵子相遇，精子釋放頂體酶，溶解卵子外圍的放射冠和透明帶，穿過透明帶的精子外膜與卵子胞膜接觸并融合，使精子進(jìn)入卵子內(nèi)，形成受精卵。受精卵不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，同時(shí)借助輸卵管蠕動(dòng)和輸卵管上皮纖毛推動(dòng)向?qū)m腔方向移動(dòng)，并逐漸埋入子宮內(nèi)膜，發(fā)育成正常的胎兒。我們將從卵子發(fā)育、受精和著床方面闡述不孕癥相關(guān)抗體。一、卵子發(fā)育階段卵巢為女性的性腺，其主要功能為產(chǎn)生卵子和分泌女性激素，同時(shí)具備生殖功能和內(nèi)分泌功能。在卵巢中，卵泡自胚胎形成后即進(jìn)入自主發(fā)育和閉鎖的軌道，進(jìn)入青春期后，卵泡由自主發(fā)育至發(fā)育成熟的過程依賴于促性腺激素，此過程中產(chǎn)生抗體，如抗卵巢抗體、抗絨毛膜促性腺激素抗體等均會(huì)影響卵子的形成與發(fā)育，從根本上導(dǎo)致不孕癥。（一）抗卵巢抗體（anti-ovarianantibodies，AoAb）卵巢具有生殖和內(nèi)分泌功能，同時(shí)受到神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及免疫系統(tǒng)的影響。機(jī)體免疫功能異?？烧T發(fā)卵巢自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗卵巢抗體，使卵泡發(fā)育障礙，從而引起不孕不育。Kad?o?lu等［2］通過對(duì)62例體外受精的不孕癥患者的研究發(fā)現(xiàn)，體外受精患者血清AoAb水平明顯高于正常生育對(duì)照組，表明AoAb與體外受精失敗患者的不孕癥有關(guān)。另外，Ko?ir和Poga?nik［3］的研究表明抗卵巢抗體的存在與細(xì)胞免疫異常等自身免疫機(jī)制可能是原發(fā)性卵巢功能不全的病因。最后，有研究表明，采用人源卵巢抗原，以膠體金顆粒結(jié)合的羊抗人IgG為標(biāo)記抗體，根據(jù)免疫膠體金技術(shù)原理，建立免疫膠體金滲透技術(shù)法檢測(cè)AoAb。通過分別檢測(cè)72份AoAb陽性血清和88份健康體檢女性血清，并與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示與ELISA的結(jié)果對(duì)比，其敏感度為86.11%，特異度為90.91%，免疫膠體金滲透技術(shù)測(cè)定AoAb具有穩(wěn)定性和特異性［4］。由此可見免疫膠體金滲透技術(shù)可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定AoAb，便于推廣普及。（二）抗絨毛膜促性腺激素抗體（anti-humanchorionicgonadotrophinantibody，AhCGAb）人絨毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotrophin，hCG）是一種由合體細(xì)胞滋養(yǎng)層分泌的糖蛋白激素，含有92個(gè)氨基酸的α亞基和145個(gè)氨基酸的β亞基。β亞基具有特異性，并有一組類似于轉(zhuǎn)化生長因子β的序列。這種相似性表明hCG與某些癌癥的發(fā)生和母體子宮內(nèi)膜的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲有關(guān)［5］。hCG作為免疫調(diào)節(jié)劑，通過蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、子宮自然殺傷細(xì)胞增殖、刺激子宮內(nèi)膜血管生成和黃體維持孕酮分泌來促進(jìn)著床［6］，對(duì)于卵子發(fā)育必不可少。一項(xiàng)包括200例人工授精婦女的前瞻性研究表明，應(yīng)用hCG的實(shí)驗(yàn)組臨床妊娠率（26%）明顯高于對(duì)照組（9%，P=0.002），試驗(yàn)組持續(xù)妊娠率（23%）明顯高于對(duì)照組（7%，P=0.003），但兩組流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明hCG在妊娠過程中起著至關(guān)重要的作用［7］。但是，關(guān)于近些年AhCGAb的高質(zhì)量研究較少，仍需大量機(jī)制相關(guān)研究證實(shí)。最后，尿中hCG的檢測(cè)除ELISA［8］、免疫萃取-串聯(lián)質(zhì)譜法［9］外，Ahi等［10］利用毛細(xì)管驅(qū)動(dòng)的微流控芯片，建立了一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)的抗體修飾的磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒夾心免疫分析方法檢測(cè)尿液中的hCG，不僅能夠最大限度地減少試劑和樣品體積，而且整個(gè)過程大約在1h內(nèi)完成，與傳統(tǒng)的液相色譜-質(zhì)譜法（liquidchromatography-massspectrometry，LC-MS）、ELISA、免疫印跡法（westernblotting）等檢測(cè)hCG的方法相比，不需要耗時(shí)和復(fù)雜的預(yù)處理步驟，具有較短的檢測(cè)時(shí)間，且結(jié)果真實(shí)可靠。二、受精卵形成獲能的精子與次級(jí)卵母細(xì)胞相遇于輸卵管，結(jié)合形成受精卵的過程稱為受精，受精多數(shù)在排卵后數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生，一般不超過24h，對(duì)于不孕癥女性來說，精子為異己成分，結(jié)合過程中可以產(chǎn)生抗精子抗體、抗透明帶抗體等影響精子與卵子結(jié)合，從而影響受精卵的形成。（一）抗精子抗體（anti-spermantibodies，AsAb）抗精子抗體是引起不孕的常見原因之一，由于精子具有抗原性，其對(duì)于女性來說是異己成分。正常情況下，女性生殖道具有屏障作用，并且陰道和子宮內(nèi)膜有對(duì)抗原物質(zhì)的清除，避免了抗體的產(chǎn)生。目前提出的可導(dǎo)致女性抗精子免疫的機(jī)制包括：（1）在女性生殖道中的免疫活性細(xì)胞吞噬精子并隨后將精子抗原呈遞給免疫系統(tǒng)之后，發(fā)生免疫反應(yīng)；（2）女性宮頸手術(shù)，宮頸慢性創(chuàng)傷，生殖道感染等也可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗精子抗體；（3）某些過敏體質(zhì)的女性，對(duì)射入生殖道內(nèi)的精液可產(chǎn)生過敏反應(yīng)，當(dāng)精子在女性生殖道內(nèi)降解受阻時(shí)會(huì)進(jìn)入腹腔，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生抗精子抗體［11］。抗精子抗體可與精子結(jié)合使精子穿透能力下降，無法穿透宮頸黏液，也可抑制精子釋放透明質(zhì)酸酶，從而抑制頂體反應(yīng)，導(dǎo)致女性不孕。Huo等［12］對(duì)天津地區(qū)的1711例女性不孕癥患者和1305例男性不育癥患者的AsAb進(jìn)行了比較，表明不孕不育患者血清AsAb水平高于健康對(duì)照組，男女人群中抗體水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。龐曉霞［13］以82例女性不孕癥患者為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性不孕患者的AsAb陽性率最高，與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者（18.29%）和繼發(fā)性患者（18.29%）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。最后，AsAb有多種檢測(cè)方法，包括免疫膠體金技術(shù)、間接免疫熒光、淺盤凝集試驗(yàn)、精子制動(dòng)試驗(yàn)等，而Gatimel等［14］的研究表明，若在常規(guī)精子檢查中發(fā)現(xiàn)精子凝集，或者有陰囊外傷或腹股溝手術(shù)史，應(yīng)將混合抗球蛋白反應(yīng)（mixedantiglobulinreaction，MAR）試驗(yàn)檢測(cè)AsAb作為調(diào)查生育狀況和輔助生育技術(shù)前的系統(tǒng)檢查。但是，這項(xiàng)研究是使用SperMar測(cè)試進(jìn)行的，使用免疫珠測(cè)試獲得的結(jié)果可能不具有可比性。（二）抗透明帶抗體（anti-zonapellucidaantibodies，AZPAb）透明帶（zonapellucida，ZP）是卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞分泌的，由4種糖蛋白組成的細(xì)胞外基質(zhì)，在初級(jí)卵泡期的卵母細(xì)胞周圍形成，并且在卵泡/卵母細(xì)胞生長期間厚度增加。排卵后，ZP作為精子屏障以及精子頂體誘導(dǎo)和胚胎保護(hù)。ZP具有很強(qiáng)的免疫性，能有誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生AZPAb。AZPAb所致不孕可能是多方面的：（1）和透明帶抗體有交叉抗原性或者其他致病因子使得透明帶抗體變異，產(chǎn)生損傷性透明帶免疫，導(dǎo)致不孕；（2）抗透明帶抗體可抵抗精子頂體酶的消化作用，使精子與卵子無法結(jié)合，從而導(dǎo)致不孕；（3）抗透明帶抗體與抗原結(jié)合，阻止精子通過透明帶，導(dǎo)致不孕［15］。Wang等［16］的研究結(jié)果表明，ZP3是精子在卵細(xì)胞上的主要受體，是頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)者，在受精過程中起著關(guān)鍵作用?？筞P3抗體可引起卵巢的病理改變，導(dǎo)致卵巢功能障礙，引起不孕癥。近年來研究表明，在常規(guī)體外受精患者中，AZPAb滴度越高，受精率越低，并且在不明原因的不孕癥患者的血清中，AZPAb的檢出率高達(dá)46.9%［17］。最后，檢測(cè)AZPAb的方法有免疫沉淀反應(yīng)、間接免疫熒光法、間接血凝、膠乳凝集試驗(yàn)、RIA及ELISA法等（以ELISA法最常用）。無論何種檢測(cè)方法，均需有透明帶抗原，由于豬和人卵透明帶有共同的抗原成分，故常選用豬卵的透明帶抗原進(jìn)行AZPAb的檢測(cè)。三、受精卵著床晚期囊胚種植于子宮內(nèi)膜的過程稱為受精卵著床，受精卵著床經(jīng)過定位、黏附和侵入3個(gè)過程，必須具備透明帶消失、囊胚細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分化出合體滋養(yǎng)細(xì)胞、囊胚和子宮內(nèi)膜同步發(fā)育且功能協(xié)調(diào)、體內(nèi)分泌足量的雌激素和孕酮等條件，在此過程中產(chǎn)生抗子宮內(nèi)膜抗體、抗磷脂抗體等均會(huì)影響子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致不孕癥。（一）抗子宮內(nèi)膜抗體（anti-endometriumantibodies，AEmAb）正常情況下，子宮內(nèi)膜對(duì)機(jī)體無抗原性，但是在子宮內(nèi)膜異位癥的患者中，異位的子宮內(nèi)膜可作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的AEmAb。AEmAb可與子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中的孕激素依賴結(jié)合蛋白結(jié)合后發(fā)生免疫反應(yīng)，損害子宮內(nèi)膜，干擾受精卵著床及胚胎發(fā)育，從而導(dǎo)致不孕［18］。Barnhart等［19］通過對(duì)22項(xiàng)研究的1項(xiàng)薈萃分析表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者的受精和著床率降低，卵母細(xì)胞數(shù)量顯著減少，并且重度子宮內(nèi)膜異位癥女性的妊娠率低于輕度子宮內(nèi)膜異位癥女性（OR=0.60，95%CI：0.42~0.87）。Huo等［12］研究表明原發(fā)性不孕癥和繼發(fā)性不孕癥女性的血清AEmAb陽性率均高于健康對(duì)照組，但原發(fā)性不孕癥和繼發(fā)性不孕癥患者中AEmAb水平對(duì)于診斷不孕癥等方面的意義仍需進(jìn)一步探討。最后，AemAb的檢測(cè)方法有多種，許國強(qiáng)等［20］通過對(duì)比斑點(diǎn)金免疫滲濾法與常規(guī)ELISA法檢測(cè)AemAb的研究表明，在586份血清的檢測(cè)中，斑點(diǎn)金免疫滲濾法陽性率為36.8%（216/586），與ELISA法（206/586）的結(jié)果基本一致，其敏感度為95.6%，特異度為94.7%，可見斑點(diǎn)金免疫滲濾法具有良好的特異性。（二）抗磷脂抗體（anti-phospholipidAntibodie，aPL）抗磷脂綜合征（antiphospholipidsyndrome，APS）是一種自身免疫性疾病，其特征是反復(fù)出現(xiàn)動(dòng)脈和/或靜脈血栓，病態(tài)妊娠及存在持續(xù)高滴度aPL陽性。其臨床發(fā)病率高，發(fā)病機(jī)制涉及aPL所誘導(dǎo)的細(xì)胞活化、抑制抗凝和纖溶系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體激活及氧化應(yīng)激等許多方面。APS臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，可累及全身多個(gè)器官和系統(tǒng)。2019年《抗磷脂抗體檢測(cè)的臨床應(yīng)用專家共識(shí)》［21］指出，盡管分類標(biāo)準(zhǔn)中要求aPL持續(xù)高滴度陽性，但是低滴度aPL陽性與病理妊娠可能相關(guān)。一項(xiàng)納入2053例因不孕癥接受體外受精的婦女的研究表明，703名（34%）不孕癥患者aPL（抗心磷脂或抗β2糖蛋白I抗體）水平升高，但未發(fā)現(xiàn)aPL與體外受精結(jié)局存在相關(guān)性［22］。Paulmyer-Lacroix等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，與有生育能力的婦女相比，需要體外受精的不孕癥婦女中，抗磷脂抗體水平升高約20%，主要是抗β2-GP1抗體。最后，有研究通過對(duì)2種不同方法檢測(cè)aPL的分析表明，對(duì)于APS患者抗心磷脂抗體和抗β2糖蛋白I抗體檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光法整體陽性率均高于ELISA法，可以彌補(bǔ)ELISA法對(duì)APS患者的漏檢，且時(shí)間較短，可自動(dòng)化操作，更適合應(yīng)用于臨床檢測(cè)［24］。本團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)針對(duì)血清aPL水平與不孕癥的關(guān)系開展研究，結(jié)果顯示與正常妊娠女性相比，不孕癥患者的狼瘡抗凝物的陽性率較高，文章即將發(fā)表。（三）其他抗體近些年來，有研究表明，抗甲狀腺抗體與不孕癥之間有關(guān)，在接受體外受精和胚胎移植的不孕癥患者中，攜帶抗甲狀腺抗體的女性受精率、植入率和妊娠率明顯低于未攜帶這些抗體的女性［25］。但Chai等［26］的研究表明患有自身免疫性甲狀腺炎和/或亞臨床甲狀腺功能減退癥的不孕癥婦女與正常受孕女性，進(jìn)行體外受精后胚