DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件

第二章DNA的復(fù)制，修復(fù)和重組1.DNA的代謝過程包括復(fù)制，修復(fù)和重組2.大腸桿菌遺傳圖整個圖分為100分鐘，每分鐘約40，000bp?；蛎Q基本反映基因的功能，用3個斜體字母表示，如mut，誘變相關(guān)基因；pol，DNA多聚酶基因；rec，重組相關(guān)基因等等。第二章DNA的復(fù)制，修復(fù)和重組1.DNA的代謝過程包括復(fù)1DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件2作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)名稱則用第一個字母為大寫的正體字，如“RecA蛋白”。第一節(jié)DNA復(fù)制

一.關(guān)于模板的概念（template）

模板分子的概念產(chǎn)生于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)建立之前，能指導(dǎo)子代生物大分子按特定順序合成的母鏈稱模板。二.DNA復(fù)制的基本規(guī)律

a.DNA復(fù)制是半保留的；作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)名稱則用第一個字母為大寫的正體字，3DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件4b.DNA復(fù)制在一個原點（orgin）開始，雙向進行；DNA分子復(fù)制的起點稱原點，大腸桿菌的復(fù)制原點稱OriC，終點區(qū)是ter。DNA復(fù)制點呈分叉狀，分叉狀復(fù)制區(qū)域稱復(fù)制叉。

c.DNA復(fù)制是半不連續(xù)的；

I.岡崎片斷（Okazakifragments）；II.復(fù)制叉上的前導(dǎo)鏈（leadingstrand）和滯后鏈（laggingstrand）；b.DNA復(fù)制在一個原點（orgin）開始，雙向進行5DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件6DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件7三.依賴于DNA的DNA聚合酶1.E.coliDNApolymeraseI的發(fā)現(xiàn)，ArthurKornberg，1955，單肽鏈，Mr＝103,000。2.DNA聚合酶酶促反應(yīng)機制(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi

引物任意脫核延長一個焦磷酸苷三磷酸核苷酸殘基

DNA聚合反應(yīng)的關(guān)鍵是生長鏈的末端核苷酸的游離3’羥基對下一個參加聚合三.依賴于DNA的DNA聚合酶8

反應(yīng)的脫氧核苷三磷酸中的α-磷原子發(fā)動親核進攻，建立酯鍵，釋放出焦磷酸。

DNA聚合酶催化反應(yīng)的基本規(guī)律：所有DNA聚合酶都需要模板；所有DNA聚合酶都需要引物（primer）；引物：互補于模板鏈的一個寡核苷酸片斷，它帶有一個游離的3’－OH，以便建立新的磷酸二酯鍵。所有的核酸鏈聚合反應(yīng)都從5‘——3’方向進行。

9四.DNA多聚化的熱力學(xué)

DNA聚合酶(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+Ppippi焦磷酸酶2pi＋2KJ/mol－30KJ/mol－28KJ/molΔG0’＝-28KJ/mol

四.DNA多聚化的熱力學(xué)10但由DNA聚合酶催化的上述反應(yīng)在無焦磷酸酶參與下仍能繼續(xù)進行。聚合反應(yīng)導(dǎo)致多重弱相互作用的形成，它們釋放的能量促進多聚化反應(yīng)：

C－H約100KJ/mol；OH…O＝C約4-5KJ/mol；vanderWaal’s約1KJ/mol。但由DNA聚合酶催化的上述反應(yīng)在無焦磷酸酶參與下仍能繼11DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件12五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應(yīng)的精確性

E.coli

中的實際錯誤率10-9－10-10；

E.coli

基因組4.7×106bp；1.復(fù)制的堿基配對可以達到10-4－10-5的錯誤率。這錯誤率相當于堿基上功能基團的互變異構(gòu)反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)。2.DNA多聚酶3‘－5’外切酶活性對堿基配對的校對作用（proofreading），可以提高精度102－103倍，距離細胞內(nèi)DNA復(fù)制精度還差102。校對作用不是合成的逆反應(yīng)，兩種活性是獨立的。五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應(yīng)的精確性13以上兩個過程復(fù)制和校對，都依賴堿基配對中的非共價相互作用，這是提高信息分子復(fù)制高保真度的根本方法。六.大腸桿菌有多種DNA聚合酶1.DNApolymeraseI的特性5’－3’聚合酶活性；3’－5’外切酶活性；5’－3’外切酶活性。DNA合成速度不及復(fù)制叉移動速度的1/20，16-20nt/s；連續(xù)性太低；以上兩個過程復(fù)制和校對，都依賴堿基配對中的非共價相互作14遺傳學(xué)證據(jù)證明polA－細胞也能存活；2.II型DNA聚合酶和III型DNA聚合酶

II型參加SOS修復(fù)；

III型是主要的DNA復(fù)制酶；3.E.coliI型DNA聚合酶的兩個主要應(yīng)用

a.“Nicktranslation”（切口移位技術(shù)），I型DNA聚合酶具有以雙鏈DNA的一個切口開始，用5‘－3’的外切酶活性降解這條舊鏈，并合成一條新鏈代替舊鏈，用這種技術(shù)在試管內(nèi)把放射性核苷酸導(dǎo)入DNA，用于探針放射性的標記。遺傳學(xué)證據(jù)證明polA－細胞也能存活；15DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件16

b.多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR，polymerasechainreaction），在試管內(nèi)擴增一個特定基因組片斷的一個方法。4.E.coli

三種DNA聚合酶的比較b.多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR，polymerasech17DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件18DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件19七.復(fù)制復(fù)合物（replisome，復(fù)制體）復(fù)制體含有20種以上的蛋白質(zhì)和酶類，如DNA解螺旋酶（helicases），ssb（單鏈結(jié)合蛋白，singlestrandbindingprotein），primase（引物酶），DNApolymeraseIII，DNApolymeraseI，DNAligase（DNA連接酶），DNA拓撲酶。八.大腸桿菌染色體DNA復(fù)制的三個階段生物大分子的合成都可以分成三個階段：起始（initiation），延長（elongation），終止（termination）。七.復(fù)制復(fù)合物（replisome，復(fù)制體）201.DNA合成的起始a.大腸桿菌復(fù)制原點，OriC1.DNA合成的起始21DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件22Consensussequence（交感順序）：一個理想化了的DNA順序，這種順序中的每個位置上的堿基代表著被比較的同功能的許多順序中最常出現(xiàn)的堿基。b.起始復(fù)合物（或預(yù)引復(fù)合物，preprimingcomplex）DnaA蛋白(20copies，結(jié)合于9bp序列，以打開串聯(lián)13bp序列）；

DnaB（helicase）DNA解螺旋；

DnaC蛋白促進DnaB蛋白的結(jié)合；Consensussequence（交感順序）：一個理想化23HU類組蛋白，刺激起始；

DnaG（primase）引物酶，合成RNA物；

SSB單鏈DNA結(jié)合蛋白；

RNApolymerase促進DnaA的活性；

DNATopoisomeraseII釋放由DNA解螺旋產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)力（torsinalstrain）；c.復(fù)制起始的調(diào)節(jié)HU類組蛋白，刺激起始；24DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件252.復(fù)制中DNA鏈的延長

a.前導(dǎo)鏈的延長兩條鏈合成共同需要的酶：

DNAhelicase，DNATopoisomerase，SSB，DNApolymeraseIII，primase。b.滯后鏈的延長引物體（primosome）含有DnaB，DnaADnaG等七種蛋白，引物體間隔性地迫使引物酶合成含10-60核苷酸殘基長地RNA引物，DNApolymeraseIII加接脫氧核苷2.復(fù)制中DNA鏈的延長26圖12-9圖12-10圖12-927酸，DNApolymeraseI除去RNA引物，并合成DNA鏈代替，所留下的nick（切口）由DNA連接酶連接。

c.DNA連接酶連接具有5’－磷酸和3’－OH的切口形成磷酸二酯鍵，連接酶以NAD或ATP為能源。3.終止在原核細胞中，兩個方向相反的復(fù)制叉在染色體對相遇時復(fù)制的終止過程開始。酸，DNApolymeraseI除去RNA引物28八.真核細胞DNA的復(fù)制1.真核細胞染色體上有許多復(fù)制原點（起點），稱自體復(fù)制順序（autonomouslyreplicatingsequences，ARS），長約150bp，在yeast中，400ARS，in17chr。2.復(fù)制叉移動速度僅及細菌的1/10。3.有多個DNA聚合酶（α,ε,δ等）。八.真核細胞DNA的復(fù)制29第二節(jié)DNA修復(fù)（repair）一.關(guān)于突變的一些概念1.天然突變和誘變天然突變：如堿基的互變異構(gòu)，宇宙線造成的突變。天然突變率稱突變的本底水平（background）。

誘導(dǎo)突變（inducedmutation）：補加誘變劑誘發(fā)的突變。誘變劑：引起突變的任何物理因子或化學(xué)因子稱誘變劑或誘變因子。第二節(jié)DNA修復(fù)（repair）30DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件31一些生物學(xué)過程也引起突變，如病毒的感染（在染色體上的整合等）。2.突變的分類點突變：用一個堿基對替換另一個堿基對的突變。插入（insertion）和缺失（deletion）：插入和缺失都可以造成基因的框移突變（frameshiftmutation）。

無意義突變（nonsensemutation）：有意義密碼改變成終止密碼的突變。一些生物學(xué)過程也引起突變，如病毒的感染（在染色體上的整32DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件333.點突變的滲漏性a.沉默突變（silentmutation）突變不改變氨基酸殘基，CUX對應(yīng)Leu，CCX對應(yīng)Pro；改變氨基酸殘基但不影響基因產(chǎn)物的活性，如PheTyr，LeuIle；正向突變滅活一個基因的突變稱正向突變（forwardmutation）。突變的回復(fù)3.點突變的滲漏性34能克服原始突變造成的影響的第二次突變稱回復(fù)突變（reversionmutation）真回復(fù)truereversion第二點回復(fù)：回復(fù)突變發(fā)生在同一基因內(nèi)的第二個位點。4.突變的抑制作用（suppression）a.基因內(nèi)抑制（或基因內(nèi)回復(fù)，intragenicreversion），指一個補償突變恢復(fù)了原突變蛋白的活性構(gòu)象；或在一個框移突變之后恢復(fù)正確的讀碼框架。能克服原始突變造成的影響的第二次突變稱回復(fù)突變（rev35DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件36b.突變的基因間回復(fù)（或基因間的抑制）第二個基因的突變排除或抑制了第一個基因突變的影響，如抑制子tRNA抑制無意義突變和錯義突變。二.腫瘤發(fā)生和Ames檢測

DNA核苷酸順序的永久性改變稱為突變，突變的積累導(dǎo)致動物腫瘤的發(fā)生。一般的說誘變劑是致癌物。Ames檢測法檢出致癌物：利用一株沙門氏桿菌組氨酸合成酶缺陷株。誘變劑（致癌物）可導(dǎo)致基因突變的回復(fù)，使之成為野生型，這原理可用檢出誘變劑。b.突變的基因間回復(fù)（或基因間的抑制）37DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件38DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件39三.細胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)細胞有多個DNA修復(fù)系統(tǒng)，為遺傳信息的完整性不惜代價。DNA修復(fù)的主要根據(jù)是以正確的互補鏈修復(fù)損傷的或錯誤的鏈。1.錯配修復(fù)（mismatchrepair）a.DNA復(fù)制后錯配堿基在模板鏈指導(dǎo)下的修復(fù)過程稱錯配修復(fù)，可提高復(fù)制精確率102-103倍；

b.區(qū)分模板鏈和新合成鏈依靠識別親本三.細胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)40DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件41鏈中GATC序列中的甲基化標簽（tag）；c.Dam甲基化酶甲基化DNA（A堿基的N6甲基化）；

d.錯配修復(fù)所需的酶類

Dam甲基化酶；MutH，MutL，MutS蛋白；DNAhelicaseII；SSB；DNApolymerasIII；exonucleaseI；外切酶VII；RecJ核酸酶；DNAligase。e.修復(fù)過程圖解鏈中GATC序列中的甲基化標簽（tag）；42DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件432.堿基的切割修復(fù)主要酶類：核酸糖基化酶（glycosylase），AP內(nèi)切核酸酶，DNApolymeraseI，DNAligase

核酸糖基化酶識別損傷堿基，切割損傷堿基產(chǎn)生AP位點，由AP內(nèi)切核酸酶切割A(yù)P位點的磷酸二酯鍵。3.核苷酸切割修復(fù)由uvrA，uvrB，uvrC編碼的“ABC切割核酸酶”，ABCexcinuclease切去堿基光促合成產(chǎn)物，切去損傷點上游8nt，下游4-5nt。2.堿基的切割修復(fù)44DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件45DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件464.直接修復(fù)（directrepair）a.光復(fù)活修復(fù)

DNA光解酶（photolyase）b.O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶去甲基化4.直接修復(fù)（directrepair）47DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件485.差錯傾向修復(fù)（error-pronerepair）SOS反應(yīng)

a.SOS反應(yīng)當細胞DNA受到大量的嚴重的損傷時，誘發(fā)細胞的應(yīng)急反應(yīng)（SOSrespone）。此時細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生大量應(yīng)急反應(yīng)所需的蛋白和酶。這種反應(yīng)使細胞分裂受到抑制，溶源狀態(tài)的噬菌體被誘導(dǎo)進入溶菌周期，正常的DNA復(fù)制停止。同時誘發(fā)產(chǎn)生許多正常的DNA修復(fù)酶和特殊的5.差錯傾向修復(fù)（error-pronerepair）S49DNA修復(fù)－差錯傾向修復(fù)所需的酶類。DNA修復(fù)－差錯傾向修復(fù)所需的酶類。50DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件51b.DNApolymeraseV和translesionreplicationDNA聚合酶V能復(fù)制DNA鏈的損傷位點，造成高突變率。b.DNApolymeraseV和transle52第三節(jié)細胞內(nèi)DNA的遺傳重組（Geneticrecombination，或稱基因重排Generearrangement）一.普通重組（Generalrecombination）和位點特異性重組（site-specificrecombination）1.普通重組（依賴同源順序的重組）親本的雙鏈DNA在同源順序區(qū)域并排（聯(lián)會），通過互換同源DNA片斷形成新組合的DNA分子，這個過程稱為普通第三節(jié)細胞內(nèi)DNA的遺傳重組（Geneticrecomb53遺傳重組。2.位點特異重組無需同源順序的遺傳重組，包括：

a.外來DNA在特殊染色體特殊位點的整合，如HIV，λ；b.基因轉(zhuǎn)座（transposition）

轉(zhuǎn)座是基因或某DNA順序從一個染色體轉(zhuǎn)移到另一染色體或從同一染色體的一個座位轉(zhuǎn)移到另一座位的遺傳學(xué)事件。遺傳重組。54DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件553.遺傳重組的生物學(xué)意義a.普通重組在DNA損傷的修復(fù)中起重要作用；b.重組擴大生物界遺傳多樣性，產(chǎn)生新的基因組合，對進化有重要意義；

c.調(diào)節(jié)基因表達，一個基因的沉默或激活可因它在染色體上的位置和取向的改變而改變，如酵母性別轉(zhuǎn)換，菌毛基因類型的改變（phasevariation）；

d.遺傳重組使抗體多樣化。3.遺傳重組的生物學(xué)意義56二.普通遺傳重組機制1.依賴于同源順序遺傳重組的細胞學(xué)證據(jù)：染色體的交叉互換二.普通遺傳572.普通重組的Holliday模型（RobinHolliday，1964）a.同源DNA（homologousduplexes）并排在一起（“聯(lián)會”）；

b.內(nèi)切酶切割兩并列雙鏈中各一條鏈；

c.交叉互換（crossingover）；d.交叉點移動；

e.重組中間體切割分解產(chǎn)生兩種不同的重組產(chǎn)物；2.普通重組的Holliday模型（RobinHolli58DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件593.同源DNA雙鏈配對形成Chi（χ）型重組中間體的證據(jù)。

a.單體（monomer）質(zhì)粒DNA在細胞內(nèi)可產(chǎn)生頭尾相連的環(huán)形二聚體（dimer）；b.質(zhì)粒同源重組中間體限制酶切割產(chǎn)生臂長相等的χ型產(chǎn)物；4.遺傳重組需要特殊的酶

a.在大腸桿菌細胞中普通遺傳重組依賴于一組rec系列基因產(chǎn)物，其中有recA，recB，recC，recD以及其它一些酶類，如3.同源DNA雙鏈配對形成Chi（χ）型重組中間體的證據(jù)。60DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件61DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件62topo酶，DNA聚合酶，分解酶等。遺傳學(xué)證據(jù)：recA－（缺陷）細胞使細胞的重組率下降10-4，recA－細胞在紫外光照射后的存活率降低為10-2－10-3。

b.RecA蛋白對單鏈DNA的結(jié)合（形成絲狀體）促進與同源雙鏈DNA之間的DNA鏈互換。RecA蛋白在體外（invitro）誘發(fā)的DNA鏈交換反應(yīng)；RecA蛋白介導(dǎo)的DNA鏈交換模型；topo酶，DNA聚合酶，分解酶等。63DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件645.E.coliRecBCD酶有解螺旋和內(nèi)切酶活性，RecBCD復(fù)合物有ATPdrivenhelicase和nuclease活性，RecD具有內(nèi)切酶活性，能切開雙鏈DNA中的Chi位點（重組熱點），產(chǎn)生單鏈DNA，Chi位點的堿基順序為5‘－GCTGGTGG－3’。6.重組修復(fù)（復(fù)制后修復(fù)，postreplicationrepair），當受損傷的DNA鏈的配偶鏈不存在時，同源重組可提供修復(fù)所需的信息。5.E.coliRecBCD酶有解螺旋和內(nèi)切酶活性，R65DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件66DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件677.位點特異重組（sitespecificrecombination）

一.λ噬菌體DNA在寄主染色體上的整合和切出

a.λ的兩種生活周期溶菌生長周期（lyticcycle）

溶原狀態(tài)（lysogenicstate）b.λ的整合和切出時位點特異重組事件整合位點att（attachmentsites）attP（phage位點）

attB（Bacterialsite）7.位點特異重組（sitespecificrecomb68其O順序是attP和attB共有的順序（同源），P，P’和B，B’為各自的側(cè)接順序（flankingsequence）。

二.位點特異重組依賴于重組酶和由重組酶識別的特殊順序（20－200bp），重組酶的識別順序的取向可能導(dǎo)致不同的重組結(jié)果。

a.重組導(dǎo)致基因順序顛倒；b.重組導(dǎo)致缺失和插入；其O順序是attP和attB共有的順序（同源），P69DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件70DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件71三.免疫球蛋白基因的重組

a.哺乳動物，人抗體的多樣性數(shù)以百萬計；

b.免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)分重鏈，輕鏈（兩個家族Kappa鏈，lambda鏈，重鏈輕鏈都由可變區(qū)，連接區(qū)和不變區(qū)三部分組成；

c.抗體的多樣性是由抗體基因片段的位點特異重組造成的不同組合導(dǎo)致的；以IgGKappa輕鏈為例三.免疫球蛋白基因的重組72可變區(qū)連接區(qū)不變區(qū)300種片斷4種1種組合數(shù)300×4＝1200種，由于連接方式不同造成2.5倍的多樣性，于是總數(shù)1200×2.5＝3000種，重鏈按類似的方式重組可有5000種組合；于是干細胞至少在分化過程可以產(chǎn)生5000×3000＝1.5×107種功能特異的抗體，產(chǎn)生分化完全的B淋巴細胞，每種B淋巴細胞只產(chǎn)生一種抗體?？勺儏^(qū)連接區(qū)不變區(qū)73多樣性還來自于不知原因的V順序高突變率多樣性還74演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！75第二章DNA的復(fù)制，修復(fù)和重組1.DNA的代謝過程包括復(fù)制，修復(fù)和重組2.大腸桿菌遺傳圖整個圖分為100分鐘，每分鐘約40，000bp。基因名稱基本反映基因的功能，用3個斜體字母表示，如mut，誘變相關(guān)基因；pol，DNA多聚酶基因；rec，重組相關(guān)基因等等。第二章DNA的復(fù)制，修復(fù)和重組1.DNA的代謝過程包括復(fù)76DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件77作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)名稱則用第一個字母為大寫的正體字，如“RecA蛋白”。第一節(jié)DNA復(fù)制

一.關(guān)于模板的概念（template）

模板分子的概念產(chǎn)生于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)建立之前，能指導(dǎo)子代生物大分子按特定順序合成的母鏈稱模板。二.DNA復(fù)制的基本規(guī)律

a.DNA復(fù)制是半保留的；作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)名稱則用第一個字母為大寫的正體字，78DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件79b.DNA復(fù)制在一個原點（orgin）開始，雙向進行；DNA分子復(fù)制的起點稱原點，大腸桿菌的復(fù)制原點稱OriC，終點區(qū)是ter。DNA復(fù)制點呈分叉狀，分叉狀復(fù)制區(qū)域稱復(fù)制叉。

c.DNA復(fù)制是半不連續(xù)的；

I.岡崎片斷（Okazakifragments）；II.復(fù)制叉上的前導(dǎo)鏈（leadingstrand）和滯后鏈（laggingstrand）；b.DNA復(fù)制在一個原點（orgin）開始，雙向進行80DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件81DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件82三.依賴于DNA的DNA聚合酶1.E.coliDNApolymeraseI的發(fā)現(xiàn)，ArthurKornberg，1955，單肽鏈，Mr＝103,000。2.DNA聚合酶酶促反應(yīng)機制(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi

引物任意脫核延長一個焦磷酸苷三磷酸核苷酸殘基

DNA聚合反應(yīng)的關(guān)鍵是生長鏈的末端核苷酸的游離3’羥基對下一個參加聚合三.依賴于DNA的DNA聚合酶83

反應(yīng)的脫氧核苷三磷酸中的α-磷原子發(fā)動親核進攻，建立酯鍵，釋放出焦磷酸。

DNA聚合酶催化反應(yīng)的基本規(guī)律：所有DNA聚合酶都需要模板；所有DNA聚合酶都需要引物（primer）；引物：互補于模板鏈的一個寡核苷酸片斷，它帶有一個游離的3’－OH，以便建立新的磷酸二酯鍵。所有的核酸鏈聚合反應(yīng)都從5‘——3’方向進行。

84四.DNA多聚化的熱力學(xué)

DNA聚合酶(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+Ppippi焦磷酸酶2pi＋2KJ/mol－30KJ/mol－28KJ/molΔG0’＝-28KJ/mol

四.DNA多聚化的熱力學(xué)85但由DNA聚合酶催化的上述反應(yīng)在無焦磷酸酶參與下仍能繼續(xù)進行。聚合反應(yīng)導(dǎo)致多重弱相互作用的形成，它們釋放的能量促進多聚化反應(yīng)：

C－H約100KJ/mol；OH…O＝C約4-5KJ/mol；vanderWaal’s約1KJ/mol。但由DNA聚合酶催化的上述反應(yīng)在無焦磷酸酶參與下仍能繼86DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件87五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應(yīng)的精確性

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中的實際錯誤率10-9－10-10；

E.coli

基因組4.7×106bp；1.復(fù)制的堿基配對可以達到10-4－10-5的錯誤率。這錯誤率相當于堿基上功能基團的互變異構(gòu)反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)。2.DNA多聚酶3‘－5’外切酶活性對堿基配對的校對作用（proofreading），可以提高精度102－103倍，距離細胞內(nèi)DNA復(fù)制精度還差102。校對作用不是合成的逆反應(yīng)，兩種活性是獨立的。五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應(yīng)的精確性88以上兩個過程復(fù)制和校對，都依賴堿基配對中的非共價相互作用，這是提高信息分子復(fù)制高保真度的根本方法。六.大腸桿菌有多種DNA聚合酶1.DNApolymeraseI的特性5’－3’聚合酶活性；3’－5’外切酶活性；5’－3’外切酶活性。DNA合成速度不及復(fù)制叉移動速度的1/20，16-20nt/s；連續(xù)性太低；以上兩個過程復(fù)制和校對，都依賴堿基配對中的非共價相互作89遺傳學(xué)證據(jù)證明polA－細胞也能存活；2.II型DNA聚合酶和III型DNA聚合酶

II型參加SOS修復(fù)；

III型是主要的DNA復(fù)制酶；3.E.coliI型DNA聚合酶的兩個主要應(yīng)用

a.“Nicktranslation”（切口移位技術(shù)），I型DNA聚合酶具有以雙鏈DNA的一個切口開始，用5‘－3’的外切酶活性降解這條舊鏈，并合成一條新鏈代替舊鏈，用這種技術(shù)在試管內(nèi)把放射性核苷酸導(dǎo)入DNA，用于探針放射性的標記。遺傳學(xué)證據(jù)證明polA－細胞也能存活；90DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件91

b.多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR，polymerasechainreaction），在試管內(nèi)擴增一個特定基因組片斷的一個方法。4.E.coli

三種DNA聚合酶的比較b.多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR，polymerasech92DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件93DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件94七.復(fù)制復(fù)合物（replisome，復(fù)制體）復(fù)制體含有20種以上的蛋白質(zhì)和酶類，如DNA解螺旋酶（helicases），ssb（單鏈結(jié)合蛋白，singlestrandbindingprotein），primase（引物酶），DNApolymeraseIII，DNApolymeraseI，DNAligase（DNA連接酶），DNA拓撲酶。八.大腸桿菌染色體DNA復(fù)制的三個階段生物大分子的合成都可以分成三個階段：起始（initiation），延長（elongation），終止（termination）。七.復(fù)制復(fù)合物（replisome，復(fù)制體）951.DNA合成的起始a.大腸桿菌復(fù)制原點，OriC1.DNA合成的起始96DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件97Consensussequence（交感順序）：一個理想化了的DNA順序，這種順序中的每個位置上的堿基代表著被比較的同功能的許多順序中最常出現(xiàn)的堿基。b.起始復(fù)合物（或預(yù)引復(fù)合物，preprimingcomplex）DnaA蛋白(20copies，結(jié)合于9bp序列，以打開串聯(lián)13bp序列）；

DnaB（helicase）DNA解螺旋；

DnaC蛋白促進DnaB蛋白的結(jié)合；Consensussequence（交感順序）：一個理想化98HU類組蛋白，刺激起始；

DnaG（primase）引物酶，合成RNA物；

SSB單鏈DNA結(jié)合蛋白；

RNApolymerase促進DnaA的活性；

DNATopoisomeraseII釋放由DNA解螺旋產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)力（torsinalstrain）；c.復(fù)制起始的調(diào)節(jié)HU類組蛋白，刺激起始；99DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1002.復(fù)制中DNA鏈的延長

a.前導(dǎo)鏈的延長兩條鏈合成共同需要的酶：

DNAhelicase，DNATopoisomerase，SSB，DNApolymeraseIII，primase。b.滯后鏈的延長引物體（primosome）含有DnaB，DnaADnaG等七種蛋白，引物體間隔性地迫使引物酶合成含10-60核苷酸殘基長地RNA引物，DNApolymeraseIII加接脫氧核苷2.復(fù)制中DNA鏈的延長101圖12-9圖12-10圖12-9102酸，DNApolymeraseI除去RNA引物，并合成DNA鏈代替，所留下的nick（切口）由DNA連接酶連接。

c.DNA連接酶連接具有5’－磷酸和3’－OH的切口形成磷酸二酯鍵，連接酶以NAD或ATP為能源。3.終止在原核細胞中，兩個方向相反的復(fù)制叉在染色體對相遇時復(fù)制的終止過程開始。酸，DNApolymeraseI除去RNA引物103八.真核細胞DNA的復(fù)制1.真核細胞染色體上有許多復(fù)制原點（起點），稱自體復(fù)制順序（autonomouslyreplicatingsequences，ARS），長約150bp，在yeast中，400ARS，in17chr。2.復(fù)制叉移動速度僅及細菌的1/10。3.有多個DNA聚合酶（α,ε,δ等）。八.真核細胞DNA的復(fù)制104第二節(jié)DNA修復(fù)（repair）一.關(guān)于突變的一些概念1.天然突變和誘變天然突變：如堿基的互變異構(gòu)，宇宙線造成的突變。天然突變率稱突變的本底水平（background）。

誘導(dǎo)突變（inducedmutation）：補加誘變劑誘發(fā)的突變。誘變劑：引起突變的任何物理因子或化學(xué)因子稱誘變劑或誘變因子。第二節(jié)DNA修復(fù)（repair）105DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件106一些生物學(xué)過程也引起突變，如病毒的感染（在染色體上的整合等）。2.突變的分類點突變：用一個堿基對替換另一個堿基對的突變。插入（insertion）和缺失（deletion）：插入和缺失都可以造成基因的框移突變（frameshiftmutation）。

無意義突變（nonsensemutation）：有意義密碼改變成終止密碼的突變。一些生物學(xué)過程也引起突變，如病毒的感染（在染色體上的整107DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1083.點突變的滲漏性a.沉默突變（silentmutation）突變不改變氨基酸殘基，CUX對應(yīng)Leu，CCX對應(yīng)Pro；改變氨基酸殘基但不影響基因產(chǎn)物的活性，如PheTyr，LeuIle；正向突變滅活一個基因的突變稱正向突變（forwardmutation）。突變的回復(fù)3.點突變的滲漏性109能克服原始突變造成的影響的第二次突變稱回復(fù)突變（reversionmutation）真回復(fù)truereversion第二點回復(fù)：回復(fù)突變發(fā)生在同一基因內(nèi)的第二個位點。4.突變的抑制作用（suppression）a.基因內(nèi)抑制（或基因內(nèi)回復(fù)，intragenicreversion），指一個補償突變恢復(fù)了原突變蛋白的活性構(gòu)象；或在一個框移突變之后恢復(fù)正確的讀碼框架。能克服原始突變造成的影響的第二次突變稱回復(fù)突變（rev110DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件111b.突變的基因間回復(fù)（或基因間的抑制）第二個基因的突變排除或抑制了第一個基因突變的影響，如抑制子tRNA抑制無意義突變和錯義突變。二.腫瘤發(fā)生和Ames檢測

DNA核苷酸順序的永久性改變稱為突變，突變的積累導(dǎo)致動物腫瘤的發(fā)生。一般的說誘變劑是致癌物。Ames檢測法檢出致癌物：利用一株沙門氏桿菌組氨酸合成酶缺陷株。誘變劑（致癌物）可導(dǎo)致基因突變的回復(fù)，使之成為野生型，這原理可用檢出誘變劑。b.突變的基因間回復(fù)（或基因間的抑制）112DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件113DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件114三.細胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)細胞有多個DNA修復(fù)系統(tǒng)，為遺傳信息的完整性不惜代價。DNA修復(fù)的主要根據(jù)是以正確的互補鏈修復(fù)損傷的或錯誤的鏈。1.錯配修復(fù)（mismatchrepair）a.DNA復(fù)制后錯配堿基在模板鏈指導(dǎo)下的修復(fù)過程稱錯配修復(fù)，可提高復(fù)制精確率102-103倍；

b.區(qū)分模板鏈和新合成鏈依靠識別親本三.細胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)115DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件116鏈中GATC序列中的甲基化標簽（tag）；c.Dam甲基化酶甲基化DNA（A堿基的N6甲基化）；

d.錯配修復(fù)所需的酶類

Dam甲基化酶；MutH，MutL，MutS蛋白；DNAhelicaseII；SSB；DNApolymerasIII；exonucleaseI；外切酶VII；RecJ核酸酶；DNAligase。e.修復(fù)過程圖解鏈中GATC序列中的甲基化標簽（tag）；117DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1182.堿基的切割修復(fù)主要酶類：核酸糖基化酶（glycosylase），AP內(nèi)切核酸酶，DNApolymeraseI，DNAligase

核酸糖基化酶識別損傷堿基，切割損傷堿基產(chǎn)生AP位點，由AP內(nèi)切核酸酶切割A(yù)P位點的磷酸二酯鍵。3.核苷酸切割修復(fù)由uvrA，uvrB，uvrC編碼的“ABC切割核酸酶”，ABCexcinuclease切去堿基光促合成產(chǎn)物，切去損傷點上游8nt，下游4-5nt。2.堿基的切割修復(fù)119DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件120DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1214.直接修復(fù)（directrepair）a.光復(fù)活修復(fù)

DNA光解酶（photolyase）b.O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶去甲基化4.直接修復(fù)（directrepair）122DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1235.差錯傾向修復(fù)（error-pronerepair）SOS反應(yīng)

a.SOS反應(yīng)當細胞DNA受到大量的嚴重的損傷時，誘發(fā)細胞的應(yīng)急反應(yīng)（SOSrespone）。此時細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生大量應(yīng)急反應(yīng)所需的蛋白和酶。這種反應(yīng)使細胞分裂受到抑制，溶源狀態(tài)的噬菌體被誘導(dǎo)進入溶菌周期，正常的DNA復(fù)制停止。同時誘發(fā)產(chǎn)生許多正常的DNA修復(fù)酶和特殊的5.差錯傾向修復(fù)（error-pronerepair）S124DNA修復(fù)－差錯傾向修復(fù)所需的酶類。DNA修復(fù)－差錯傾向修復(fù)所需的酶類。125DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件126b.DNApolymeraseV和translesionreplicationDNA聚合酶V能復(fù)制DNA鏈的損傷位點，造成高突變率。b.DNApolymeraseV和transle127第三節(jié)細胞內(nèi)DNA的遺傳重組（Geneticrecombination，或稱基因重排Generearrangement）一.普通重組（Generalrecombination）和位點特異性重組（site-specificrecombination）1.普通重組（依賴同源順序的重組）親本的雙鏈DNA在同源順序區(qū)域并排（聯(lián)會），通過互換同源DNA片斷形成新組合的DNA分子，這個過程稱為普通第三節(jié)細胞內(nèi)DNA的遺傳重組（Geneticrecomb128遺傳重組。2.位點特異重組無需同源順序的遺傳重組，包括：

a.外來DNA在特殊染色體特殊位點的整合，如HIV，λ；b.基因轉(zhuǎn)座（transposition）

轉(zhuǎn)座是基因或某DNA順序從一個染色體轉(zhuǎn)移到另一染色體或從同一染色體的一個座位轉(zhuǎn)移到另一座位的遺傳學(xué)事件。遺傳重組。129DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1303.遺傳重組的生物學(xué)意義a.普通重組在DNA損傷的修復(fù)中起重要作用；b.重組擴大生物界遺傳多樣性，產(chǎn)生新的基因組合，對進化有重要意義；

c.調(diào)節(jié)基因表達，一個基因的沉默或激活可因它在染色體上的位置和取向的改變而改變，如酵母性別轉(zhuǎn)換，菌毛基因類型的改變（phasevariation）；

d.遺傳重組使抗體多樣化。3.遺傳重組的生物學(xué)意義131二.普通遺傳重組機制1.依賴于同源順序遺傳重組的細胞學(xué)證據(jù)：染色體的交叉互換二.普通遺傳1322.普通重組的Holliday模型（RobinHolliday，1964）a.同源DNA（homologousduplexes）并排在一起（“聯(lián)會”）；

b.內(nèi)切酶切割兩并列雙鏈中各一條鏈；

c.交叉互換（crossingover）；d.交叉點移動；

e.重組中間體切割分解產(chǎn)生兩種不同的重組產(chǎn)物；2.普通重組的Holliday模型（RobinHolli13