最新基因工程講稿52課件

基因工程講稿52基因工程講稿521哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)常用的顯性選擇標(biāo)記哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)常用的顯性選擇標(biāo)記2最新基因工程講稿52課件3最新基因工程講稿52課件4最新基因工程講稿52課件5最新基因工程講稿52課件6最新基因工程講稿52課件7最新基因工程講稿52課件8(2)HAT選擇法由于選擇TK+細(xì)胞的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)，所以叫做HAT選擇法。(2)HAT選擇法由于選擇TK+細(xì)胞的培養(yǎng)基含有9基本原理：如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(APT)處理細(xì)胞，二氫葉酸還原酶便被抑制，培養(yǎng)基中的還原輔助因子四氫葉酸因得不到補(bǔ)充而逐漸耗盡，于是從dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻斷。但次黃嘌呤是dATP和dGTP補(bǔ)救合成途徑的一種底物，培養(yǎng)基中補(bǔ)加有此種物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，繼續(xù)合成出這些脫氧嘌呤三磷酸(dATP和dGTP)。基本原理：如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(APT)處理細(xì)胞，二氫10

由于在HAT培養(yǎng)基中補(bǔ)加有外源的胸苷，所以TK+細(xì)胞通過胸苷激酶的作用可把它合成為dTTP，繼續(xù)存活下去；而TK-細(xì)胞則不會(huì)發(fā)生這種合成，因而死亡。把正常的tk基因?qū)隩K-細(xì)胞，它們也就照樣能夠存活下去。所以使用HAT培養(yǎng)基，能夠選擇出由tk基因轉(zhuǎn)化而來的TK+細(xì)胞。由于在HAT培養(yǎng)基中補(bǔ)加有外源的胸苷，所以TK+細(xì)胞11(3)共轉(zhuǎn)化選擇

1)共轉(zhuǎn)化選擇的基本過程

HAT選擇法可以用來分離以tk基因作選擇標(biāo)記的外源DNA轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。(3)共轉(zhuǎn)化選擇HAT選擇法可以用來分離以tk基12在磷酸鈣沉淀中，兩種DNA分子的混合物，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。根據(jù)這種共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，結(jié)合磷酸鈣共沉淀技術(shù)，人們可以將無選擇標(biāo)記的DNA同具tk選擇標(biāo)記基因的DNA進(jìn)行混合轉(zhuǎn)化，發(fā)展出了共轉(zhuǎn)化選擇體系，從而解決了不具tk選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子的選擇問題。在磷酸鈣沉淀中，兩種DNA分子的混合物，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化13最新基因工程講稿52課件143．二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng)(1)基本原理

二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)在真核細(xì)胞的核苷酸生物合成中起著重要的作用，它催化二氫葉酸(DHF)還原成四氫葉酸(THF)。這個(gè)反應(yīng)過程受到葉酸的類似物氨基蝶呤(aminopterin，APT)和氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。3．二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng)(1)基本原理15如果細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有這些抑制物，例如氨甲蝶呤，其濃度只要達(dá)0.1μg／ml，就會(huì)阻斷核苷酸生物合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如果細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有這些抑制物，例如氨甲蝶呤，其濃16（2）常用的基因:

1)小鼠3T6成纖維細(xì)胞的突變系3T6—400來源的突變dhfr基因。由它合成的突變二氫葉酸還原酶與正常酶相比，同MTX的結(jié)合能力下降了270倍。因此，用突變細(xì)胞呈抗性反應(yīng)的MTX濃度，就可以把野生型細(xì)胞殺死，達(dá)到了顯性選擇的目的。如果把突變基因dhfrMTX導(dǎo)入正常的細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子也就獲得了抗性。

（2）常用的基因:1)小鼠3T6成纖維細(xì)胞的突變系3T172)另一個(gè)dhfr顯性選擇標(biāo)記是位于細(xì)菌抗藥性因子R388上的dhfr基因。它編碼的二氫葉酸還原酶，實(shí)際上就可以抗MTX的抑制作用。

2)另一個(gè)dhfr顯性選擇標(biāo)記是位于細(xì)菌抗藥性因子R388184．氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)是由大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子上的cat基因編碼的，它能夠催化乙?；鶊F(tuán)從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上，導(dǎo)致一個(gè)或兩個(gè)羥基發(fā)生乙?；饔茫瑥亩蛊涫セ钚?。這個(gè)基因可以作為檢測(cè)外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的一種十分敏感的標(biāo)記基因，尤其是適用于瞬時(shí)表達(dá)的研究。4．氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(195．氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因也經(jīng)常用Eco-neo表示，它是氨基糖苷類抗菌素的抗性基因，所編碼的APH酶可以使此類抗菌素，如G418失去活性。氨基糖苷抗菌素G418，即3’-脫氧鏈霉胺(3’-deoxystreptamine)，在結(jié)構(gòu)上同卡那霉素、新霉素及慶大霉素十分相似。它通過抑制70S核糖體的功能而阻斷真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成，造成細(xì)胞死亡。因此，為我們提供了一種不需要特殊突變細(xì)胞的顯性選擇系統(tǒng)。5．氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移20二、外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法1．磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)(1)磷酸鈣轉(zhuǎn)染的基本步驟

通過磷酸鈣DNA共沉淀，將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的技術(shù)程序，最初是由Graham等人于1973年創(chuàng)立的。應(yīng)用這種方法，能夠?qū)⑷魏蔚耐庠碊NA有效地導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，目前仍被許多實(shí)驗(yàn)室廣泛地使用。磷酸鈣轉(zhuǎn)染法的基本操作過程包括：二、外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法1．磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)(1)21①將待轉(zhuǎn)染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2—DNA溶液；②在不斷攪拌過程中，逐滴緩慢地加入到Hepes—磷酸鈣溶液中去，形成一種磷酸鈣-DNA共沉淀；③然后用吸管仔細(xì)轉(zhuǎn)移共沉淀物，使之粘附到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物單層細(xì)胞表面，就會(huì)迅速地被細(xì)胞所捕獲。①將待轉(zhuǎn)染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2—D22保溫幾小時(shí)后，將細(xì)胞洗凈，并更換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至最終實(shí)現(xiàn)外源DNA的高水平表達(dá)。依培養(yǎng)細(xì)胞的不同類型而異，平均每個(gè)培養(yǎng)皿中約有10％的細(xì)胞捕獲了外源轉(zhuǎn)染DNA。據(jù)報(bào)道，添加甘油或DMSO(二甲基亞砜)會(huì)增加某些類型細(xì)胞吸收外源DNA的數(shù)量。保溫幾小時(shí)后，將細(xì)胞洗凈，并更換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培23(2)影響磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率的因素*DNA—磷酸鈣共沉淀物中DNA的數(shù)量；*共沉淀物與細(xì)胞接觸的保溫時(shí)間；*甘油或DMSO等促進(jìn)因子作用的持續(xù)時(shí)間等。(2)影響磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率的因素*DNA—磷酸鈣共沉淀物中D242．DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)

二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)，簡(jiǎn)稱DEAE-葡聚糖，是一種高分子量的多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源的DNA，實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)的有效表達(dá)。這種轉(zhuǎn)染技術(shù)最初是設(shè)計(jì)用來分析脊髓灰質(zhì)炎病毒(Polisvirus)RNA的感染性，其后經(jīng)過改良又被用著分析SV40及多瘤病毒DNA的感染性。2．DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)二乙氨乙基葡聚糖(die25(1)DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染的一般程序

處理方式：1）先使病毒的DNA與DEAE-葡聚糖混合，形成DNA／DEAE葡聚糖復(fù)合物；2）受體細(xì)胞先用DEAE-葡聚糖溶液作預(yù)處理，然后再用來與轉(zhuǎn)染的DNA接觸。注意：處理前要用等滲溶液漂洗，除去培養(yǎng)液中的血清成分。(1)DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染的一般程序處理方式：1）先使病26DEAE-葡聚糖的使用濃度為100-1000g／ml之間。一般在低濃度(200g／ml)和較長(zhǎng)的持續(xù)處理時(shí)間(8h或16h)的條件下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源DNA的效率比較高。若在DEAE-葡聚糖處理之后，再加入DMSO等促進(jìn)因子，還可以進(jìn)一步提高效率。最高感染率可達(dá)80％。DEAE-葡聚糖的使用濃度為100-1000g／m27(2)DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染的可能機(jī)理及影響因素分子機(jī)理不十分清楚，曾經(jīng)提出過幾種較為合理的解釋。一種認(rèn)為DEAE-葡聚糖同DNA結(jié)合成復(fù)合物，可以保護(hù)DNA免受核酸酶的降解作用；另一種則認(rèn)為DEAE-葡聚糖可以同細(xì)胞膜發(fā)生作用，從而使DNA能夠容易地穿過細(xì)胞表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。(2)DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染的可能機(jī)理及影響因素分子機(jī)28有許多因素都會(huì)影響DEAE-葡聚糖的轉(zhuǎn)染效率，其中以細(xì)胞的數(shù)量、DNA的濃度和DEAE-葡聚糖的濃度最為重要。

大體上說，按每個(gè)直徑10cm的培養(yǎng)皿中加入1-10μg的轉(zhuǎn)染DNA，并使用每毫升培養(yǎng)基含100～400μgDEAE-葡聚糖的溶液，對(duì)于絕大多數(shù)類型的細(xì)胞，都能得到很好的轉(zhuǎn)染效率。由于DEAE-葡聚糖對(duì)有些細(xì)胞具有毒性，因此用低濃度溶液作短時(shí)間的接觸反應(yīng)較為合適。有許多因素都會(huì)影響DEAE-葡聚糖的轉(zhuǎn)染效率，其中以29(3)DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn):方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、以及轉(zhuǎn)染效率高于磷酸鈣法等。不足：不能產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。原因可能是同DNA組裝成微型染色體有關(guān)。因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)報(bào)道，一旦質(zhì)粒DNA進(jìn)入經(jīng)過DEAE-葡聚糖處理的細(xì)胞，它就會(huì)迅速地組裝成含核小體的微型染色體。(3)DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn):方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性30磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)十分有效而且易于重復(fù)，但最適轉(zhuǎn)染條件的范圍比較窄，為此發(fā)展出技術(shù)條件并不十分苛刻的聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染技術(shù)。3．聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：用聚陽離子Polybrene(聚溴化季銨陽離子的商品名)處理，增加DNA對(duì)細(xì)胞表面的吸附能力；再用25％～30％的DMSO短暫處理細(xì)胞以增加膜的通透性，提高對(duì)DNA的捕獲數(shù)量。磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)十分有效而且易于重復(fù)，但最適轉(zhuǎn)染條件31按此法測(cè)定反轉(zhuǎn)錄病毒DNA的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果是同DNA的加入量成正比，而且不需要加運(yùn)載DNA(carrierDNA)就可得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染技術(shù)的通用性尚未驗(yàn)證，但已知可適用于雞胚細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。按此法測(cè)定反轉(zhuǎn)錄病毒DNA的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果是同DNA的加324．基因顯微注射技術(shù)

應(yīng)用玻璃顯微注射器，可以把重組DNA直接注射到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。根據(jù)DNA注射的方式不同，可以把顯微注射區(qū)分為真正的顯微注射(truemicroinjection)法和“穿刺”(pricking)導(dǎo)入法兩種。顯微注射，DNA是由注射針直接注入細(xì)胞；而在穿刺中，DNA是處在細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中，它通過穿刺形成的小孔進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)部，或是隨穿刺的針頭一道進(jìn)入的。4．基因顯微注射技術(shù)應(yīng)用玻璃顯微注射器，可以把重組D33(1)顯微注射法用顯微注射法轉(zhuǎn)移基因的效率明顯地超出其它方法。如把tk-DNA注射到小鼠tk-細(xì)胞，結(jié)果有50％～100％的受注射細(xì)胞能瞬時(shí)表達(dá)胸苷激酶的活性。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，取決于注射的DNA的性質(zhì)。(1)顯微注射法用顯微注射法轉(zhuǎn)移基因的效率明顯地超34※如一個(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，一組用pBR322／HSV-1tk重組DNA注射，結(jié)果在500～1000個(gè)受注射細(xì)胞中，只有一個(gè)轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子；另一組用連接著特定的SV40序列的pBR322／HSV-1tk重組DNA注射，結(jié)果平均每5個(gè)受注射細(xì)胞中便有一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化頻率達(dá)20％?！缫粋€(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，一組用pBR322／HSV-1tk重組35穿刺法是使用顯微注射針穿刺細(xì)胞及細(xì)胞核，而把外源DNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞核的一種特殊的顯微注射法。(2)穿刺法操作過程：I、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入蛋白酶及EDTA溶液，于37℃下消化15分鐘；II、移去消化液，并用培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞之后，在每個(gè)直徑為6.0cm的培養(yǎng)皿中接種(1～5)x103細(xì)胞，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)過夜；穿刺法是使用顯微注射針穿刺細(xì)胞及細(xì)胞核，而把外源DN36III、在穿刺前棄去培養(yǎng)基，用pH7.2的磷酸緩沖液(PBS)漂洗2次，然后加入濃度為5～1000μg／ml的供體DNA，覆蓋于培養(yǎng)細(xì)胞表面；IV、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿刺處理；V、穿刺后，馬上移去PBS—DNA溶液，換上正常培養(yǎng)基，隨后再換上選擇培養(yǎng)基。III、在穿刺前棄去培養(yǎng)基，用pH7.2的磷酸緩沖液(PB375．電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)操作程序：

將盛有細(xì)胞和DNA混合液的特制小容器置于電脈沖儀的正負(fù)電極之間，在0℃下加高壓(2.0～4.0kV)電脈沖10秒鐘后，將處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天，再行篩選。5．電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)操作程序：將盛有細(xì)胞和DN38

※經(jīng)過這樣處理所得到的存活細(xì)胞的回收率約有60％～80％。※如果在電穿孔之前，先用秋水仙酰胺(colcemid)預(yù)處理細(xì)胞10小時(shí)，可提高轉(zhuǎn)化效率3～10倍。這很可能是由于在這類中期停頓(metaphasearrest)的細(xì)胞中，細(xì)胞核處于無膜狀態(tài)，或是此時(shí)核膜具有較高通透性的緣故?！?jīng)過這樣處理所得到的存活細(xì)胞的回收率約有60％～80％39

應(yīng)用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)移基因到哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞，平均每l05個(gè)活細(xì)胞中，可獲得25～30個(gè)轉(zhuǎn)化子。現(xiàn)在這種方法已成功地應(yīng)用于許多細(xì)胞系，包括小鼠淋巴細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、大鼠垂體細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。應(yīng)用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)移基因到哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞，平均每l406．脂質(zhì)體載體法以脂質(zhì)體為媒介的外源DNA導(dǎo)入受體的方法，叫做脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。第一種常用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法是，將外源DNA與陽離子型的脂質(zhì)體混合形成DNA-脂質(zhì)復(fù)合物(DNA-lipidcomplex)。這種復(fù)合物可有效地被受體細(xì)胞捕獲，實(shí)現(xiàn)基因的高頻率轉(zhuǎn)移，故這種方法又叫做DNA-脂質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)染法。

*在這個(gè)過程中，DNA并不是被包裝在脂質(zhì)體的內(nèi)部，而是通過兩者之間的靜電引力作用結(jié)合在一起的。6．脂質(zhì)體載體法以脂質(zhì)體為媒介的外源DNA導(dǎo)入受體的方41第二種常用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法叫做脂質(zhì)體載體法。它是將外源DNA包裝在脂質(zhì)體的內(nèi)部，然后通過脂質(zhì)體的雙層膜同受體細(xì)胞膜之間的融合作用，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，爾后再進(jìn)入細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)。第二種常用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法叫做脂質(zhì)體載體法。它是將外源D427．哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因定點(diǎn)插入(1)基因定點(diǎn)插入的分子基礎(chǔ)20世紀(jì)80年代后期發(fā)展的基因定點(diǎn)插入(genetargeting)技術(shù)，通過在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生的外源基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組(homologouscombination)，使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上，從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。

基因定點(diǎn)插入的分子基礎(chǔ)是在外源定點(diǎn)插入基因與內(nèi)源核基因組目標(biāo)基因之間，必須存在一段適當(dāng)長(zhǎng)度的同源的DNA序列。7．哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因定點(diǎn)插入(1)基因定點(diǎn)插入的分子基礎(chǔ)43基因定點(diǎn)插入的基本過程包括如下幾個(gè)步驟：①首先是將外源基因，以及兩側(cè)與內(nèi)源目標(biāo)基因同源的DNA片段，克隆在具有選擇性標(biāo)記基因(例如neo)的載體分子上，構(gòu)成專用的基因定點(diǎn)插入載體(genetargetingvector)；②選用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割載體，使之線性化；然后轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。由于用于定點(diǎn)插入的外源基因的兩側(cè)，與內(nèi)源核基因組上的目標(biāo)基因或座位之間存在著同源的DNA序列，因此當(dāng)線性化的載體DNA被導(dǎo)入受體細(xì)胞之后，兩者便會(huì)彼此配對(duì)?；蚨c(diǎn)插入的基本過程包括如下幾個(gè)步驟：①首先是將外源基因44③在重組酶RecBCD的作用下，兩條同源DNA的相同部位便會(huì)發(fā)生同源重組，實(shí)現(xiàn)外源基因在核基因組DNA上的定點(diǎn)整合。

現(xiàn)已知道有多方面的因素，諸如受體細(xì)胞的生理狀態(tài)以及外源DNA的轉(zhuǎn)染方式等，都會(huì)影響到基因定點(diǎn)插入的效率。鑒于哺乳動(dòng)物基因定點(diǎn)整合效率低下的緣故，因此掌握并利用這些影響因素，對(duì)于提高基因定點(diǎn)插入效率無疑是十分有益的。③在重組酶RecBCD的作用下，兩條同源DNA的相同部位45基因定向插入的效率取決于DNA同源重組的頻率，它是與兩條重組DNA分子之間的同源序列的長(zhǎng)度密切相關(guān)的。

應(yīng)用正負(fù)選擇法，已經(jīng)測(cè)定出基因定向插入所需的DNA同源性的有效長(zhǎng)度。長(zhǎng)度為25bp的同源序列即可發(fā)生同源重組。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，當(dāng)DNA同源性的有效長(zhǎng)度介于259—1800bp之間時(shí)，同源序列越長(zhǎng)，基因定向插入的效率也就越高，兩者成正比；DNA同源性有效長(zhǎng)度在2kb以上時(shí)，基因定向插入的效率進(jìn)一步提高，同源程度為14kb時(shí)，達(dá)到最高值；實(shí)驗(yàn)還觀察到，當(dāng)DNA同源序列長(zhǎng)度不到200bp時(shí)，基因定向插入的效率則會(huì)明顯地下降?；蚨ㄏ虿迦氲男嗜Q于DNA同源重組的頻率，它是與兩條46(2)基因定向插入的類型與應(yīng)用

根據(jù)同源重組過程中外源定向插入基因在核基因組上整合的結(jié)果，可將基因定向插入?yún)^(qū)分為插入型和置換型兩種不同的形式。

(2)基因定向插入的類型與應(yīng)用根據(jù)同源重組過程中外源定47最新基因工程講稿52課件48基因定向插入技術(shù)自20世紀(jì)80年代誕生以來，經(jīng)過近20年的發(fā)展，迄今已成為基因功能研究的一種強(qiáng)有力的手段。它無論在理論探索還是在實(shí)際應(yīng)用上，都具有重要的價(jià)值和廣泛的發(fā)展前景。其主要的應(yīng)用有如下幾個(gè)方面：基因定向插入技術(shù)自20世紀(jì)80年代誕生以來，經(jīng)過近20年49第一，應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，能夠?qū)⒔?jīng)體外修飾改造的突變基因或某種新的外源基因，取代受體細(xì)胞核基因組上的目標(biāo)基因，使基因組獲得新的遺傳信息，以便使科學(xué)工作者能夠相當(dāng)有效地檢測(cè)基因的功能。第一，應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，能夠?qū)⒔?jīng)體外修飾改造的突變基50第二，應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，也可以在核基因組的目標(biāo)基因序列附近，插入一個(gè)具相同調(diào)控序列的同源基因拷貝。如此既可形成重復(fù)基因，提高表達(dá)效率和相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，又可能不會(huì)破壞目標(biāo)基因及其鄰近基因的功能。第二，應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，也可以在核基因組的目標(biāo)基因51第三，利用基因定向插入技術(shù)，還可以在核基因組內(nèi)部增加一段DNA序列，或造成序列缺失，甚至是單堿基定點(diǎn)突變等，從而達(dá)到抑制或糾正目標(biāo)基因的功能，為遺傳疾病的基因治療提供技術(shù)途徑。第三，利用基因定向插入技術(shù)，還可以在核基因組內(nèi)部增加一段D52(3)正負(fù)選擇法

轉(zhuǎn)染DNA與內(nèi)源基因組DNA之間的同源重組事件，是由轉(zhuǎn)染DNA的自由末端激發(fā)的。一般認(rèn)為，在酵母細(xì)胞中發(fā)生同源重組的頻率比較高，也容易檢測(cè)。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA發(fā)生隨機(jī)整合的機(jī)率相當(dāng)高，而同源重組的頻率則相當(dāng)?shù)汀Ｕ怯捎谶@種緣故，給哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因定向插入事件的檢測(cè)造成了很大的困難。(3)正負(fù)選擇法轉(zhuǎn)染DNA與內(nèi)源基因組DNA之間的同源重53為了克服這種困難，已經(jīng)發(fā)展出了一種用于富集同源重組事件的特殊的試驗(yàn)體系，它涉及到正選擇和負(fù)選擇兩個(gè)重要內(nèi)容，所以特稱為正負(fù)選擇（positive-negativeselection）法。為了克服這種困難，已經(jīng)發(fā)展出了一種用于富集同源重組事件的54基因定向插入載體上有兩個(gè)選擇標(biāo)記基因：neo基因叫做正選擇標(biāo)記基因，可抑制抗菌素G418的活性。因此，獲得的neo基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，呈G418抗性，能夠在含有G418抗菌素的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、存活。基因定向插入載體上有兩個(gè)選擇標(biāo)記基因：neo基因叫做55HSV-tk基因叫做負(fù)選擇標(biāo)記基因，它編碼的單純皰疹病毒胸苷激酶，可以把核苷類似物，例如9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV)，轉(zhuǎn)變成為毒性的核苷酸，造成細(xì)胞中毒死亡。因此，選擇培養(yǎng)基中的GCV能夠特異性地殺死表達(dá)HSV-tk基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。HSV-tk基因叫做負(fù)選擇標(biāo)記基因，它編碼的單純皰疹56最新基因工程講稿52課件57最新基因工程講稿52課件58(5)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn)

胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell)簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞，系指哺乳動(dòng)物囊胚期胚胎(即胚泡)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的一種未分化的細(xì)胞。它具有如同癌細(xì)胞那樣的無限繁殖和多潛能(Multipotential)的發(fā)育能力，并且可在體外培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期保持未分化的狀態(tài)。當(dāng)將經(jīng)過體外遺傳操作(例如導(dǎo)入了打靶基因)的ES細(xì)胞重新轉(zhuǎn)移到胚泡之內(nèi)，并移植在養(yǎng)母子宮中生長(zhǎng)，便可發(fā)育成嵌合動(dòng)物。

(5)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn)胚胎干細(xì)胞(emb59由于ES細(xì)胞具有諸多方面的優(yōu)越性，故特別適合于用作基因敲除實(shí)驗(yàn)(geneknock-outexperiment)。不過ES細(xì)胞株的建立，卻是一件十分困難的事情，迄今為止還只有為數(shù)不多的ES細(xì)胞株系可供有關(guān)研究工作使用。在這里我們選用小鼠ES細(xì)胞為例，闡述哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn)的基本過程：由于ES細(xì)胞具有諸多方面的優(yōu)越性，故特別適合于用作基60第一步：根據(jù)受體細(xì)胞核基因組中待敲除的目標(biāo)基因之核苷酸序列的結(jié)構(gòu)特征，在體外構(gòu)成一種具有失活基因或糾正基因的DNA片段。然后將此片段克隆在一種具有選擇標(biāo)記基因的置換型基因定向插入載體上。第一步：根據(jù)受體細(xì)胞核基因組中待敲除的目標(biāo)基因之核苷酸序列的61第二步：將此載體經(jīng)適當(dāng)限制酶消化作用而被線性化之后，轉(zhuǎn)染給培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞。由于定向插入DNA片段的兩側(cè)與目標(biāo)基因兩端之間存在同源的DNA序列，因此它可通過同源重組置換核基因組中的具功能活性的目標(biāo)基因，也就是說把目標(biāo)基因敲除掉。第二步：將此載體經(jīng)適當(dāng)限制酶消化作用而被線性化之后，轉(zhuǎn)染給培62第三步：應(yīng)用正負(fù)選擇法分離出已成功地敲除掉了目標(biāo)基因的ES細(xì)胞克隆，這樣的ES細(xì)胞系亦叫做突變的ES細(xì)胞。第四步：挑選生活力旺盛的突變的ES細(xì)胞，體外注射到超數(shù)排卵的供體小鼠的胚泡中。這個(gè)過程叫做胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)移(embryonicstemcelltransfer)。第三步：應(yīng)用正負(fù)選擇法分離出已成功地敲除掉了目標(biāo)基因的ES細(xì)63第五步：將此胚泡移植（Transplant）到受體母鼠，亦稱養(yǎng)母(fostermother)的子宮中。由此發(fā)育長(zhǎng)成的當(dāng)代轉(zhuǎn)基因小鼠，其個(gè)體中含有一定比例的來自ES細(xì)胞的細(xì)胞群體，稱為嵌合鼠。實(shí)驗(yàn)中所用的供體小鼠、受體小鼠和提供ES細(xì)胞的小鼠，三者均應(yīng)是屬于近交系(inbredline)。第五步：將此胚泡移植（Transplant）到受體母鼠，亦稱64最新基因工程講稿52課件65三、轉(zhuǎn)化載體（一）SV40病毒載體在動(dòng)物基因工程的研究領(lǐng)域中，關(guān)于病毒載體方面的工作，占據(jù)著相當(dāng)重要的地位。已有許多實(shí)驗(yàn)證明，一些具有DNA基因組或其生活史中出現(xiàn)有DNA階段的真核生物的病毒，經(jīng)改建后，都可以發(fā)展成為動(dòng)物基因工程的載體。這主要是由于動(dòng)物病毒具有如下的特點(diǎn)：三、轉(zhuǎn)化載體（一）SV40病毒載體在動(dòng)物基因工程的66①動(dòng)物病毒含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子不但可以啟動(dòng)動(dòng)物基因工程中常用的一些標(biāo)記基因的表達(dá)，而且還能夠啟動(dòng)克隆的外源基因的表達(dá)。②有許多種動(dòng)物病毒，在其感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達(dá)到相當(dāng)高的水平。因此，任何插入在動(dòng)物病毒基因組內(nèi)的外源基因，在病毒感染之后的很短時(shí)間內(nèi)，其劑量就會(huì)得到顯著的增加，并實(shí)現(xiàn)有效的表達(dá)。①動(dòng)物病毒含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子67③病毒具有控制自我復(fù)制的順式元件和反式作用因子。這些病毒經(jīng)過基因操作改造之后，可以發(fā)展成為能夠在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保持高拷貝外源基因的復(fù)制型質(zhì)粒載體。④有些動(dòng)物病毒，在它們的復(fù)制過程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。③病毒具有控制自我復(fù)制的順式元件和反式作用因子。這些病毒經(jīng)68⑤病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識(shí)別細(xì)胞接受器(acceptor)，因此外殼蛋白質(zhì)可作為感染劑(infectiousagents)能夠?qū)⑼庠椿蚋咝У貙?dǎo)入寄主細(xì)胞。用病毒外殼蛋白質(zhì)包裝重組質(zhì)粒DNA形成的假病毒顆粒(pseudovirions)，即構(gòu)成了一種高效的轉(zhuǎn)化體系。⑤病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識(shí)別細(xì)胞接受器(acceptor)，691．SV40病毒的基本生物學(xué)特性

猿猴空泡病毒40(Simianvacuolatingvirus40，SV40)載體的發(fā)展速度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其它動(dòng)物病毒載體。其主要原因在于：

*目前有關(guān)該病毒的分子生物學(xué)知識(shí)已有了相當(dāng)明顯的進(jìn)步。SV40病毒的基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，其大小僅有5243bp，很適于基因操作。

*它是頭一個(gè)完成基因組DNA全序列分析的動(dòng)物病毒，而且對(duì)其復(fù)制及轉(zhuǎn)錄方面的特性也有了相當(dāng)深刻的了解。1．SV40病毒的基本生物學(xué)特性猿猴空泡病毒40(70(1)SV40病毒的生命周期根據(jù)SV40感染作用的不同效應(yīng)，可將其寄主細(xì)胞分成三種不同的類型。①受體細(xì)胞：SV40感染細(xì)胞之后，產(chǎn)生感染性的病毒顆粒，并使寄主細(xì)胞裂解。如，猿猴細(xì)胞。②非受體細(xì)胞：感染細(xì)胞后，不會(huì)產(chǎn)生感染性顆粒，而是病毒基因組整合到寄主細(xì)胞的染色體上，于是細(xì)胞便被轉(zhuǎn)化，如，嚙齒動(dòng)物細(xì)胞。③半受體細(xì)胞：SV40接觸細(xì)胞后，只有1％一2％會(huì)產(chǎn)生出感染性的病毒，大多數(shù)整合到基因組上，從而使細(xì)胞轉(zhuǎn)化。如，人體細(xì)胞。(1)SV40病毒的生命周期根據(jù)SV40感染作用的71(2)SV40病毒的基礎(chǔ)分子生物學(xué)SV40病毒是一種小型的20面體的蛋白質(zhì)顆粒，由三種病毒外殼蛋白質(zhì)VPl、VP2和VP3構(gòu)成，中間包裝著一條環(huán)形的病毒基因組DNA。

同其它病毒不同，SV40DNA能同除了H1之外的所有寄主細(xì)胞組蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相結(jié)合。這些組蛋白使病毒DNA分子緊縮成真核染色質(zhì)所特有的念珠狀核小體，這種結(jié)構(gòu)特稱為微型染色體(mini—chromosome)。(2)SV40病毒的基礎(chǔ)分子生物學(xué)SV40病毒72感染之后的SV40基因組，輸送到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。如同大多數(shù)的病毒一樣，SV40病毒基因組表達(dá)的時(shí)間順序是相當(dāng)嚴(yán)格的。據(jù)此可將其區(qū)分為早期表達(dá)區(qū)和晚期表達(dá)區(qū)。

圍繞在SV40DNA復(fù)制起點(diǎn)周圍約400bp的DNA區(qū)段，是十分引人注意的。例如，現(xiàn)在已經(jīng)弄清緊挨這個(gè)起點(diǎn)的DNA序列，是調(diào)節(jié)早期和晚期初級(jí)轉(zhuǎn)錄本合成的控制信號(hào)。早期轉(zhuǎn)錄本的合成，就是由位于這個(gè)區(qū)段內(nèi)的一對(duì)72核苷酸序列串聯(lián)而成的強(qiáng)化因子序列激活的。感染之后的SV40基因組，輸送到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)73最新基因工程講稿52課件74SV40病毒基因組表達(dá)的一個(gè)重要特點(diǎn)是，它的RNA剪輯模式非常復(fù)雜。通過不同的剪輯途徑，早期初級(jí)轉(zhuǎn)錄本加工成2種不同的早期mRNA；而晚期的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本加工成3種不同的晚期mRNA。2種早期mRNA分別編碼大T抗原和小t抗原(即腫瘤蛋白質(zhì)或抗原)。晚期轉(zhuǎn)錄本按照其特定的沉降系數(shù)，可區(qū)分為16S、18S和19S三種mRNA，它們分別編碼VPl、VP3和VP2病毒蛋白質(zhì)。其中18S和19S兩種mRNA，具有一段相同的編碼序列。SV40病毒基因組表達(dá)的一個(gè)重要特點(diǎn)是，它的RNA剪75最新基因工程講稿52課件762．取代型重組病毒載體

野生型的SV40病毒顆粒的包裝范圍相當(dāng)嚴(yán)格，超過其基因組大小(5.2kb)的重組DNA就不能夠被包裝為成熟的病毒顆粒。而且，SV40還存在著寄主細(xì)胞的局限性，它只能在受體細(xì)胞中增殖，并最終導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡，這樣就不能作長(zhǎng)期的培養(yǎng)使用。因此，野生型的SV40病毒必須經(jīng)過改造之后，才能發(fā)展成為基因克隆的有用載體。2．取代型重組病毒載體野生型的SV40病毒顆粒的包裝77(1)晚期區(qū)段取代載體實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)觀察到，缺失了整個(gè)晚期區(qū)段功能的SV40病毒，同可互補(bǔ)這段功能的一種溫度敏感(ts)的輔助病毒混合感染時(shí)，仍然能夠增殖。因此，可以通過取代晚期區(qū)段的途徑構(gòu)建SV40病毒載體。最常用的輔助病毒是tsA突變體，它合成一種溫度敏感的T抗原。(1)晚期區(qū)段取代載體78按照同樣的道理，也可以構(gòu)建出早期區(qū)段取代載體(earlyregionreplacementvector)。例如，有人曾用一種流感病毒的血細(xì)胞凝集素(haemagglutinin)編碼區(qū)，取代T抗原編碼區(qū)，構(gòu)成一種早期區(qū)段取代載體。通過由一種輔助病毒提供T抗原，被這種取代載體感染的受體細(xì)胞，便會(huì)出現(xiàn)正常的裂解周期。(2)早期區(qū)段取代載體(i)早期區(qū)段取代載體按照同樣的道理，也可以構(gòu)建出早期區(qū)段取代載體(earlyr793．重組的病毒—質(zhì)粒載體(1)含有完整早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)的病毒-質(zhì)粒載體SV40和多瘤病毒(Polyomavirus)的基因組能夠在寄主細(xì)胞中快速地復(fù)制，并達(dá)到相當(dāng)高的拷貝數(shù)。利用這種能力，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一類特殊的病毒載體。這類病毒載體，實(shí)質(zhì)上是由病毒的早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)同大腸桿菌的質(zhì)粒分子重組而成的，所以又叫做病毒—質(zhì)粒載體(viral—plasmidvector)。3．重組的病毒—質(zhì)粒載體(1)含有完整早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)80它們既可在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制，也能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。*例如，病毒—質(zhì)粒載體pC10就是一種典型的穿梭載體，其中的早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)來自多瘤病毒，質(zhì)粒是大腸桿菌的pBR322，克隆的外源DNA是小鼠免疫球蛋白重鏈基因。多瘤病毒的結(jié)構(gòu)同SV40病毒十分接近，但它的受體細(xì)胞是小鼠細(xì)胞而非猿猴細(xì)胞。將純化的paCl0DNA導(dǎo)入小鼠細(xì)胞。經(jīng)過4～6天，每個(gè)細(xì)胞中累積的拷貝數(shù)高達(dá)50,000～400,000份，從而加強(qiáng)了外源基因的表達(dá)能力。它們既可在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制，也能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)81最新基因工程講稿52課件82※使用SV40病毒的早期區(qū)段，同樣也可以構(gòu)建出感染猿猴細(xì)胞的病毒—質(zhì)粒載體。這里必須指出的是，在這種病毒—質(zhì)粒載體中，質(zhì)粒DNA部分不應(yīng)含有所謂的“毒性序列”(poisonsequence)。已經(jīng)鑒定出在pBR322質(zhì)粒中的一段430bp序列。由于某種未知因素的影響，這段序列的存在，會(huì)使哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的任何DNA復(fù)制失效。像pAT153及其它一些pBR322質(zhì)粒派生載體都已失去了這段毒性序列。因此適合于用來構(gòu)建哺乳動(dòng)物的病毒—質(zhì)粒載體?！褂肧V40病毒的早期區(qū)段，同樣也可以構(gòu)建出感染猿猴細(xì)胞的83實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有SV40-DNA復(fù)制起點(diǎn)的任何大小的環(huán)形DNA，都能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制。根據(jù)這種原理，許多實(shí)驗(yàn)室都把只含有SV40復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段，即所謂的微型病毒復(fù)制子(mini-viralreplicon)，插入在大腸桿菌的質(zhì)粒載體上，構(gòu)成了一種新型的病毒—質(zhì)粒載體，稱為微型病毒復(fù)制子—質(zhì)粒載體。(2)微型病毒復(fù)制子-質(zhì)粒載體

pTBC-1就是一種典型的SV40微型病毒復(fù)制子-質(zhì)粒載體，如果將這種載體導(dǎo)入COS或HFS細(xì)胞，它們就能利用細(xì)胞提供的T抗原復(fù)制出非常大量的拷貝數(shù)?？梢杂脕砀咚降乇磉_(dá)外源蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有SV40-DNA復(fù)制起點(diǎn)的任何大小的環(huán)84（二）反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)是一類含單鏈RNA的動(dòng)物病毒。它的基因組含有2條相同的正鏈RNA分子，包裝成二倍體病毒顆粒。除此之外，在其病毒顆粒內(nèi)部還包含有tRNA引物分子、反轉(zhuǎn)錄酶、RNaseH和整合酶等組分。（二）反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviru85迄今已經(jīng)在鳥類及哺乳類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了許多種反轉(zhuǎn)錄病毒。例如鳥類的脾壞死病毒(SNV)、鼠類的乳腺腫瘤病毒(MMTV)，莫洛尼氏小鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，MoMLV)等等。其中研究得最為詳盡的則要數(shù)勞斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus，RSV)。RSV病毒感染了雞之后，就會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生腫瘤。從感染細(xì)胞中分離出來的反轉(zhuǎn)錄病毒的DNA，是一種有用的動(dòng)物細(xì)胞的基因載體。迄今已經(jīng)在鳥類及哺乳類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了許多種反轉(zhuǎn)錄病毒。86反轉(zhuǎn)錄病毒家族可以分成三種不同的類群：

※泡沫病毒(foamyviruses)類群，例如人泡沫病毒(HFV)；※慢病毒(Lentiviruses)類群，例如人免疫缺損病毒(HIV)I型和Ⅱ型，以及綿羊髓鞘脫落病毒(Visnavirus)等；※致癌病毒(oncoviruses)類群。并非所有本類群的病毒都是致癌的。根據(jù)在電子顯微鏡下觀察的病毒顆粒的形態(tài)學(xué)特征的差異，致癌病毒類群又可區(qū)分成A、B、C、D四個(gè)類型。反轉(zhuǎn)錄病毒家族可以分成三種不同的類群：※泡沫病毒(foam87反轉(zhuǎn)錄病毒作為動(dòng)物基因克隆載體的優(yōu)點(diǎn)：第一，在大多數(shù)情況下，反轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因(oncogene，onc)都能夠在正常的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。第二，反轉(zhuǎn)錄病毒的寄主范圍相當(dāng)廣泛，包括無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。其中有的還能夠在人體細(xì)胞中生長(zhǎng)。當(dāng)兩種不同的反轉(zhuǎn)錄病毒在同一寄主細(xì)胞中生長(zhǎng)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)一種DNA被另一種外殼蛋白質(zhì)包裝成假型病毒的奇特現(xiàn)象。由于病毒的寄主范圍實(shí)質(zhì)上是由其蛋白質(zhì)外殼決定的，因此使用這種假型病毒便有可能將某些病毒基因組導(dǎo)入正常無法感染的細(xì)胞，從而進(jìn)一步擴(kuò)大寄主范圍。反轉(zhuǎn)錄病毒作為動(dòng)物基因克隆載體的優(yōu)點(diǎn)：第一，在大多數(shù)情況下，88第三，反轉(zhuǎn)錄病毒具有強(qiáng)啟動(dòng)子，克隆于此類載體上的外源基因有可能得到有效的表達(dá)。有些反轉(zhuǎn)錄病毒，例如鼠乳腺腫瘤病毒，其啟動(dòng)子的活性功能的開啟或關(guān)閉可以通過實(shí)驗(yàn)手段予以控制。第四，反轉(zhuǎn)錄病毒不但感染效率高，而且通常還不會(huì)招致寄主細(xì)胞的死亡，被它感染的或轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞能夠持續(xù)許多世代，保持正常生長(zhǎng)和形成感染性病毒顆粒的能力。因此，有可能利用反轉(zhuǎn)錄病毒作載體，改變動(dòng)物細(xì)胞的基因型，并可遺傳到子代細(xì)胞。第三，反轉(zhuǎn)錄病毒具有強(qiáng)啟動(dòng)子，克隆于此類載體上的外源基因有可89(三）其它的病毒載體痘苗病毒(Vacciniavirus)具有雙鏈DNA基因組，同天花的病原體天花病毒(Variolavirus)的親緣關(guān)系十分密切。當(dāng)人們接種了痘苗病毒之后，便可獲得對(duì)天花的高度免疫性。在DNA重組技術(shù)發(fā)展之后不久，就有人將外源DNA片段插入到痘苗病毒的基因組中，得到了具有生物活性的重組病毒。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，基因工程學(xué)家便設(shè)想構(gòu)建能夠表達(dá)多種病原體抗原的重組痘苗病毒，作為預(yù)防這些病原體感染的活疫苗。1、痘苗病毒載體(三）其它的病毒載體痘苗病毒(Vacciniavi90乳頭瘤病毒(Papillomaviruses)能夠感染包括人類在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物，產(chǎn)生上皮腫瘤，例如肉疣和乳頭瘤。已有研究表明，人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)能夠誘發(fā)人宮頸癌(humancervicalcarcinoma)。可見，此類病毒與人類的關(guān)系十分密切。但是只有完全分化的扁平的上皮細(xì)胞(epithelialcell)，才能產(chǎn)生感染性的乳頭瘤病毒，迄今為止還沒有辦法在培養(yǎng)的細(xì)胞中增殖這種病毒。2．乳頭瘤病毒載體乳頭瘤病毒(Papillomaviruses)能91目前對(duì)于乳頭瘤病毒的分子生物學(xué)研究，遠(yuǎn)遠(yuǎn)地落后于其它病毒。然而有幾種乳頭瘤病毒的DNA能夠轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的細(xì)胞，而且在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)，病毒的基因組保持游離的多拷貝的狀態(tài)，每個(gè)分離后的細(xì)胞可達(dá)50一200份。利用乳頭瘤病毒基因組這種非整合的特性，克隆在它上面的外源基因的復(fù)制與表達(dá)，則可免受染色體的控制，而得到大量的擴(kuò)增，同時(shí)又不會(huì)導(dǎo)致寄主細(xì)胞的裂解死亡。從這點(diǎn)考慮，乳頭瘤病毒載體比上面所討論的整合性載體具有突出的優(yōu)點(diǎn)，因而在近年很受人們的關(guān)注。目前對(duì)于乳頭瘤病毒的分子生物學(xué)研究，遠(yuǎn)遠(yuǎn)地落后于其它病毒。然92※腺病毒(Adenoviruses)是一群無囊膜的20面體的病毒，所含的雙鏈DNA的分子大小約為36kb。3．腺病毒載體※腺病毒具有很大的發(fā)展為真核基因的表達(dá)體系潛力。這首先是因?yàn)樗幕蚪MDNA分子量大，可插入較大的外源DNA片段，而且還可以在寄主細(xì)胞中大量地增殖。其次，在腺病毒感染周期中，寄主蛋白質(zhì)合成被關(guān)閉掉了，因此能最大限度地合成病毒編碼的蛋白質(zhì)，這種特性為克隆基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的檢測(cè)與純化提供了很大的方便?！俨《?Adenoviruses)是一群無囊膜的20面體93※構(gòu)建腺病毒載體的重要步驟是，設(shè)法減少其基因組DNA中某些核酸內(nèi)切限制酶的切割位點(diǎn)的數(shù)目。腺病毒載體的構(gòu)建※在腺病毒載體的構(gòu)建過程中，失去某種限制位點(diǎn)的腺病毒DNA是在體外選擇的。例如，失去XbaI限制位點(diǎn)的Ad5DNA的變異體，是先用XbaI切割腺病毒DNA，然后把消化片段重新連接起來之后獲得的。根據(jù)此類再生片段的感染性，便可篩選出由這些片段重新連接形成的完整的基因組。于是就構(gòu)建出減少了某種核酸內(nèi)切限制酶切割位點(diǎn)的腺病毒載體?！鶚?gòu)建腺病毒載體的重要步驟是，設(shè)法減少其基因組DNA中某些94

※由于在腺病毒的兩段反向末端重復(fù)序列中，只要有一段是完整的，另一段的缺失也就能夠得到恢復(fù)。因此，可以利用靠近5’-末端的El早期基因區(qū)克隆外源基因。例如已經(jīng)證明，Ad2左邊末端片段在體外克隆和突變之后，再連接到缺失了左邊末端片段的Ad5基因組DNA上，這樣的重組體分子感染了人細(xì)胞之后，會(huì)正確地再生出左邊末端片段，從而恢復(fù)了腺病毒DNA的末端重復(fù)結(jié)構(gòu)，而且子代病毒DNA也是具有感染性的?！捎谠谙俨《镜膬啥畏聪蚰┒酥貜?fù)序列中，只要有一段是完整95※應(yīng)用上述辦法，已在El早期基因區(qū)引入了若干突變，但假若不提供輔助功能，如此形成的重組的腺病毒是不能夠在人HeLa細(xì)胞中生長(zhǎng)的。同樣的道理，如果通過這種辦法將外源基因插入在El早期基因區(qū)，也就必須提供輔助功能才能完成感染周期?，F(xiàn)在通常是用能表達(dá)El功能的人細(xì)胞系(293細(xì)胞)提供這種輔助功能的?！鶓?yīng)用上述辦法，已在El早期基因區(qū)引入了若干突變，但假若不96因?yàn)橄俨《静⒉荒軌蚋腥驹澈锛?xì)胞，而含有SV40病毒T-抗原的重組分子卻可以在這種細(xì)胞中表達(dá)。※因此，構(gòu)建腺病毒-SV40重組載體可以擴(kuò)大腺病毒的感染范圍，能夠在其它非受體細(xì)胞(如猿猴細(xì)胞)中有效地生長(zhǎng)。在體外已經(jīng)構(gòu)建成的這類腺病毒-SV40重組載體中，T-抗原基因的表達(dá)是在腺病毒主要的晚期啟動(dòng)子控制下進(jìn)行的。這種類型的腺病毒載體有可能得到進(jìn)一步的發(fā)展。因?yàn)橄俨《静⒉荒軌蚋腥驹澈锛?xì)胞，而含有SV40病毒T-抗原的97

結(jié)束語謝謝大家聆聽?。。?8

結(jié)束語謝謝大家聆聽?。?！98基因工程講稿52基因工程講稿5299哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)常用的顯性選擇標(biāo)記哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)常用的顯性選擇標(biāo)記100最新基因工程講稿52課件101最新基因工程講稿52課件102最新基因工程講稿52課件103最新基因工程講稿52課件104最新基因工程講稿52課件105最新基因工程講稿52課件106(2)HAT選擇法由于選擇TK+細(xì)胞的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)，所以叫做HAT選擇法。(2)HAT選擇法由于選擇TK+細(xì)胞的培養(yǎng)基含有107基本原理：如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(APT)處理細(xì)胞，二氫葉酸還原酶便被抑制，培養(yǎng)基中的還原輔助因子四氫葉酸因得不到補(bǔ)充而逐漸耗盡，于是從dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻斷。但次黃嘌呤是dATP和dGTP補(bǔ)救合成途徑的一種底物，培養(yǎng)基中補(bǔ)加有此種物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，繼續(xù)合成出這些脫氧嘌呤三磷酸(dATP和dGTP)。基本原理：如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(APT)處理細(xì)胞，二氫108

由于在HAT培養(yǎng)基中補(bǔ)加有外源的胸苷，所以TK+細(xì)胞通過胸苷激酶的作用可把它合成為dTTP，繼續(xù)存活下去；而TK-細(xì)胞則不會(huì)發(fā)生這種合成，因而死亡。把正常的tk基因?qū)隩K-細(xì)胞，它們也就照樣能夠存活下去。所以使用HAT培養(yǎng)基，能夠選擇出由tk基因轉(zhuǎn)化而來的TK+細(xì)胞。由于在HAT培養(yǎng)基中補(bǔ)加有外源的胸苷，所以TK+細(xì)胞109(3)共轉(zhuǎn)化選擇

1)共轉(zhuǎn)化選擇的基本過程

HAT選擇法可以用來分離以tk基因作選擇標(biāo)記的外源DNA轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。(3)共轉(zhuǎn)化選擇HAT選擇法可以用來分離以tk基110在磷酸鈣沉淀中，兩種DNA分子的混合物，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。根據(jù)這種共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，結(jié)合磷酸鈣共沉淀技術(shù)，人們可以將無選擇標(biāo)記的DNA同具tk選擇標(biāo)記基因的DNA進(jìn)行混合轉(zhuǎn)化，發(fā)展出了共轉(zhuǎn)化選擇體系，從而解決了不具tk選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子的選擇問題。在磷酸鈣沉淀中，兩種DNA分子的混合物，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化111最新基因工程講稿52課件1123．二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng)(1)基本原理

二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)在真核細(xì)胞的核苷酸生物合成中起著重要的作用，它催化二氫葉酸(DHF)還原成四氫葉酸(THF)。這個(gè)反應(yīng)過程受到葉酸的類似物氨基蝶呤(aminopterin，APT)和氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。3．二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng)(1)基本原理113如果細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有這些抑制物，例如氨甲蝶呤，其濃度只要達(dá)0.1μg／ml，就會(huì)阻斷核苷酸生物合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如果細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有這些抑制物，例如氨甲蝶呤，其濃114（2）常用的基因:

1)小鼠3T6成纖維細(xì)胞的突變系3T6—400來源的突變dhfr基因。由它合成的突變二氫葉酸還原酶與正常酶相比，同MTX的結(jié)合能力下降了270倍。因此，用突變細(xì)胞呈抗性反應(yīng)的MTX濃度，就可以把野生型細(xì)胞殺死，達(dá)到了顯性選擇的目的。如果把突變基因dhfrMTX導(dǎo)入正常的細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子也就獲得了抗性。

（2）常用的基因:1)小鼠3T6成纖維細(xì)胞的突變系3T1152)另一個(gè)dhfr顯性選擇標(biāo)記是位于細(xì)菌抗藥性因子R388上的dhfr基因。它編碼的二氫葉酸還原酶，實(shí)際上就可以抗MTX的抑制作用。

2)另一個(gè)dhfr顯性選擇標(biāo)記是位于細(xì)菌抗藥性因子R3881164．氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)是由大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子上的cat基因編碼的，它能夠催化乙?；鶊F(tuán)從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上，導(dǎo)致一個(gè)或兩個(gè)羥基發(fā)生乙?；饔?，從而使其失去活性。這個(gè)基因可以作為檢測(cè)外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的一種十分敏感的標(biāo)記基因，尤其是適用于瞬時(shí)表達(dá)的研究。4．氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(1175．氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因也經(jīng)常用Eco-neo表示，它是氨基糖苷類抗菌素的抗性基因，所編碼的APH酶可以使此類抗菌素，如G418失去活性。氨基糖苷抗菌素G418，即3’-脫氧鏈霉胺(3’-deoxystreptamine)，在結(jié)構(gòu)上同卡那霉素、新霉素及慶大霉素十分相似。它通過抑制70S核糖體的功能而阻斷真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成，造成細(xì)胞死亡。因此，為我們提供了一種不需要特殊突變細(xì)胞的顯性選擇系統(tǒng)。5．氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移118二、外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法1．磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)(1)磷酸鈣轉(zhuǎn)染的基本步驟

通過磷酸鈣DNA共沉淀，將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的技術(shù)程序，最初是由Graham等人于1973年創(chuàng)立的。應(yīng)用這種方法，能夠?qū)⑷魏蔚耐庠碊NA有效地導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，目前仍被許多實(shí)驗(yàn)室廣泛地使用。磷酸鈣轉(zhuǎn)染法的基本操作過程包括：二、外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法1．磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)(1)119①將待轉(zhuǎn)染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2—DNA溶液；②在不斷攪拌過程中，逐滴緩慢地加入到Hepes—磷酸鈣溶液中去，形成一種磷酸鈣-DNA共沉淀；③然后用吸管仔細(xì)轉(zhuǎn)移共沉淀物，使之粘附到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物單層細(xì)胞表面，就會(huì)迅速地被細(xì)胞所捕獲。①將待轉(zhuǎn)染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2—D120保溫幾小時(shí)后，將細(xì)胞洗凈，并更換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至最終實(shí)現(xiàn)外源DNA的高水平表達(dá)。依培養(yǎng)細(xì)胞的不同類型而異，平均每個(gè)培養(yǎng)皿中約有10％的細(xì)胞捕獲了外源轉(zhuǎn)染DNA。據(jù)報(bào)道，添加甘油或DMSO(二甲基亞砜)會(huì)增加某些類型細(xì)胞吸收外源DNA的數(shù)量。保溫幾小時(shí)后，將細(xì)胞洗凈，并更換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培121(2)影響磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率的因素*DNA—磷酸鈣共沉淀物中DNA的數(shù)量；*共沉淀物與細(xì)胞接觸的保溫時(shí)間；*甘油或DMSO等促進(jìn)因子作用的持續(xù)時(shí)間等。(2)影響磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率的因素*DNA—磷酸鈣共沉淀物中D1222．DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)

二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)，簡(jiǎn)稱DEAE-葡聚糖，是一種高分子量的多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源的DNA，實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)的有效表達(dá)。這種轉(zhuǎn)染技術(shù)最初是設(shè)計(jì)用來分析脊髓灰質(zhì)炎病毒(Polisvirus)RNA的感染性，其后經(jīng)過改良又被用著分析SV40及多瘤病毒DNA的感染性。2．DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)二乙氨乙基葡聚糖(die123(1)DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染的一般程序

處理方式：1）先使病毒的DNA與DEAE-葡聚糖混合，形成DNA／DEAE葡聚糖復(fù)合物；2）受體細(xì)胞先用DEAE-葡聚糖溶液作預(yù)處理，然后再用來與轉(zhuǎn)染的DNA接觸。注意：處理前要用等滲溶液漂洗，除去培養(yǎng)液中的血清成分。(1)DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染的一般程序處理方式：1）先使病124DEAE-葡聚糖的使用濃度為100-1000g／ml之間。一般在低濃度(200g／ml)和較長(zhǎng)的持續(xù)處理時(shí)間(8h或16h)的條件下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源DNA的效率比較高。若在DEAE-葡聚糖處理之后，再加入DMSO等促進(jìn)因子，還可以進(jìn)一步提高效率。最高感染率可達(dá)80％。DEAE-葡聚糖的使用濃度為100-1000g／m125(2)DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染的可能機(jī)理及影響因素分子機(jī)理不十分清楚，曾經(jīng)提出過幾種較為合理的解釋。一種認(rèn)為DEAE-葡聚糖同DNA結(jié)合成復(fù)合物，可以保護(hù)DNA免受核酸酶的降解作用；另一種則認(rèn)為DEAE-葡聚糖可以同細(xì)胞膜發(fā)生作用，從而使DNA能夠容易地穿過細(xì)胞表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。(2)DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染的可能機(jī)理及影響因素分子機(jī)126有許多因素都會(huì)影響DEAE-葡聚糖的轉(zhuǎn)染效率，其中以細(xì)胞的數(shù)量、DNA的濃度和DEAE-葡聚糖的濃度最為重要。

大體上說，按每個(gè)直徑10cm的培養(yǎng)皿中加入1-10μg的轉(zhuǎn)染DNA，并使用每毫升培養(yǎng)基含100～400μgDEAE-葡聚糖的溶液，對(duì)于絕大多數(shù)類型的細(xì)胞，都能得到很好的轉(zhuǎn)染效率。由于DEAE-葡聚糖對(duì)有些細(xì)胞具有毒性，因此用低濃度溶液作短時(shí)間的接觸反應(yīng)較為合適。有許多因素都會(huì)影響DEAE-葡聚糖的轉(zhuǎn)染效率，其中以127(3)DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn):方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、以及轉(zhuǎn)染效率高于磷酸鈣法等。不足：不能產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。原因可能是同DNA組裝成微型染色體有關(guān)。因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)報(bào)道，一旦質(zhì)粒DNA進(jìn)入經(jīng)過DEAE-葡聚糖處理的細(xì)胞，它就會(huì)迅速地組裝成含核小體的微型染色體。(3)DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn):方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性128磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)十分有效而且易于重復(fù)，但最適轉(zhuǎn)染條件的范圍比較窄，為此發(fā)展出技術(shù)條件并不十分苛刻的聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染技術(shù)。3．聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：用聚陽離子Polybrene(聚溴化季銨陽離子的商品名)處理，增加DNA對(duì)細(xì)胞表面的吸附能力；再用25％～30％的DMSO短暫處理細(xì)胞以增加膜的通透性，提高對(duì)DNA的捕獲數(shù)量。磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)十分有效而且易于重復(fù)，但最適轉(zhuǎn)染條件129按此法測(cè)定反轉(zhuǎn)錄病毒DNA的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果是同DNA的加入量成正比，而且不需要加運(yùn)載DNA(carrierDNA)就可得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染技術(shù)的通用性尚未驗(yàn)證，但已知可適用于雞胚細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。按此法測(cè)定反轉(zhuǎn)錄病毒DNA的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果是同DNA的加1304．基因顯微注射技術(shù)

應(yīng)用玻璃顯微注射器，可以把重組DNA直接注射到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。根據(jù)DNA注射的方式不同，可以把顯微注射區(qū)分為真正的顯微注射(truemicroinjection)法和“穿刺”(pricking)導(dǎo)入法兩種。顯微注射，DNA是由注射針直接注入細(xì)胞；而在穿刺中，DNA是處在細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中，它通過穿刺形成的小孔進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)部，或是隨穿刺的針頭一道進(jìn)入的。4．基因顯微注射技術(shù)應(yīng)用玻璃顯微注射器，可以把重組D131(1)顯微注射法用顯微注射法轉(zhuǎn)移基因的效率明顯地超出其它方法。如把tk-DNA注射到小鼠tk-細(xì)胞，結(jié)果有50％～100％的受注射細(xì)胞能瞬時(shí)表達(dá)胸苷激酶的活性。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，取決于注射的DNA的性質(zhì)。(1)顯微注射法用顯微注射法轉(zhuǎn)移基因的效率明顯地超132※如一個(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，一組用pBR322／HSV-1tk重組DNA注射，結(jié)果在500～1000個(gè)受注射細(xì)胞中，只有一個(gè)轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子；另一組用連接著特定的SV40序列的pBR322／HSV-1tk重組DNA注射，結(jié)果平均每5個(gè)受注射細(xì)胞中便有一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化頻率達(dá)20％?！缫粋€(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，一組用pBR322／HSV-1tk重組133穿刺法是使用顯微注射針穿刺細(xì)胞及細(xì)胞核，而把外源DNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞核的一種特殊的顯微注射法。(2)穿刺法操作過程：I、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入蛋白酶及EDTA溶液，于37℃下消化15分鐘；II、移去消化液，并用培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞之后，在每個(gè)直徑為6.0cm的培養(yǎng)皿中接種(1～5)x103細(xì)胞，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)過夜；穿刺法是使用顯微注射針穿刺細(xì)胞及細(xì)胞核，而把外源DN134III、在穿刺前棄去培養(yǎng)基，用pH7.2的磷酸緩沖液(PBS)漂洗2次，然后加入濃度為5～1000μg／ml的供體DNA，覆蓋于培養(yǎng)細(xì)胞表面；IV、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿刺處理；V、穿刺后，馬上移去PBS—DNA溶液，換上正常培養(yǎng)基，隨后再換上選擇培養(yǎng)基。III、在穿刺前棄去培養(yǎng)基，用pH7.2的磷酸緩沖液(PB1355．電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)操作程序：

將盛有細(xì)胞和DNA混合液的特制小容器置于電脈沖儀的正負(fù)電極之間，在0℃下加高壓(2.0～4.0kV)電脈沖10秒鐘后，將處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天，再行篩選。5．電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)操作程序：將盛有細(xì)胞和DN136

※經(jīng)過這樣處理所得到的存活細(xì)胞的回收率約有60％～80％。※如果在電穿孔之前，先用秋水仙酰胺(colcemid)預(yù)處理細(xì)胞10小時(shí)，可提高轉(zhuǎn)化效率3～10倍。這很可能是由于在這類中期停頓(metaphasearrest)的細(xì)胞中，細(xì)胞核處于無膜狀態(tài)，或是此時(shí)核膜具有較高通透性的緣故。※經(jīng)過這樣處理所得到的存活細(xì)胞的回收率約有60％～80％137

應(yīng)用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)移基因到哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞，平均每l05個(gè)活細(xì)胞中，可獲得25～30個(gè)轉(zhuǎn)化子?，F(xiàn)在這種方法已成功地應(yīng)用于許多細(xì)胞系，包括小鼠淋巴細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、大鼠垂體細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。應(yīng)用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)移基因到哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞，平均每l1386．脂質(zhì)體載體法以脂質(zhì)體為媒介的外源DNA導(dǎo)入受體的方法，叫做脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。第一種常用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法是，將外源DNA與陽離子型的脂質(zhì)體混合形成DNA-脂質(zhì)復(fù)合物(DNA-lipidcomplex)。這種復(fù)合物可有效地被受體細(xì)胞捕獲，實(shí)現(xiàn)基因的高頻率轉(zhuǎn)移，故這種方法又叫做DNA-脂質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)染法。

*在這個(gè)過程中，DNA并不是被包裝在脂質(zhì)體的內(nèi)部，而是通過兩者之間的靜電引力作用結(jié)合在一起的。6．脂質(zhì)體載體法以脂質(zhì)體為媒介的外源DNA導(dǎo)入受體的方139第二種常用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法叫做脂質(zhì)體載體法。它是將外源DNA包裝在脂質(zhì)體的內(nèi)部，然后通過脂質(zhì)體的雙層膜同受體細(xì)胞膜之間的融合作用，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，爾后再進(jìn)入細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)。第二種常用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法叫做脂質(zhì)體載體法。它是將外源D1407．哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因定點(diǎn)插入(1)基因定點(diǎn)插入的分子基礎(chǔ)20世紀(jì)80年代后期發(fā)展的基因定點(diǎn)插入(genetargeting)技術(shù)，通過在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生的外源基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組(homologouscombination)，使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上，從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。

基因定點(diǎn)插入的分子基礎(chǔ)是在外源定點(diǎn)插入基因與內(nèi)源核基因組目標(biāo)基因之間，必須存在一段適當(dāng)長(zhǎng)度的同源的DNA序列。7．哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因定點(diǎn)插入(1)基因定點(diǎn)插入的分子基礎(chǔ)141基因定點(diǎn)插入的基本過程包括如下幾個(gè)步驟：①首先是將外源基因，以及兩側(cè)與內(nèi)源目標(biāo)基因同源的DNA片段，克隆在具有選擇性標(biāo)記基因(例如neo)的載體分子上，構(gòu)成專用的基因定點(diǎn)插入載體(genetargetingvector)；②選用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割載體，使之線性化；然后轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。由于用于定點(diǎn)插入的外源基因的兩側(cè)，與內(nèi)源核基因組上的目標(biāo)基因或座位之間存在著同源的DNA序列，因此當(dāng)線性化的載體DNA被導(dǎo)入受體細(xì)胞之后，兩者便會(huì)彼此配對(duì)?；蚨c(diǎn)插入的基本過程包括如下幾個(gè)步驟：①首先是將外源基因142③在重組酶RecBCD的作用下，兩條同源DNA的相同部位便會(huì)發(fā)生同源重組，實(shí)現(xiàn)外源基因在核基因組DNA上的定點(diǎn)整合。

現(xiàn)已知道有多方面的因素，諸如受體細(xì)胞的生理狀態(tài)以及外源DNA的轉(zhuǎn)染方式等，都會(huì)影響到基因定點(diǎn)插入的效率。鑒于哺乳動(dòng)物基因定點(diǎn)整合效率低下的緣故，因此掌握并利用這些影響因素，對(duì)于提高基因定點(diǎn)插入效率無疑是十分有益的。③在重組酶RecBCD的作用下，兩條同源DNA的相同部位143基因定向插入的效率取決于DNA同源重組的頻率，它是與兩條重組DNA分子之間的同源序列的長(zhǎng)度密切相關(guān)的。

應(yīng)用正負(fù)選擇法，已經(jīng)測(cè)定出基因定向插入所需的DNA同源性的有效長(zhǎng)度。長(zhǎng)度為25bp的同源序列即可發(fā)生同源重組。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，當(dāng)DNA同源性的有效長(zhǎng)度介于259—1800bp之間時(shí)，同源序列越長(zhǎng)，基因定向插入的效率也就越高，兩者成正比；DNA同源性有效長(zhǎng)度在2kb以上時(shí)，基因定向插入的效率進(jìn)一步提高，同源程度為14kb時(shí)，達(dá)到最高值；實(shí)驗(yàn)還觀察到，當(dāng)DNA同源序列長(zhǎng)度不到200bp時(shí)，基因定向插入的效率則會(huì)明顯地下降?；蚨ㄏ虿迦氲男嗜Q于DNA同源重組的頻率，它是與兩條144(2)基因定向插入的類型與應(yīng)用

根據(jù)同源重組過程中外源定向插入基因在核基因組上整合的結(jié)果，可將基因定向插入?yún)^(qū)分為插入型和置換型兩種不同的形式。

(2)基因定向插入的類型與應(yīng)用根據(jù)同源重組過程中外源定145最新基因工程講稿52課件146基因定向插入技術(shù)自20世紀(jì)80年代誕生以來，經(jīng)過近20年的發(fā)展，迄今已成為基因功能研究的一種強(qiáng)有力的手段。它無論在理論探索還是在實(shí)際應(yīng)用上，都具有重要的價(jià)值和廣泛的發(fā)展前景。其主要的應(yīng)用有如下幾個(gè)方面：基因定向插入技術(shù)自20世紀(jì)80年代誕生以來，經(jīng)過近20年147第一，應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，能夠?qū)⒔?jīng)體外修飾改造的突變基因或某種新的外源基因，取代受體細(xì)胞核基因組上的目標(biāo)基因，使基因組獲得新的遺傳信息，以便使科學(xué)工作者能夠相當(dāng)有效地檢測(cè)基因的功能。第一，應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，能夠?qū)⒔?jīng)體外修飾改造的突變基148第二，應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，也可以在核基因組的目標(biāo)基因序列附近，插入一個(gè)具相同調(diào)控序列的同源基因拷貝。如此既可形成重復(fù)基因，提高表達(dá)效率和相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，又可能不會(huì)破壞目標(biāo)基因及其鄰近基因的功能。第二，應(yīng)用基因定向插入技術(shù)，也可以在核基因組的目標(biāo)基因149第三，利用基因定向插入技術(shù)，還可以在核基因組內(nèi)部增加一段DNA序列，或造成序列缺失，甚至是單堿基定點(diǎn)突變等，從而達(dá)到抑制或糾正目標(biāo)基因的功能，為遺傳疾病的基因治療提供技術(shù)途徑。第三，利用基因定向插入技術(shù)，還可以在核基因組內(nèi)部增加一段D150(3)正負(fù)選擇法

轉(zhuǎn)染DNA與內(nèi)源基因組DNA之間的同源重組事件，是由轉(zhuǎn)染DNA的自由末端激發(fā)的。一般認(rèn)為，在酵母細(xì)胞中發(fā)生同源重組的頻率比較高，也容易檢測(cè)。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA發(fā)生隨機(jī)整合的機(jī)率相當(dāng)高，而同源重組的頻率則相當(dāng)?shù)?。正是由于這種緣故，給哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因定向插入事件的檢測(cè)造成了很大的困難。(3)正負(fù)選擇法轉(zhuǎn)染DNA與內(nèi)源基因組DNA之間的同源重151為了克服這種困難，已經(jīng)發(fā)展出了一種用于富集同源重組事件的特殊的試驗(yàn)體系，它涉及到正選擇和負(fù)選擇兩個(gè)重要內(nèi)容，所以特稱為正負(fù)選擇（positive-negativeselection）法。為了克服這種困難，已經(jīng)發(fā)展出了一種用于富集同源重組事件的152基因定向插入載體上有兩個(gè)選擇標(biāo)記基因：neo基因叫做正選擇標(biāo)記基因，可抑制抗菌素G418的活性。因此，獲得的neo基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，呈G418抗性，能夠在含有G418抗菌素的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、存活?；蚨ㄏ虿迦胼d體上有兩個(gè)選擇標(biāo)記基因：neo基因叫做153HSV-tk基因叫做負(fù)選擇標(biāo)記基因，它編碼的單純皰疹病毒胸苷激酶，可以把核苷類似物，例如9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV)，轉(zhuǎn)變成為毒性的核苷酸，造成細(xì)胞中毒死亡。因此，選擇培養(yǎng)基中的GCV能夠特異性地殺死表達(dá)HSV-tk基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。HSV-tk基因叫做負(fù)選擇標(biāo)記基因，它編碼的單純皰疹154最新基因工程講稿52課件155最新基因工程講稿52課件156(5)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn)

胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell)簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞，系指哺乳動(dòng)物囊胚期胚胎(即胚泡)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的一種未分化的細(xì)胞。它具有如同癌細(xì)胞那樣的無限繁殖和多潛能(Multipotential)的發(fā)育能力，并且可在體外培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期保持未分化的狀態(tài)。當(dāng)將經(jīng)過體外遺傳操作(例如導(dǎo)入了打靶基因)的ES細(xì)胞重新轉(zhuǎn)移到胚泡之內(nèi)，并移植在養(yǎng)母子宮中生長(zhǎng)，便可發(fā)育成嵌合動(dòng)物。

(5)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn)胚胎干細(xì)胞(emb157由于ES細(xì)胞具有諸多方面的優(yōu)越性，故特別適合于用作基因敲除實(shí)驗(yàn)(geneknock-outexperiment)。不過ES細(xì)胞株的建立，卻是一件十分困難的事情，迄今為止還只有為數(shù)不多的ES細(xì)胞株系可供有關(guān)研究工作使用。在這里我們選用小鼠ES細(xì)胞為例，闡述哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn)的基本過程：由于ES細(xì)胞具有諸多方面的優(yōu)越性，故特別適合于用作基158第一步：根據(jù)受體細(xì)胞核基因組中待敲除的目標(biāo)基因之核苷酸序列的結(jié)構(gòu)特征，在體外構(gòu)成一種具有失活基因或糾正基因的DNA片段。然后將此片段克隆在一種具有選擇標(biāo)記基因的置換型基因定向插入載體上。第一步：根據(jù)受體細(xì)胞核基因組中待敲除的目標(biāo)基因之核苷酸序列的159第二步：將此載體經(jīng)適當(dāng)限制酶消化作用而被線性化之后，轉(zhuǎn)染給培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞。由于定向插入DNA片段的兩側(cè)與目標(biāo)基因兩端之間存在同源的DNA序列，因此它可通過同源重組置換核基因組中的具功能活性的目標(biāo)基因，也就是說把目標(biāo)基因敲除掉。第二步：將此載體經(jīng)適當(dāng)限制酶消化作用而被線性化之后，轉(zhuǎn)染給培160第三步：應(yīng)用正負(fù)選擇法分離出已成功地敲除掉了目標(biāo)基因的ES細(xì)胞克隆，這樣的ES細(xì)胞系亦叫做突變的ES細(xì)胞。第四步：挑選生活力旺盛的突變的ES細(xì)胞，體外注射到超數(shù)排卵的供體小鼠的胚泡中。這個(gè)過程叫做胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)移(embryonicstemcelltransfer)。第三步：應(yīng)用正負(fù)選擇法分離出已成功地敲除掉了目標(biāo)基因的ES細(xì)161第五步：將此胚泡移植（Transplant）到受體母鼠，亦稱養(yǎng)母(fostermother)的子宮中。由此發(fā)育長(zhǎng)成的當(dāng)代轉(zhuǎn)基因小鼠，其個(gè)體中含有一定比例的來自ES細(xì)胞的細(xì)胞群體，稱為嵌合鼠。實(shí)驗(yàn)中所用的供體小鼠、受體小鼠和提供ES細(xì)胞的小鼠，三者均應(yīng)是屬于近交系(inbredline)。第五步：將此胚泡移植（Transplant）到受體母鼠，亦稱162最新基因工程講稿52課件163三、轉(zhuǎn)化載體（一）SV40病毒載體在動(dòng)物基因工程的研究領(lǐng)域中，關(guān)于病毒載體方面的工作，占據(jù)著相當(dāng)重要的地位。已有許多實(shí)驗(yàn)證明，一些具有DNA基因組或其生活史中出現(xiàn)有DNA階段的真核生物的病毒，經(jīng)改建后，都可以發(fā)展成為動(dòng)物基因工程的載體。這主要是由于動(dòng)物病毒具有如下的特點(diǎn)：三、轉(zhuǎn)化載體（一）SV40病毒載體在動(dòng)物基因工程的164①動(dòng)物病毒含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子不但可以啟動(dòng)動(dòng)物基因工程中常用的一些標(biāo)記基因的表達(dá)，而且還能夠啟動(dòng)克隆的外源基因的表達(dá)。②有許多種動(dòng)物病毒，在其感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達(dá)到相當(dāng)高的水平。因此，任何插入在動(dòng)物病毒基因組內(nèi)的外源基因，在病毒感染之后的很短時(shí)間內(nèi)，其劑量就會(huì)得到顯著的增加，并實(shí)現(xiàn)有效的表達(dá)。①動(dòng)物病毒含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子165③病毒具有控制自我復(fù)制的順式元件和反式作用因子。這些病毒經(jīng)過基因操作改造之后，可以發(fā)展成為能夠在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保持高拷貝外源基因的復(fù)制型質(zhì)粒載體。④有些動(dòng)物病毒，在它們的復(fù)制過程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。③病毒具有控制自我復(fù)制的順式元件和反式作用因子。這些病毒經(jīng)166⑤病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識(shí)別細(xì)胞接受器(acceptor)，因此外殼蛋白質(zhì)可作為感染劑(infectiousagents)能夠?qū)⑼庠椿蚋咝У貙?dǎo)入寄主細(xì)胞。用病毒外殼蛋白質(zhì)包裝重組質(zhì)粒DNA形成的假病毒顆粒(pseudovirions)，即構(gòu)成了一種高效的轉(zhuǎn)化體系。⑤病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識(shí)別細(xì)胞接受器(acceptor)，1671．SV40病毒的基本生物學(xué)特性

猿猴空泡病毒40(Simianvacuolatingvirus40，SV40)載體的發(fā)展速度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其它動(dòng)物病毒載體。其主要原因在于：

*目前有關(guān)該病毒的分子生物學(xué)知識(shí)已有了相當(dāng)明顯的進(jìn)步。SV40病毒的基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，其大小僅有5243bp，很適于基因操作。

*它是頭一個(gè)完成基因組DNA全序列分析的動(dòng)物病毒，而且對(duì)其復(fù)制及轉(zhuǎn)錄方面的特性也有了相當(dāng)深刻的了解。1．SV40病毒的基本生物學(xué)特性猿猴空泡病毒40(168(1)SV40病毒的生命周期根據(jù)SV40感染作用的不同效應(yīng)，可將其寄主細(xì)胞分成三種不同的類型。①受體細(xì)胞：SV40感染細(xì)胞之后，產(chǎn)生感染性的病毒顆粒，并使寄