植物細胞培養(yǎng)制藥-課件

植物細胞培養(yǎng)制藥意義 藥用植物是天然藥物的寶庫 植物細胞培養(yǎng)是生產(chǎn)的藥物可能途徑目前采用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物主要包括

（1）苷（甙）類：包括皂苷（人參皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、強心苷（強心醇苷、毛地黃毒配質(zhì)衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。（2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽甾醇、異巖藻甾醇等。

植物細胞培養(yǎng)制藥意義1強心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)）甾醇強心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)）甾醇2（3）生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。（4）醌類：包括蒽醌、萘醌等。（5）蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑。植物病毒抑制劑、植物抗生素等。（6）黃酮類：具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，生物合成前體是苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A。多為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。小檗堿蒽醌黃酮（3）生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。小檗堿蒽醌黃酮3植物細胞培養(yǎng)制藥進展第一個專利：1956年Routin和Nickell首次數(shù)提出利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物的第一個專利工業(yè)植物生物技術(shù)：20世紀90年代明確提出已經(jīng)從200余種藥用植物獲得了愈傷組織或細胞懸浮培養(yǎng)物（傅經(jīng)國等，2004）國際日本：紫草人參紅豆杉歐美：美國－紅豆杉；德國－紫錐菊國內(nèi)：羅士韋葉和春鄭光植侯嵩生丁家宜植物細胞培養(yǎng)制藥進展第一個專利：1956年Routin和N4技術(shù)路線

目標植物選擇→愈傷組織誘導(dǎo)→→液體培養(yǎng)→→培養(yǎng)條件的優(yōu)化→→反應(yīng)器擴大培養(yǎng)→愈傷組織誘導(dǎo)→→固體、液體培養(yǎng)→→高產(chǎn)細胞系篩選→→生物合成途徑的研究→器官分化（發(fā)狀根）→→固體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化→→反應(yīng)器擴大培養(yǎng)→→有效成分提取、分離技術(shù)路線目標植物選擇5植物細胞培養(yǎng)是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細胞的一種技術(shù)。植物細胞培養(yǎng)是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分散的6植物細胞培養(yǎng)的特點:⑴大小;⑵細胞團的形式存在;⑶纖維素細胞壁和大液泡,易被剪切力損傷;⑷生長緩慢⑸培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜,易被微生物污染;⑹需光\氧\二氧化碳植物細胞培養(yǎng)的特點:⑴大小;7培養(yǎng)類型按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)；按培養(yǎng)基類型可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式可分為懸浮細胞培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)類型按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)；8植物單細胞分離和初步培養(yǎng)單細胞獲得：機械法；酶解法；愈傷組織法單細胞培養(yǎng)：看護培養(yǎng)法（nursingculture)飼養(yǎng)層培養(yǎng)(feedinglayerculture)植物單細胞分離和初步培養(yǎng)單細胞獲得：9固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝人培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。優(yōu)缺點簡便易行、所占空間小生長的不平衡，易出現(xiàn)了極化現(xiàn)象易堆積生長過程中排出的有害物質(zhì)有些生理生化指標測定不方便常用的固化劑瓊脂、明膠（10%）等固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后10液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture細胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液體積不變,不添加營養(yǎng)成分,待細胞增長和產(chǎn)物積累到適當?shù)臅r間,一次性收獲細胞\產(chǎn)物和培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法.液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture11液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture特點：操作簡單，培養(yǎng)周期短.直接反映細胞生長代謝過程.可直接放大不能控制底物濃度\細胞易老化\生長周期短\效率低.兩步成批培養(yǎng)法即使用兩個生物反應(yīng)器，第一個反應(yīng)器用于細胞生物量的累積，第二個反應(yīng)器用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture122.半連續(xù)培養(yǎng)法semi-continuousculture重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng).在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中,每間隔一段時間從中取出部分培養(yǎng)液或細胞,剩余的細胞作為種子,再用新的培養(yǎng)液補足到原體積,使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變.特點:細胞可持續(xù)指數(shù)生長,并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平,培養(yǎng)過程中可延續(xù)很長時間.可進行多次收獲.操作簡便,生產(chǎn)效率高.植物細胞培養(yǎng)制藥-課件133．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)連續(xù)培養(yǎng)法是利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時間后，以一定速度連續(xù)采集細胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法。該法的理論基礎(chǔ)是根據(jù)Monod公式，即生長速度取決于基質(zhì)的濃度。μ＝μmax·S/(Ks+S) μ=特定生長速度；μmax=特定最大生長速度；Ks=飽和系數(shù)；S=基質(zhì)濃度兩階段連續(xù)培養(yǎng)法于第一反應(yīng)器中投入生長培養(yǎng)基并連續(xù)加入該培養(yǎng)基，而于第二反應(yīng)器中投入生產(chǎn)培養(yǎng)基。

3．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)連續(xù)培143．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)特點:細胞能在近似恒定狀態(tài)下生長、營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH基本保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率可基本維持不變，細胞維持持續(xù)指數(shù)增長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。3．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)特點:153．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)問題:一直有細胞收獲，濃度一般不高細胞分裂快、易變異；由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。3．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)問題:16懸浮培養(yǎng)（Suspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。特點1.培養(yǎng)細胞可不斷增殖，且生長速度快。2.液體狀態(tài)下便于細胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細胞狀態(tài)可以相對保持一致。懸浮培養(yǎng)（Suspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細17細胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導(dǎo)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細胞的生長動態(tài)懸浮細胞同步化細胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導(dǎo)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細18愈傷組織的誘導(dǎo)選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高激素濃度；必要的附加物質(zhì)。愈傷組織的誘導(dǎo)選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。19要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的20懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150~250mlflaskcentrifugeisolationsubculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150~250mlflask21植物細胞培養(yǎng)制藥-課件22成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系特征懸浮培養(yǎng)分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下。均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天便可增加一倍。成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系特征懸浮培養(yǎng)分散性良好，細胞團較小，一23植物細胞培養(yǎng)制藥-課件24植物細胞培養(yǎng)制藥-課件25懸浮細胞的生長動態(tài)懸浮細胞的生長動態(tài)26懸浮細胞生長的衡量根據(jù)不同培養(yǎng)時間的細胞數(shù)變化，或細胞質(zhì)量變化。生長速率(p)：不同時間細胞密度(x)的自然對數(shù)與起始密度(x0)的自然對數(shù)之差與培養(yǎng)時間(t)的比值 p＝(lnx-lnx0)/t鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應(yīng)細胞生長情況干重：鮮細胞烘干至衡重，反應(yīng)細胞質(zhì)量懸浮細胞生長的衡量根據(jù)不同培養(yǎng)時間的細胞數(shù)變化，或細胞質(zhì)量變27影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質(zhì)量接種細胞密度：懸浮細胞的起始密度一般在0.5~2.5×105個細胞/毫升。接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長。最低有效密度：即能使細胞分裂、增殖的最低接種量。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質(zhì)量28影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)基應(yīng)用條件培養(yǎng)基（生長過愈傷組織或懸浮細胞的液體培養(yǎng)基）提供單細胞生長和分裂所需的特殊代謝物?；九囵B(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目的而定培養(yǎng)基設(shè)計時,一般均以誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進行調(diào)整。常用的培養(yǎng)基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的應(yīng)用。影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)基29影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)溫度25℃繼代周期指具有一定起始密度的細胞,從開始培養(yǎng)到細胞數(shù)目和總重量增長停止的一個過程。培養(yǎng)周期的長短是由起始細胞密度、延遲期的長短、生長速率等決定。繼代培養(yǎng)（Subculture）：繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁殖培養(yǎng)過程。影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌式30懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。植物細胞在懸浮培養(yǎng)中容易團聚并進入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達到完全同步化是十分困難的。同一培養(yǎng)體系的植物細胞經(jīng)常不能處于同一細胞周期，這種差異使懸浮細胞分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等復(fù)雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細胞達到相對同步化。什么措施？懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都31細胞周期細胞周期32饑餓法饑餓導(dǎo)致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。氮饑餓時，通常獲得G1期的同步化細胞磷和碳饑餓時，獲得G1和G2期的同步化細胞。將饑餓細胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時，細胞分裂又可重新恢復(fù)。饑餓法饑餓導(dǎo)致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不33抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期(G1)的同步化細胞。常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷(FudR)和羥基尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細胞培養(yǎng)中已有成功應(yīng)用。利用破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA34分選法依據(jù)：細胞體積大小方法常規(guī)分選方法是梯度離心精細的分選可采用流式細胞儀優(yōu)點操作簡單分選細胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它處理帶來的副作用缺點分選精細度較差分選法依據(jù)：細胞體積大小35低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細胞較好地同步化。梅興國等（2001）采用6℃低溫處理紅豆杉細胞也獲得較明顯同步化效果?？赡艿脑虿煌臏囟葘毎挠薪z分裂有極明顯的影響，在一定范圍內(nèi)，溫度下降使細胞分裂速度減慢，細胞周期延長，從而相應(yīng)地延長了分裂期的時間，使分裂指數(shù)提高，細胞同步化率升高。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度36單細胞培養(yǎng)意義分離方法機械法酶解法培養(yǎng)方法平板培養(yǎng)看護培養(yǎng)微室培養(yǎng)雙層濾紙培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)意義37單細胞分離方法機械法具體做法：將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團優(yōu)點：細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生化研究。單細胞分離方法機械法38單細胞分離方法酶解法酶對細胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高游離細胞的產(chǎn)量。酶解法的優(yōu)點可獲得較多的葉肉游離細胞（但對禾本科植物葉片效果不好）。單細胞分離方法酶解法39細胞平板培養(yǎng)（platingculture)指將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。Bergman(1960)首創(chuàng)單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞。單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×103個/毫升植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。細胞平板培養(yǎng)（platingculture)指將一定密度的40細胞平板培養(yǎng)（platingculture)平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞總和中所占的比例。每個平板形成的細胞團數(shù)植板率＝每個平板接種的細胞總數(shù)細胞平板培養(yǎng)（platingculture)平板培養(yǎng)的效果41細胞平板培養(yǎng)（platingculture)優(yōu)點： ①單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察，是單細胞株篩選和突變體篩選的常用方法。 ②由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。細胞平板培養(yǎng)（platingculture)優(yōu)點：42細胞懸浮過濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈傷組織細胞懸浮過濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈43看護培養(yǎng)（nurseculture）Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細胞體系。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程?？醋o培養(yǎng)（nurseculture）Muir(1953)首44植物細胞培養(yǎng)制藥-課件45微室培養(yǎng)(microchamberculture)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。由Jones等在1960年設(shè)計的。優(yōu)點：可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化等過程缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。細胞起始密度：30～80個/室。微室培養(yǎng)(microchamberculture)在人工制46植物細胞培養(yǎng)制藥-課件47雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞層培養(yǎng)細胞看護濾紙轉(zhuǎn)移濾紙雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼48固定化培養(yǎng)法將細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)稱為細胞固定化培養(yǎng)。固定化培養(yǎng)采用的固定化反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中空纖維膜等多種類型，將細胞固定于尼龍網(wǎng)套內(nèi)，或固定于中空纖維反應(yīng)器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。固定化培養(yǎng)法將細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)稱為細49與懸浮培養(yǎng)相比，固定化培養(yǎng)的優(yōu)點：①提高了藥物的合成、積累；②能長時間保持細胞活力；③可以反復(fù)使用；④抗剪切能力強；⑤耐受有毒前體物質(zhì)的濃度高；⑥遺傳性狀較穩(wěn)定；⑦后處理難度小。與懸浮培養(yǎng)相比，固定化培養(yǎng)的優(yōu)點：50固定化植物細胞培養(yǎng)技術(shù)要進入工業(yè)化生產(chǎn)有許多問題尚待解決。首先，固定化培養(yǎng)要求代謝產(chǎn)物必須是分泌到細胞外的。第二，植物細胞藥物的積累是不連續(xù)的，這也限制了固定化細胞方法的應(yīng)用。第三，易污染。Flash固定化植物細胞培養(yǎng)技術(shù)要進入工業(yè)化生產(chǎn)有許多問題尚待解決。F51植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)的技術(shù)問題植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立52植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求 從工程的角度講必須要進一步研究和開發(fā)適宜于植物生長和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)；從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個條件：培養(yǎng)的細胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。細胞生長速度快，短時間內(nèi)能生產(chǎn)較多產(chǎn)物產(chǎn)物不被迅速降解，最好能分泌到培養(yǎng)基中植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求 從工程的角度講必須要進一步研究53植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立種子細胞選擇種子細胞增殖與放大培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)體系建立植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立種子細胞選擇54種子細胞選擇外植體選擇植物類型：遺傳基礎(chǔ)。在確定生產(chǎn)某一種化合物以后，首先必須準確選擇那些能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類及品種或單株。組織器官：由于天然產(chǎn)物一般為次生代謝產(chǎn)物，而植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有組織器官的特異性，因此，在起始細胞培養(yǎng)時盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織作為外植體。種子細胞選擇外植體選擇55種子細胞選擇高產(chǎn)細胞系的篩選懸浮細胞系單細胞克隆種細胞增殖種子細胞選擇高產(chǎn)細胞系的篩選56種子細胞增殖與放大培養(yǎng)目的準備材料提供技術(shù)參數(shù)過程搖瓶反應(yīng)器種子細胞增殖與放大培養(yǎng)目的57大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)方式成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方式的選擇根據(jù)次生產(chǎn)物積累而定，通常還根據(jù)不同要求進行改進。如當細胞生長和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基時，就需要采用兩步法培養(yǎng)，先在細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細胞，當細胞生長至合成產(chǎn)物的階段后，將其轉(zhuǎn)至產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在產(chǎn)物合成階段又可采用連續(xù)培養(yǎng)方式以延長細胞生產(chǎn)時間。大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)方式58生物反應(yīng)器類型及特點是指用于高等生物細胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。適合植物細胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)該具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。攪拌式氣動式固定化式其它—光照生物反應(yīng)器，轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器類型及特點是指用于高等生物細胞批量化培養(yǎng)的裝置及其59反應(yīng)器類型體積（L）培養(yǎng)植物種類攪拌式7，15D.carota胡蘿卜攪拌式20，15500N.tabacum煙草攪拌式5000C.roseus長春花螺旋攪拌式20C.blumei五彩蘇提升攪拌式2.5P.elliotii濕地松鼓泡式20，30，130P.ginseng人參鼓泡式65，1500N.tabacum煙草外環(huán)氣升式10，30，85C.roseus長春花導(dǎo)筒氣升式20，210D.lanata狹葉毛地黃轉(zhuǎn)鼓式1－4V.rosea長春花植物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器反應(yīng)器類型體積（L）培養(yǎng)植物種類攪拌式7，15D.caro60攪拌式反應(yīng)器是根據(jù)植物細胞特性在微生物發(fā)酵罐基礎(chǔ)上改進而成。攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式。必須設(shè)計加液裝置必須設(shè)計通氣裝置適宜的取樣口攪拌式反應(yīng)器是根據(jù)植物細胞特性在微生物發(fā)酵罐基礎(chǔ)上改進而成。61植物細胞培養(yǎng)制藥-課件62氣動式反應(yīng)器又稱空氣提升式反應(yīng)器特點：剪切力小，但攪拌不很均勻。

Flash氣動式反應(yīng)器又稱空氣提升式反應(yīng)器Flash63固定化反應(yīng)器特點：較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，可以研究特定的代謝途徑，便于調(diào)節(jié)。細胞位置的固定使其所處環(huán)境類似于在植物體中所處的狀態(tài)，相互間接觸密切，可形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物合成?？梢詮呐囵B(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因初級代謝產(chǎn)物積累造成對代謝的反饋抑制，延長生產(chǎn)周期，進行連續(xù)生產(chǎn)。固定化反應(yīng)器特點：64固定化反應(yīng)器種類：主要有流化床、膜反應(yīng)器和填充反應(yīng)器植物細胞固定化一般采取凝膠包埋、膜固定、網(wǎng)格和泡沫固定和表面吸附等。包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽和聚丙烯酰胺等附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫和中空纖維等。固定化反應(yīng)器種類：65Alfermann等(1983)用氣升式系統(tǒng)，采用海藻鈣固定細胞成功地用30L和200L的反應(yīng)器生產(chǎn)地高辛。Jose等(1983)進一步用中空纖維反應(yīng)器培養(yǎng)胡蘿卜和碧東茄生產(chǎn)代謝產(chǎn)物酚類物質(zhì)Mavituna等（1987）使用板式反應(yīng)器和循環(huán)床反應(yīng)器培養(yǎng)固定化辣椒細胞，最大辣椒素生產(chǎn)速率（以干辣椒細胞計）達到0.5mg／g／d，與成熟期辣椒合成辣椒素的速率相當。Alfermann等(1983)用氣升式系統(tǒng)，采用海藻鈣固定66規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)必須適應(yīng)植物細胞特性細胞體積大。其平均直徑比細菌大幾十倍通常以2～200個細胞，直徑2mm大小的非均勻小細胞團形式存在?？辜羟心芰θ?。生長速度慢，周期長，培養(yǎng)基成分復(fù)雜，有利于微生物生長，因此在培養(yǎng)中維持無菌環(huán)境難度較大但又十分重要。規(guī)模化培養(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)必須適應(yīng)植物細胞特性67規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題培養(yǎng)液的流變特性－－粘度變化是由細胞密度和細胞狀態(tài)變化造成的煙草細胞培養(yǎng)，當細胞密度低于7g/L時，培養(yǎng)液粘度基本不變，而高于此值時，培養(yǎng)液粘度增加。長春花細胞培養(yǎng)密度在10g/L時，培養(yǎng)液粘度有賴于細胞年齡、形態(tài)和細胞團大小。在相同物質(zhì)濃度下,大細胞團的營養(yǎng)液表觀粘度明顯大于小細胞團的表觀粘度。規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題培養(yǎng)液的流變特性－－粘度變化68規(guī)模化培養(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題氧氣含量調(diào)節(jié)KLa（氧的傳遞系數(shù)，Nv=Kla(C*-C)）： 如在4L的氣升式反應(yīng)器中進行長春花細胞培養(yǎng)時，KLa在20h-1左右時。細胞生長與次生產(chǎn)物合成維持在良好狀態(tài)； 在15L通風式反應(yīng)器中培養(yǎng)的煙草細胞，當KLa在5~10h-1的范圍內(nèi)，生物量和代謝產(chǎn)物隨KLa增加而增加。溶氧濃度：毛地黃細胞培養(yǎng)，當培養(yǎng)基氧濃度從10％飽和度上升至30％，細胞生長速率從0.15d-1上升至0.20d-1，如果繼續(xù)上升至40％，細胞生長速率反而下降至0.17d-1。規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題氧氣含量調(diào)節(jié)69規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題CO2調(diào)節(jié)在通氣過程中，混入2％～4％的CO2能消除高通氣速率對長春花細胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成的不利影響。規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題CO2調(diào)節(jié)70規(guī)模化培養(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題泡沫和表面黏附性植物細胞培養(yǎng)中易產(chǎn)生泡沫，且覆蓋蛋白質(zhì)和粘多糖，細胞極易被包埋在其中從循環(huán)的培養(yǎng)液中帶出來，形成非均相培養(yǎng)而影響培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)率。消除方法化學消泡：天然油脂、高級醇類、聚醚類機械消泡規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題泡沫和表面黏附性71提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑選擇適宜的起始材料－－種類、部位梔子（Gardeniajasminoides）胚軸銀杏 子葉當歸 根紅豆杉幼嫩的莖茜草葉柄提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑選擇適宜的起始材料－－種類、部位72高產(chǎn)細胞株的篩選直接篩選法紅豆杉紫杉醇玫瑰茄花色苷（比對照提高14.5倍）誘變育種法伊貝母－紫外光黃連－60Coγ（小檗堿含量達6.12%）紅豆杉苯丙氨酸高產(chǎn)細胞株的篩選73高產(chǎn)細胞株選擇梅興國（2001）通過在培養(yǎng)基中添加1.6mM的L-Phe，篩選出了抗Phe的紅豆杉細胞懸浮系，其紫杉醇含量高于原型細胞3～5倍。高產(chǎn)細胞株選擇梅興國（2001）通過在培養(yǎng)基中添加1.6mM74產(chǎn)生等于或高于親本植物藥物含量的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)植物種類

培養(yǎng)類型化合物含量（％）干重

化合物植物人參愈傷人參糖苷274.1海巴戟懸浮蒽醌182.2洋紫蘇懸浮迷迭香酸163.0紫草懸浮紫草寧141-2唐松草懸浮

小檗堿10

0.01

日本黃連懸浮小檗堿102-4蓬子菜懸浮蒽醌5.41.2豬殃殃懸浮蒽醌3.80.2煙草愈傷煙堿3.42.0產(chǎn)生等于或高于親本植物藥物含量的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)植物種類培75優(yōu)化培養(yǎng)基選擇合適培養(yǎng)基種類及植物生長調(diào)節(jié)劑桅子－－藏紅花酸－－心臟病B5，MG-5利于細胞生長M-9利于黃色素合成（鐘青平等1994）高山紅景天－－紅景天苷－－抗疲勞、抗缺氧NAA;BA好于2,4-D;IAA;KT（韓愛明等1997）胡蘿卜－－黃酮GA3抑制（Hindereetal.1984）桔葉雞眼藤－－蒽醌1mg/LNAA促；1mg/L2,4-D抑（Linus等1995）煙草－－尼古丁

IAA促；2,4-D抑（Furuya1987）優(yōu)化培養(yǎng)基選擇合適培養(yǎng)基種類及植物生長調(diào)節(jié)劑76不同植物激素對長春花細胞的懸浮培養(yǎng)物中生物堿產(chǎn)量的影響培養(yǎng)基最大生物堿產(chǎn)量(%干重)其它生物堿數(shù)量(化合物數(shù)量)生長培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)蛇根堿啊嗎堿B5+24D+KTB5+24D+KT0.000.000B5+24D+KTB5-無激素0.080.061B5+24D+KTB5+IAA+KT0.330.0810B5+24D+KTMS+IAA+KT0.040.022B5+24D+KTMS+IAA+BA0.30.452M3-CMM3-CM0.580.1414B5+NAA+KTB5+NAA+KT0.240.0612M3-CMMS+IAA+BA1.000.049B5+NAA+KTMS+IAA+BA0.420.325不同植物激素對長春花細胞的懸浮培養(yǎng)物中生物堿產(chǎn)量的影響培養(yǎng)基77優(yōu)化培養(yǎng)基(調(diào)節(jié)碳源)增加碳源可促進次生代謝物質(zhì)的積累彩葉草細胞－－迷迭香葉寧酸－化妝品長春花細胞－－阿馬里新、利血平－高血壓紅豆杉細胞－－紫杉醇葡萄細胞－－花青素－血管的守護神優(yōu)化培養(yǎng)基(調(diào)節(jié)碳源)增加碳源可促進次生代謝物質(zhì)的積累78優(yōu)化培養(yǎng)基(添加有機物)在紅花（Carthamuslinctorius）培養(yǎng)細胞中加入0.1％水解酪蛋白，可使維生素E的產(chǎn)量提高約5倍（Yamamotoetal，1989）。10%椰乳，能明顯促進滇紫草愈傷組織紫草素的產(chǎn)生，其紫草素的含量是對照的24倍(周立剛等1991)。紫草素－－肝膽疾病輔助用藥甘煩遠等（1997）研究表明，云南紅豆杉懸浮細胞適宜的培養(yǎng)基為B5，當添加椰子汁(CM)、酪蛋白氨基酸(CA)和水解乳蛋白(LH)3種有機物時，均能提高培養(yǎng)細胞中紫杉醇的含量，而且CM和CA還能促進細胞的生長。優(yōu)化培養(yǎng)基(添加有機物)在紅花（Carthamuslin79調(diào)節(jié)pH值及光照控制pH培養(yǎng)基將有利于藥物的生成。南方紅豆杉愈傷pH5.5對愈傷組織生長最為有利pH7.0對紫杉醇積累最為有利大槭樹(A．Psendoplatanus)細胞降低pH將有利于煙堿的釋放光對于藥物的積累具有重要的作用玫瑰茄懸浮細胞－－花青素合成藍光促進；紅光和橙光無效長春花愈傷組織－－生物堿合成藍光促進；綠光抑制調(diào)節(jié)pH值及光照控制pH培養(yǎng)基將有利于藥物的生成。80調(diào)節(jié)礦質(zhì)元素氮和磷的作用氮源促進長春花細胞的生長抑制長春花生物堿的合成(Knobloch1982）適當?shù)腘H4+／NO3-比例有助于葡萄細胞花青素的積累高濃度NH4+抑制云南紅豆杉愈傷生長，但顯著提高紫杉醇的含量。（陳永勤等2000）磷促進長春花細胞生長抑制吲哚生物堿合成(周立剛等，1991）調(diào)節(jié)礦質(zhì)元素氮和磷的作用81其它元素高濃度的Co2+和Fe2+有利于花青素的積累（杜金華等，1997）CaCl2和MgSO4，能明顯提高蘿芙木咖啡堿的含量在紫草細胞培養(yǎng)中，紫草素的含量明顯受到Ca2+濃度的影響（Fujitaetal.1981）Cu2+可能對梔子黃色素的產(chǎn)生有促進作用，（鐘青萍等，1994）

其它元素82提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑前體（precursor）的應(yīng)用作用：提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。選擇對某一目的產(chǎn)物來講可能有多種前體物質(zhì)同一種前體物質(zhì)又可能有多條代謝路徑從而形成不同的代謝產(chǎn)物。針對其合成的關(guān)鍵生化過程進行前體物質(zhì)添加。多數(shù)前體物質(zhì)對細胞生長本身并不十分有力注意前體濃度。過量也可能產(chǎn)生反饋抑制。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑前體（precursor）的應(yīng)用83人參皂甙的生物合成途徑乙酰輔酶A

甲羥戊酸（MVA）反式角鯊烯（C30）

2,3-氧化鯊烯環(huán)阿屯醇達瑪烯二醇香樹素植物甾醇人參皂甙Rg1人參皂甙Ro人參皂甙的生物合成途徑84外源L-苯丙氨酸槲皮素，玫瑰茄細胞花青苷產(chǎn)量提高1.3倍異丁子香酚

提高番椒的香蘭素、香草酸和阿魏酸的產(chǎn)量苯丙氨酸、苯甲酸、絲氨酸和甘氨酸能使東北紅豆杉中紫杉醇含量高出l～4倍亮氨酸或BaccataIII能提高紫杉醇的含量(30%-100%)苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸鈉，在水母雪蓮細胞培養(yǎng)中，在培養(yǎng)6d時，細胞進入快速生長期，此時加入前體物質(zhì)有利于細胞的生長和黃酮合成。肉桂酸可提高約1倍。外源L-苯丙氨酸85提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑激發(fā)子（elicitor）的應(yīng)用也稱誘導(dǎo)子，是指能夠誘導(dǎo)植物細胞中某些反應(yīng)，并形成細胞特征性自身反應(yīng)的分子。非生物激發(fā)子，如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激發(fā)子外源激發(fā)子：菌絲、微生物機體提取物及微生物產(chǎn)生的多糖、蛋白和脂肪酸等內(nèi)源性激發(fā)子：來源于植物結(jié)構(gòu)的化合物。如降解細胞壁的酶、細胞壁碎片、寡聚糖等有機分子。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑激發(fā)子（elicitor）的應(yīng)用86生物激發(fā)子蜜環(huán)菌發(fā)酵液在延胡索植物細胞培養(yǎng)中顯著促進了原鴉片堿的合成在丹參毛狀根細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，加入蜜環(huán)菌發(fā)酵液培養(yǎng)3～4d后，細胞丹參酮的含量可提高至接近活體植物細胞的水平。寡糖素有利于人參和西洋參的細胞生長和皂甙的積累酵母提取物促進生物堿、黃酮類合成在長春花、葛和茶等多種植物細胞培養(yǎng)中已成功應(yīng)用提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑生物激發(fā)子提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑87提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑非生物激發(fā)子激發(fā)子對南方紅豆杉細胞培養(yǎng)合成紫杉醇的影響激發(fā)子適宜濃度（mM）與對照比提高產(chǎn)物效率（倍）M-JA0.17.0花生四烯酸0.16.5硝酸柿胺1.05.5水楊酸0.14.5硝酸鹽0.013.0提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑非生物激發(fā)子激發(fā)子適宜濃度（mM）88M-JAMg/L0.00.110.01.0M-JA0.00.110.01.089提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑抑制劑的使用雙氯苯咪唑和氯化膽堿－－固醇生物合成抑制劑可使青蒿素合成量明顯提高?？蛇_到與黃花蒿葉中所含的青蒿素處于同一個數(shù)量級嘧啶醇－－甾體合成代謝抑制劑可提高云南紅豆杉紫杉醇的含量矮壯素（CCC）－－赤霉素的生物合成抑制劑質(zhì)量濃度為5.0mg／L的CCC可使紫杉醇含量提高60％以上。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑抑制劑的使用90提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑培養(yǎng)技術(shù)的選擇包括反應(yīng)器的選擇和培養(yǎng)方式的選擇培養(yǎng)技術(shù)的選擇不僅要考慮細胞生長和產(chǎn)物積累的效率，同時還應(yīng)考慮技術(shù)基礎(chǔ)和生產(chǎn)成本。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑培養(yǎng)技術(shù)的選擇91提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩相培養(yǎng)指在植物細胞培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系由于分配系數(shù)不同而形成上、下兩相，細胞在其中一相中生長并合成次生代謝物，這些次生代謝物又通過主動或被動運輸?shù)姆绞结尫诺桨?，并被另一相所吸附。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩相培養(yǎng)92提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩相培養(yǎng)組成：培養(yǎng)相和提取相組成類型：液-液系統(tǒng)和液-固系統(tǒng)液-液系統(tǒng)：分離相主要使用液體石蠟、烷類化合物。分離相和培養(yǎng)基的化學性質(zhì)和比重不同。液-固系統(tǒng)：是指提取相以固態(tài)形式存在于系統(tǒng)中，主要通過吸附分離目的產(chǎn)物，目前使用的主要有活性炭、硅酸鎂載體、沸石、蠶絲以及樹脂。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩相培養(yǎng)93紅豆杉細胞兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實驗材料：東北紅豆杉細胞系培養(yǎng)基：第一相：B5培養(yǎng)基，第二相：5％(v/v)的松油醇，產(chǎn)物釋放劑：5％(v/v)二甲基亞砜。接種量:10g(鮮重)/100ml培養(yǎng)基/250mL三角燒瓶。培養(yǎng)條件：25℃，120rpm，黑暗培養(yǎng)。紅豆杉細胞兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實驗材料：東北紅豆杉細胞系94■細胞干重；▲紫杉醇產(chǎn)量；兩相系統(tǒng)——；單相系統(tǒng)－－ 第二相的加入，使得紫杉醇產(chǎn)量提高到30.19mg/L，比對照增加103%；63％的紫杉醇從胞內(nèi)的釋放出來，其中有75％轉(zhuǎn)移至有機相?！黾毎芍兀弧仙即籍a(chǎn)量；兩相系統(tǒng)——；單相系統(tǒng)－－ 第二95提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩步培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞在生產(chǎn)培養(yǎng)基中積累產(chǎn)物提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑兩步培養(yǎng)96提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑器官組織的培養(yǎng)培養(yǎng)材料的分化程度，常常影響到藥物的含量。如在條葉龍膽愈傷組織中，龍膽著含量較低，而根的分化可以提高龍膽苦苷的含量發(fā)狀根（毛狀根，hairyroot）培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物，已在人參、丹參、紫草、顛茄和黃芪等植物中進行了探索性研究，并取得良好進展。體細胞胚規(guī)?；囵B(yǎng)用于次生產(chǎn)物的生產(chǎn)在少數(shù)植物中開展了研究。提高植物細胞藥物產(chǎn)量的途徑器官組織的培養(yǎng)97植物細胞培養(yǎng)制藥-課件98毛狀根毛狀根(hairyroots)是發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）感染雙子葉植物后，其Ri質(zhì)粒上的T-DNA片斷整合進植物細胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。毛狀根可以不依賴激素快速生長，根多叢生，多分枝，多根毛，無向地性。1934年，Hildebrand報道了發(fā)根農(nóng)桿菌感染蘋果樹產(chǎn)生發(fā)根毛狀根毛狀根(hairyroots)是發(fā)根農(nóng)桿菌（Agro99生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素青蒿：為雙子葉植物藥菊科植物青蒿素：倍半萜內(nèi)酯類化合物功效：治療瘧疾生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素青蒿：為雙子葉植物藥菊科植1001.Bioreactor,2.Concentricdraughtcylinder,3.Stainlessstellmesh,4.Airoutlet,5.Timer,6.Mistnozzle,7.Medium,8.Airinlet,9.Airfilter,10.Flowmeter,11.Holesondraughtcylinder,12.Electromagneticvalve,13.Airstoragetank,14.Nebulizingdevice,15.40Wfluorescentlamp1.Bioreactor,2.Concentricdra101植物細胞培養(yǎng)制藥-課件102生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素103GrowthfeatureofArtemisiaannuaadventitiousshootinthemistbioreactor(a)0d;(b)10d;10cm30cmGrowthfeatureofArtemisiaa104生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素實驗材料青蒿毛狀根： 由發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)青蒿葉片產(chǎn)生培養(yǎng)方法及條件1.固體培養(yǎng)20～30mm青蒿毛狀根根尖MS固體培養(yǎng)基(添加30g/L蔗糖)繼代時同為15d生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素實驗材料105生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素培養(yǎng)方法及條件 2.液體振蕩培養(yǎng)（三角瓶）接種量：每L培養(yǎng)液（MS）5g毛狀根培養(yǎng)物（分支多且細長的毛狀根）120-130rpm，25±1℃，12h／d光照液體培養(yǎng)的繼代時間為10d。3.反應(yīng)器培養(yǎng)12h／d培養(yǎng)，25±I℃。霧化間隔30min，霧化2min。通氣量為0.5L／min，通氣時間為15mln。生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素培養(yǎng)方法及條件106最大生物量10.3g/L，青蒿素產(chǎn)量達到179.1mg/L，青蒿素的含量為1.74％。最大生物量10.3g/L，青蒿素產(chǎn)量達到179.1mg/L，107植物細胞培養(yǎng)作為工業(yè)化和商業(yè)化生產(chǎn)藥物條件尚不成熟需：（1）深入掌握植物細胞復(fù)雜的調(diào)控機制，從而在反應(yīng)器的大環(huán)境內(nèi)調(diào)控細胞培養(yǎng)過程中的微環(huán)境，使其朝著有利細胞生長的方向發(fā)展。（2）把生物學知識和工程技術(shù)（包括生化工程、控制工程和機械工程等）領(lǐng)域的知識兩方面緊密配合，提高反應(yīng)器的空間利用率及細胞培養(yǎng)過程中的自動化程度。（3）從生命科學和植物細胞的本質(zhì)上思考和進行植物細胞反應(yīng)器的研究，在用于植物細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的研制工作中取得根本的突破。植物細胞培養(yǎng)作為工業(yè)化和商業(yè)化生產(chǎn)藥物條件尚不成熟需：108小結(jié)細胞規(guī)?；囵B(yǎng)有可能成為新型生化工業(yè)的重要途徑，細胞懸浮培養(yǎng)是細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的基礎(chǔ)。各種單細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞克隆的基礎(chǔ)技術(shù)，也適用于植物花粉培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。高等生物細胞規(guī)模化培養(yǎng)體系的建立必須于生物反應(yīng)器的研制相匹配。根據(jù)目的產(chǎn)物建立包括培養(yǎng)基、種細胞、培養(yǎng)方式等在內(nèi)的一系列配套技術(shù)是商業(yè)化的前體。小結(jié)細胞規(guī)模化培養(yǎng)有可能成為新型生化工業(yè)的重要途徑，細胞懸浮109思考題1．一個好的懸浮細胞系有哪些特征？用于建立懸浮細胞系的愈傷組織有何要求？2．建立懸浮細胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些？3．懸浮細胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長規(guī)律4．細胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？5．植物細胞規(guī)模培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn)前景及需要研究解決的問題。思考題1．一個好的懸浮細胞系有哪些特征？用于建立懸浮細胞系的110例1.培養(yǎng)水母雪蓮細胞產(chǎn)生黃酮類化合物材料：水母雪蓮愈傷組織紅色系細胞系培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，附加0.5mg／L6BA、2mg／LNAA、30g／L蔗糖、10g／L葡萄糖，pH5.8。種子培養(yǎng)：愈傷組織在500ml三角瓶中（裝瓶量150ml）培養(yǎng)一段時間，作為生物反應(yīng)器的接種液（種子）。培養(yǎng)期間采用日光燈連續(xù)照射，培養(yǎng)溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速100r／min。例1.培養(yǎng)水母雪蓮細胞產(chǎn)生黃酮類化合物材料：111細胞大量培養(yǎng)反應(yīng)器：2L機械攪拌式，工作體積l.4L。通氣：空氣由空氣泵通過轉(zhuǎn)子流量計經(jīng)由空氣過濾器進入反應(yīng)器。滅菌：操作前反應(yīng)器在121℃下高壓滅菌35min，培養(yǎng)基在121℃單獨滅菌18min。接種：待反應(yīng)器冷卻至室溫，種子和培養(yǎng)液由頂部接口傾倒入反應(yīng)器內(nèi)。培養(yǎng)條件：設(shè)置好通氣速率和攪拌轉(zhuǎn)速，溫度自動控制在（25±2）℃。在反應(yīng)器外用熒光燈和白熾燈照明。細胞大量培養(yǎng)反應(yīng)器：2L機械攪拌式，工作體積l.4L112重要的影響因子及相關(guān)參數(shù)1．攪拌速度不同攪拌轉(zhuǎn)速下細胞生長和黃酮產(chǎn)量的比較轉(zhuǎn)速（r/min）50657585生長速率/d0.210.250.260.25干重（g/L）7.509.7011.49.20生物量加倍時間(d)3.202.702.702.70黃酮產(chǎn)量(g/L)0.200.270.320.25黃酮含量(mg/g)26.727.828.127.2重要的影響因子及相關(guān)參數(shù)1．攪拌速度轉(zhuǎn)速（r/min）501132．接種量（以干細胞計）在低密度(<l.5g/L)培養(yǎng)時細胞增長幾乎停止在4-5g/L，黃酮產(chǎn)量隨密度增大明顯增加大于6g／L，細胞出現(xiàn)褐化死亡，黃酮產(chǎn)量出現(xiàn)下降。反應(yīng)器內(nèi)細胞的最適接種量高于搖瓶的最適接種量（搖瓶一般為2.5～4.0g干重/L)。2．接種量（以干細胞計）在低密度(<l.5g/L)培養(yǎng)時細胞1143.細胞生長和黃酮生物合成動態(tài)變化過程水母雪蓮在培養(yǎng)期間，攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量分別維持在75rpm和700～1000L／min。細胞經(jīng)過4d的延遲期后，第4～9d為對數(shù)生長期，12d時細胞生長達到高峰，最大細胞濃度（以干重計）達到13.8g／L，隨后進入靜止期，黃酮在細胞中的積累與細胞生長基本平行，可見，黃酮積累與細胞生長正相關(guān)，這與紫草寧的生物合成發(fā)生在細胞生長的靜止期不同（董教望等，1993）。在反應(yīng)器培養(yǎng)中，黃酮產(chǎn)量在培養(yǎng)的第12d達到最高，為416mg／L。3.細胞生長和黃酮生物合成動態(tài)變化過程水母雪蓮在培養(yǎng)期間1154糖利用動態(tài)變化過程在培養(yǎng)的當天，初始蔗糖濃度有所降低，這是因為小部分初始蔗糖經(jīng)過高溫滅菌能分解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)開始后蔗糖濃度迅速下降，到第3d只有約5g／L，第5d后培養(yǎng)基中已檢測不到蔗糖，葡萄糖在3d后才得到快速利用。培養(yǎng)基中蔗糖濃度的迅速降低在許多植物中被觀測到，如白蓮草（Thalictrmrugosum）（Kim，1991）。Enaksha根據(jù)對紅豆杉細胞培養(yǎng)的研究認為，細胞在其表面分泌或含有過多的轉(zhuǎn)化酶（invertase），導(dǎo)致蔗糖分解產(chǎn)生了大量的單糖。4糖利用動態(tài)變化過程在培養(yǎng)的當天，初始蔗糖濃度有所降低，1165聚集體分布反應(yīng)器內(nèi)聚集體分布隨培養(yǎng)進程而發(fā)生變化1-2mm的聚集體含量在培養(yǎng)后期明顯增加，而2-3mm的聚集體含量卻相應(yīng)減少。細胞聚集體分布集中在較小尺寸通過比較12d時搖瓶和反應(yīng)器細胞聚集體分布發(fā)現(xiàn)，搖瓶中1-2mm的聚集體含量低于反應(yīng)器，其他部分則高于反應(yīng)器。聚集體大小與黃酮合成密切相關(guān)，2-3mm和3-4mm的聚集體中黃酮含量較其他部分高。5聚集體分布反應(yīng)器內(nèi)聚集體分布隨培養(yǎng)進程而發(fā)生變化117例2.植物細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)小蘗堿1．材料 小蘗的愈傷組織細胞2.培養(yǎng)基 B5，MS培養(yǎng)基 3．培養(yǎng)過程培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速為250r/min,溫度25℃。 培養(yǎng)一段時間細胞濃度增加后，進行繼代培養(yǎng)。例2.植物細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)小蘗堿1．材料118培養(yǎng)基影響小蘗的愈傷組織細胞在B5培養(yǎng)基中的生長要好于MS培養(yǎng)基。激素的影響生長激素對細胞生長的作用效果順序為2,4-D>IAA>NAA對小蘗堿合成的影響順序則是NAA>2,4-D＞IAAKT對于細胞生長和小蘗堿合成的作用均優(yōu)于BA影響因素分析培養(yǎng)基影響影響因素分析119影響因素分析碳源影響蔗糖對小蘗堿合成具有促進作用，最佳濃度為3％果糖和葡萄糖雖能促進細胞生長，但是對于小蘗堿的合成有抑制作用氮源影響提高培養(yǎng)基中銨離子的濃度有利于原小蘗堿型生物堿的產(chǎn)生影響因素分析碳源影響120提高銅離子的濃度也能顯著促進小蘗堿的合成物理因子也會對細胞生長和小蘗堿的合成產(chǎn)生影響。如光照會抑制小蘗堿的生成較高的通氣量有助于細胞生長和小蘗堿的積累影響因素分析提高銅離子的濃度也能顯著促進小蘗堿的合成影響因素分析121植物細胞培養(yǎng)制藥意義 藥用植物是天然藥物的寶庫 植物細胞培養(yǎng)是生產(chǎn)的藥物可能途徑目前采用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物主要包括

（1）苷（甙）類：包括皂苷（人參皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、強心苷（強心醇苷、毛地黃毒配質(zhì)衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。（2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽甾醇、異巖藻甾醇等。

植物細胞培養(yǎng)制藥意義122強心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)）甾醇強心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)）甾醇123（3）生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。（4）醌類：包括蒽醌、萘醌等。（5）蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑。植物病毒抑制劑、植物抗生素等。（6）黃酮類：具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，生物合成前體是苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A。多為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。小檗堿蒽醌黃酮（3）生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。小檗堿蒽醌黃酮124植物細胞培養(yǎng)制藥進展第一個專利：1956年Routin和Nickell首次數(shù)提出利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物的第一個專利工業(yè)植物生物技術(shù)：20世紀90年代明確提出已經(jīng)從200余種藥用植物獲得了愈傷組織或細胞懸浮培養(yǎng)物（傅經(jīng)國等，2004）國際日本：紫草人參紅豆杉歐美：美國－紅豆杉；德國－紫錐菊國內(nèi)：羅士韋葉和春鄭光植侯嵩生丁家宜植物細胞培養(yǎng)制藥進展第一個專利：1956年Routin和N125技術(shù)路線

目標植物選擇→愈傷組織誘導(dǎo)→→液體培養(yǎng)→→培養(yǎng)條件的優(yōu)化→→反應(yīng)器擴大培養(yǎng)→愈傷組織誘導(dǎo)→→固體、液體培養(yǎng)→→高產(chǎn)細胞系篩選→→生物合成途徑的研究→器官分化（發(fā)狀根）→→固體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化→→反應(yīng)器擴大培養(yǎng)→→有效成分提取、分離技術(shù)路線目標植物選擇126植物細胞培養(yǎng)是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細胞的一種技術(shù)。植物細胞培養(yǎng)是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分散的127植物細胞培養(yǎng)的特點:⑴大小;⑵細胞團的形式存在;⑶纖維素細胞壁和大液泡,易被剪切力損傷;⑷生長緩慢⑸培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜,易被微生物污染;⑹需光\氧\二氧化碳植物細胞培養(yǎng)的特點:⑴大小;128培養(yǎng)類型按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)；按培養(yǎng)基類型可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式可分為懸浮細胞培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)類型按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)；129植物單細胞分離和初步培養(yǎng)單細胞獲得：機械法；酶解法；愈傷組織法單細胞培養(yǎng)：看護培養(yǎng)法（nursingculture)飼養(yǎng)層培養(yǎng)(feedinglayerculture)植物單細胞分離和初步培養(yǎng)單細胞獲得：130固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝人培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。優(yōu)缺點簡便易行、所占空間小生長的不平衡，易出現(xiàn)了極化現(xiàn)象易堆積生長過程中排出的有害物質(zhì)有些生理生化指標測定不方便常用的固化劑瓊脂、明膠（10%）等固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后131液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture細胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液體積不變,不添加營養(yǎng)成分,待細胞增長和產(chǎn)物積累到適當?shù)臅r間,一次性收獲細胞\產(chǎn)物和培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法.液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture132液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture特點：操作簡單，培養(yǎng)周期短.直接反映細胞生長代謝過程.可直接放大不能控制底物濃度\細胞易老化\生長周期短\效率低.兩步成批培養(yǎng)法即使用兩個生物反應(yīng)器，第一個反應(yīng)器用于細胞生物量的累積，第二個反應(yīng)器用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture1332.半連續(xù)培養(yǎng)法semi-continuousculture重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng).在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中,每間隔一段時間從中取出部分培養(yǎng)液或細胞,剩余的細胞作為種子,再用新的培養(yǎng)液補足到原體積,使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變.特點:細胞可持續(xù)指數(shù)生長,并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平,培養(yǎng)過程中可延續(xù)很長時間.可進行多次收獲.操作簡便,生產(chǎn)效率高.植物細胞培養(yǎng)制藥-課件1343．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)連續(xù)培養(yǎng)法是利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時間后，以一定速度連續(xù)采集細胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法。該法的理論基礎(chǔ)是根據(jù)Monod公式，即生長速度取決于基質(zhì)的濃度。μ＝μmax·S/(Ks+S) μ=特定生長速度；μmax=特定最大生長速度；Ks=飽和系數(shù)；S=基質(zhì)濃度兩階段連續(xù)培養(yǎng)法于第一反應(yīng)器中投入生長培養(yǎng)基并連續(xù)加入該培養(yǎng)基，而于第二反應(yīng)器中投入生產(chǎn)培養(yǎng)基。

3．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)連續(xù)培1353．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)特點:細胞能在近似恒定狀態(tài)下生長、營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH基本保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率可基本維持不變，細胞維持持續(xù)指數(shù)增長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。3．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)特點:1363．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)問題:一直有細胞收獲，濃度一般不高細胞分裂快、易變異；由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。3．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)問題:137懸浮培養(yǎng)（Suspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。特點1.培養(yǎng)細胞可不斷增殖，且生長速度快。2.液體狀態(tài)下便于細胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細胞狀態(tài)可以相對保持一致。懸浮培養(yǎng)（Suspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細138細胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導(dǎo)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細胞的生長動態(tài)懸浮細胞同步化細胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導(dǎo)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細139愈傷組織的誘導(dǎo)選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高激素濃度；必要的附加物質(zhì)。愈傷組織的誘導(dǎo)選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。140要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的141懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150~250mlflaskcentrifugeisolationsubculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150~250mlflask142植物細胞培養(yǎng)制藥-課件143成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系特征懸浮培養(yǎng)分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下。均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天便可增加一倍。成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系特征懸浮培養(yǎng)分散性良好，細胞團較小，一144植物細胞培養(yǎng)制藥-課件145植物細胞培養(yǎng)制藥-課件146懸浮細胞的生長動態(tài)懸浮細胞的生長動態(tài)147懸浮細胞生長的衡量根據(jù)不同培養(yǎng)時間的細胞數(shù)變化，或細胞質(zhì)量變化。生長速率(p)：不同時間細胞密度(x)的自然對數(shù)與起始密度(x0)的自然對數(shù)之差與培養(yǎng)時間(t)的比值 p＝(lnx-lnx0)/t鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應(yīng)細胞生長情況干重：鮮細胞烘干至衡重，反應(yīng)細胞質(zhì)量懸浮細胞生長的衡量根據(jù)不同培養(yǎng)時間的細胞數(shù)變化，或細胞質(zhì)量變148影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質(zhì)量接種細胞密度：懸浮細胞的起始密度一般在0.5~2.5×105個細胞/毫升。接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長。最低有效密度：即能使細胞分裂、增殖的最低接種量。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質(zhì)量149影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)基應(yīng)用條件培養(yǎng)基（生長過愈傷組織或懸浮細胞的液體培養(yǎng)基）提供單細胞生長和分裂所需的特殊代謝物?；九囵B(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目的而定培養(yǎng)基設(shè)計時,一般均以誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進行調(diào)整。常用的培養(yǎng)基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的應(yīng)用。影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)基150影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)溫度25℃繼代周期指具有一定起始密度的細胞,從開始培養(yǎng)到細胞數(shù)目和總重量增長停止的一個過程。培養(yǎng)周期的長短是由起始細胞密度、延遲期的長短、生長速率等決定。繼代培養(yǎng)（Subculture）：繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁殖培養(yǎng)過程。影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌式151懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。植物細胞在懸浮培養(yǎng)中容易團聚并進入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達到完全同步化是十分困難的。同一培養(yǎng)體系的植物細胞經(jīng)常不能處于同一細胞周期，這種差異使懸浮細胞分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等復(fù)雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細胞達到相對同步化。什么措施？懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都152細胞周期細胞周期153饑餓法饑餓導(dǎo)致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。氮饑餓時，通常獲得G1期的同步化細胞磷和碳饑餓時，獲得G1和G2期的同步化細胞。將饑餓細胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時，細胞分裂又可重新恢復(fù)。饑餓法饑餓導(dǎo)致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不154抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期(G1)的同步化細胞。常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷(FudR)和羥基尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細胞培養(yǎng)中已有成功應(yīng)用。利用破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA155分選法依據(jù)：細胞體積大小方法常規(guī)分選方法是梯度離心精細的分選可采用流式細胞儀優(yōu)點操作簡單分選細胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它處理帶來的副作用缺點分選精細度較差分選法依據(jù)：細胞體積大小156低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細胞較好地同步化。梅興國等（2001）采用6℃低溫處理紅豆杉細胞也獲得較明顯同步化效果?？赡艿脑虿煌臏囟葘毎挠薪z分裂有極明顯的影響，在一定范圍內(nèi)，溫度下降使細胞分裂速度減慢，細胞周期延長，從而相應(yīng)地延長了分裂期的時間，使分裂指數(shù)提高，細胞同步化率升高。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度157單細胞培養(yǎng)意義分離方法機械法酶解法培養(yǎng)方法平板培養(yǎng)看護培養(yǎng)微室培養(yǎng)雙層濾紙培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)意義158單細胞分離方法機械法具體做法：將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團優(yōu)點：細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生化研究。單細胞分離方法機械法159單細胞分離方法酶解法酶對細胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高游離細胞的產(chǎn)量。酶解法的優(yōu)點可獲得較多的葉肉游離細胞（但對禾本科植物葉片效果不好）。單細胞分離方法酶解法160細胞平板培養(yǎng)（platingculture)指將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。Bergman(1960)首創(chuàng)單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞。單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×103個/毫升植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。細胞平板培養(yǎng)（platingculture)指將一定密度的161細胞平板培養(yǎng)（platingculture)平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞總和中所占的比例。每個平板形成的細胞團數(shù)植板率＝每個平板接種的細胞總數(shù)細胞平板培養(yǎng)（platingculture)平板培養(yǎng)的效果162細胞平板培養(yǎng)（platingculture)優(yōu)點： ①單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察，是單細胞株篩選和突變體篩選的常用方法。 ②由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。細胞平板培養(yǎng)（platingculture)優(yōu)點：163細胞懸浮過濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈傷組織細胞懸浮過濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈164看護培養(yǎng)（nurseculture）Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細胞體系。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程?？醋o培養(yǎng)（nurseculture）Muir(1953)首165植物細胞培養(yǎng)制藥-課件166微室培養(yǎng)(microchamberculture)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。由Jones等在1960年設(shè)計的。優(yōu)點：可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化等過程缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。細胞起始密度：30～80個/室。微室培養(yǎng)(microchamberculture)在人工制167植物細胞培養(yǎng)制藥-課件168雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞層培養(yǎng)細胞看護濾紙轉(zhuǎn)移濾紙雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼169固定化培養(yǎng)法將細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)稱為細胞固定化培養(yǎng)。固定化培養(yǎng)采用的固定化反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中空纖維膜等多種類型，將細胞固定于尼龍網(wǎng)套內(nèi)，或固定于中空纖維反應(yīng)器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。固定化培養(yǎng)法將細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)稱為細170與懸浮培養(yǎng)相比，固定化培養(yǎng)的優(yōu)點：①提高了藥物的合成、積累；②能長時間保持細胞活力；③可以反復(fù)使用；④抗剪切能力強；⑤耐受有毒前體物質(zhì)的濃度高；⑥遺傳性狀較穩(wěn)定；⑦后處理難度小。與懸浮培養(yǎng)相比，固定化培養(yǎng)的優(yōu)點：171固定化植物細胞培養(yǎng)技術(shù)要進入工業(yè)化生產(chǎn)有許多問題尚待解決。首先，固定化培養(yǎng)要求代謝產(chǎn)物必須是分泌到細胞外的。第二，植物細胞藥物的積累是不連續(xù)的，這也限制了固定化細胞方法的應(yīng)用。第三，易污染。Flash固定化植物細胞培養(yǎng)技術(shù)要進入工業(yè)化生產(chǎn)有許多問題尚待解決。F172植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立生物反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)的技術(shù)問題植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)規(guī)模化培養(yǎng)體系的建立173植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求 從工程的角度講必須要進一步研究和開發(fā)適宜于植物生長和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)；從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個條件：培養(yǎng)的細胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。細胞生長速度快，短時間內(nèi)能生產(chǎn)較多產(chǎn)物產(chǎn)物不被迅速降解，最好能分泌到培養(yǎng)基中植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求 從工程的角度講必須要進一步研究174植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)體系的建立種子細胞選擇種子細胞增殖與放大培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)體系建立植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立種子細胞選擇175種子細胞選擇外植體選擇植物類型：遺傳基礎(chǔ)。在確定生產(chǎn)某一種化合物以后，首先必須準確選擇那些能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類及品種或單株。組織器官：由于天然產(chǎn)物一般為次生代謝產(chǎn)物，而植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有組織器官的特異性，因此，在起始細胞培養(yǎng)時盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織作為外植體。種子細胞選擇外植體選擇176種子細胞選擇高產(chǎn)細胞系的篩選懸浮細胞系單細胞克隆種細胞增殖種子細胞選擇高產(chǎn)細胞系的篩選177種子細胞增殖與放大培養(yǎng)目的準備材料提供技術(shù)參數(shù)過程搖瓶反應(yīng)器種子細胞增殖與放大培養(yǎng)目的178大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)方式成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方式的選擇根據(jù)次生產(chǎn)物積累而定，通常還根據(jù)不同要求進行改進。如當細胞生長和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基時，就需要采用兩步法培養(yǎng)，先在細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細胞，當細胞生長至合成產(chǎn)物的階段后，將其轉(zhuǎn)至產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在產(chǎn)物合成階段又可采用連續(xù)培養(yǎng)方式以延長細胞生產(chǎn)時間。大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)方式179生物反應(yīng)器類型及特點是指用于高等生物細胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。適合植物細胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)該具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。攪拌式氣動式固定化式其它—光照生物反應(yīng)器，轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器類型及特點是指用于高等生物細胞批量化培養(yǎng)的裝置及其180反應(yīng)器類型體積（L）培養(yǎng)植物種類攪拌式7，15D.carota胡蘿卜攪拌式20，15500N.tabacum煙草攪拌式5000C.roseus長春花螺旋攪拌式20C.blumei五彩蘇提升攪拌式2.5P.elliotii濕地松鼓泡式20，30，130P.ginseng人參鼓泡式65，1500N.tabacum煙草外環(huán)氣升式10，30，85C.roseus長春花導(dǎo)筒氣升式20，210D.lanata狹葉毛地黃轉(zhuǎn)鼓式1－4V.rosea長春花植物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器反應(yīng)器類型體積（L）培養(yǎng)植物種類攪拌式7，15D.caro181攪拌式反應(yīng)器是根據(jù)植物細胞特性在微生物發(fā)酵罐基礎(chǔ)上改進而成。攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式。必須設(shè)計加液裝置必須設(shè)計通氣裝置適宜的取樣口攪拌式反應(yīng)器是根據(jù)植物細胞特性在微生物發(fā)酵罐基礎(chǔ)上改進