植物細(xì)胞工程實驗

12/12植物細(xì)胞工程實驗植物細(xì)胞工程

實

驗

報

告

班級：

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學(xué)號：

指導(dǎo)老師：

時間：

目錄

實驗準(zhǔn)備：①培養(yǎng)基母液的配制

②培養(yǎng)基的配制與滅菌

實驗一、香蕉吸芽的組織培養(yǎng)

實驗二、煙草葉片的組織培養(yǎng)

實驗三、木薯的微繁技術(shù)

實驗四、桉樹再生體系建立

實驗五、玉米花生成熟胚培養(yǎng)

實驗六、柱花草葉片組織培養(yǎng)

實驗七、水稻盾片組織培養(yǎng)

自選實驗：洋蔥、仙人掌的組織培養(yǎng)

實驗準(zhǔn)備：①培養(yǎng)基母液的配制

一、實驗?zāi)康?/p>

掌握培養(yǎng)基母液的配制。在配置培養(yǎng)基之前，為了方便和用量準(zhǔn)確，常常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、激素類分別配制成比培養(yǎng)基配方需要量大若干倍的母液。當(dāng)配置培養(yǎng)基時，只需按預(yù)先

計算好的量吸取母液。二、實驗原理

培養(yǎng)基是植物細(xì)胞、組織和器官吸取營養(yǎng)的場所。在植物細(xì)胞的分裂和分化過程中，需要各種營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)包括無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等。在對植物的器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)時，只是切取植物體的一小部分，它們無法象整體植株那樣合成生長發(fā)育所需的全部物質(zhì)。而自然界的植物千差萬別，每一種植物都有自己獨特的生理代謝過程和各自的營養(yǎng)需求，沒有哪一種培養(yǎng)基能夠適用于所有植物。因此，對培養(yǎng)基組成成分的篩選是非常重要和必不可少的程序。

目前對植物進(jìn)行組培時，人們所使用的培養(yǎng)基只幾十種，其中MS培養(yǎng)基應(yīng)用最為廣泛。說明MS培養(yǎng)基的無機鹽成分對許多植物種均是適宜的，它的無機鹽含量較高，微量元素種類較全，濃度也較高。三、實驗試劑與儀器設(shè)備1、藥品試劑：

母液、蔗糖、卡拉膠（或瓊脂）、NaOH溶液、HCl溶液、無菌水、NAA、BA、IAA、2，4-D等。2、儀器設(shè)備：

電子天平、量筒、PH試紙、培養(yǎng)瓶、解剖刀、酒精燈、高壓滅菌鍋、移液管、洗耳球、玻璃棒、藥勺、超凈操作臺、鐵架、鑷子等。四、實驗內(nèi)容（一）母液的配制

MS培養(yǎng)基母液方案配制如下表：

成分1L母液的用量(mg/L)

每升培養(yǎng)基取用量(ml)

備注

大量元素(20X)

NH4NO33300050

KNO338000KH2PO43400MgSO4﹒7H2O7400CaCl2

6600

50

單獨配制

鐵鹽(100X)

FeSO4.7H2O278010

Na2-EDTA3730

微量元素（200X）

KI1665H3BO31240MnSO4.H2O3380ZnSO4.7H2O1720Na2MoO4.2H2O50CuSO4.5H2O5CoCL2.6H2O5

有機元素(100X)

VB11010

VB650煙酸50甘氨酸200肌酸

10000

具體配制步驟如下：1、大量元素母液的配制

無機鹽中大量元素母液，按照培養(yǎng)基配方的用量，把各種化合物擴大20倍，用感量為0.01g的扭力天平，分別用50mL燒杯稱量，用重蒸餾水溶解.溶解時在每只燒杯中加入30-40mL重蒸餾水，置于酒精燈上,加熱使其溶解(注意溫度不可過高，60-70℃)。溶解后，在1000mL量筒中，混合后用重蒸餾水定容到1000mL。其中CaCl2單獨配制。在加入母液時CaCl2應(yīng)最后加入，以免形成沉淀。將配好的混合液倒入細(xì)口瓶中，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時，配1000mL培養(yǎng)基取此母液50mL。

2、微量元素母液的配制

無機鹽中微量元素母液，按照培養(yǎng)基配方用量的200倍，用微量0.0001g的電光分析天平，分別用50mL燒杯稱量，用重蒸餾水溶解?；旌隙ㄈ萦?00ml容量瓶中保存于冰箱中,配制培養(yǎng)基時，每配制1000mL培養(yǎng)基取此母液5mL.

3、鐵鹽母液的配制

無機鹽中鐵鹽母液，按照培養(yǎng)基配方用量的100倍，用感量0.01g的扭力分析天平，分別用50mL燒杯稱量，用重蒸餾水溶解，混合定容，倒入細(xì)口瓶中，每配制1000mL培養(yǎng)基取此母液10mL。

4、有機元素的配制

無機鹽中有機元素母液，按照培養(yǎng)基配方用量的100倍，用感量0.01g的扭力天平，分別用50mL燒杯稱量，用重蒸餾水溶解，混合定容，倒入細(xì)口瓶中，每配制1000mL培養(yǎng)基取此母液10mL。

五、注意事項

1、配制時注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。

2、配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。

3、藥品應(yīng)選取等級較高的化學(xué)純或分析純。

4、藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。

5、一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。

5、母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。

實驗準(zhǔn)備：②培養(yǎng)基的配制與滅菌

一、培養(yǎng)基的配制及消毒：

（1）按照MS培養(yǎng)基的配方（以配制1LMS培養(yǎng)基為例）取大燒杯加入先前配制好的母液其中包括：大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素10ml，最后加鈣鹽50ml充分混勻。再加入30g食用白糖，加入適量的去離子水使總量將近1L，混勻后調(diào)PH值（調(diào)至5.8-6.2），用1000ml量筒定容，最后向培養(yǎng)基中添加8.0g卡拉膠混勻。注意事項：

○1配制MS時，鈣鹽一定要最后加入；

○2調(diào)好PH值后再加卡拉膠（或瓊脂）。

（2）培養(yǎng)基配制好后分裝到培養(yǎng)瓶中每瓶約30ml，蓋好瓶蓋帖上標(biāo)簽。需要加入激素的培養(yǎng)基在定容到1000ml后加入所需的激素?；靹蚝笳{(diào)PH值（調(diào)至5.8-6.2），用1000ml容量瓶定容，最后向培養(yǎng)基中添加8g卡拉膠，混勻后進(jìn)行分裝，然后裝入高溫高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌（一般培養(yǎng)基用0.1MPa，121.5℃，15～30分鐘可達(dá)到徹底滅菌的目的）。滅菌好后取出冷卻備用。

（3）培養(yǎng)環(huán)境條件：培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d，每隔7天觀察一次。

二、超凈操作臺的消毒

消毒時先用75%的酒精對超凈臺的各處進(jìn)行消毒，點燃酒精燈放于超凈臺右側(cè)，再對實驗工具進(jìn)行

灼燒滅菌，后放于架上冷卻待用。并依次將實驗中所用培養(yǎng)基瓶及所需試劑瓶進(jìn)行消毒，置于超凈臺左側(cè)，注意實驗中要用75%的酒精對手進(jìn)行消毒。

實驗一、香蕉吸芽的組織培養(yǎng)

前言：香蕉傳統(tǒng)的繁殖方法多是采用吸芽分株法，這種方法的繁殖系數(shù)低，速度慢，難以滿足當(dāng)前大規(guī)模的栽培生產(chǎn)，且容易傳播疾病。利用組織培養(yǎng)的技術(shù)來對香蕉優(yōu)質(zhì)品種進(jìn)行無性繁殖，這樣不但可以保持香蕉的優(yōu)良性狀，加快繁殖速度，而且，試管苗不帶病蟲害和病毒病，并且，利用組織培養(yǎng)技術(shù)得到的幼苗生長比較一致，有利于田間的管理和采收，本實驗利用香蕉的吸芽作為外植體。

1、材料和方法:

1.1材料

(1)香蕉吸芽

(2)無菌紙、鑷子、酒精燈等

(3)實驗采用MS基本培養(yǎng)基，PH：5.8-6

(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS＋BA3mg／L＋30g／L白糖+8.5g／L卡拉膠

(5)繼代培養(yǎng)基：MS＋BA5mg／L＋30g／L白糖+8.5g／L卡拉膠

1.2方法

1.2.1外植體消毒

①用自來水沖洗吸芽表面的泥土，剝離外假莖，只留下莖和假莖各2-3cm長，假莖的的直徑有2-3cm，

②用洗衣粉清洗一遍，用自來水沖洗，轉(zhuǎn)入0.1%升汞浸泡15-20min，其間不斷攪拌，棄去升汞用無菌水洗3遍（無菌水漂洗：將從升汞中取出的香蕉吸芽組織塊轉(zhuǎn)入無菌水中漂洗，不斷搖動使漂洗干凈）留在瓶中備用。

1.2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

將香蕉吸芽放到無菌工作臺的無菌紙上，用消毒刀將外植體的假莖的最外層剝掉，以及有消毒刀將已經(jīng)變色的莖外面一小層也切掉，然后從外植體莖中間一分為四，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，共4瓶。7天后觀察。

1.2.3繼代培養(yǎng)

將誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的香蕉苗中長勢較好的一瓶用作繼代培養(yǎng)的材料，在超凈工作臺上將香蕉芽叢分開，切去頂部葉片部分，削去底部褐化部分，將芽叢接種于香蕉繼代增殖培養(yǎng)基中，接種2瓶。

1.2.4培養(yǎng)條件：

培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d（注意香蕉吸芽誘導(dǎo)期無需光照）,每個星期觀察一次。

2、實驗結(jié)果與分析：

2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)：共接種了4瓶，出現(xiàn)一定的褐化現(xiàn)象，誘導(dǎo)率為100%，污染率為25%，說明用0.1%的升汞對香蕉的吸芽消毒15-20min的時間控制比較合理，消毒的效果也較好。

附錄1、誘導(dǎo)培養(yǎng)實驗結(jié)果統(tǒng)計表

外植體數(shù)目成活數(shù)污染數(shù)成活率污染率

441100%25%

2.2繼代培養(yǎng)：從三瓶未污染的香蕉苗中選取長勢最好的一瓶，繼代培養(yǎng)兩瓶，一瓶長勢良好，另一瓶香蕉苗由于褐化現(xiàn)象比較嚴(yán)重而死去。

原因：可能是因為在繼代的培養(yǎng)過程中，用刀切去褐化部分時切去的過多，使香蕉基部受傷嚴(yán)重而死亡。

3、注意事項

1）整個實驗過程要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；

2）倒培養(yǎng)基時要邊用玻璃棒攪拌，邊倒培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基的濃度不均勻；

3）觀察記錄時，要注意拿組培瓶的方式，手要握住組培瓶的下方而不要握住組培瓶的蓋子；

4）發(fā)現(xiàn)污染的外植體，要及時清理干凈，以免污染其他的；

5）觀察記錄時要仔細(xì)，認(rèn)真描述并做好記錄。

實驗二、煙草葉片組織培養(yǎng)

前言：目前煙草一般采用有性繁殖，但繁殖的煙苗不均衡，易發(fā)生變異，而且易感病菌，造成多種病害發(fā)生，品質(zhì)退化，從而影響經(jīng)濟收人。用嫩葉片的組培方法，可以保持優(yōu)良品種的優(yōu)良性狀，減少病蟲害，從而達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的目的。另外，煙草生長速度快，生長周期短，所以是基因工程中最為廣泛使用的模式植物之一。本實驗利用煙草的葉片作為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋BA1.0mg／L。

1、材料和方法:

1.1材料

(3)1）煙草葉片、無菌紙、鑷子、酒精燈等

2）MS為基本培養(yǎng)基

3）誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS＋BA1.0mg／L＋30g／L白糖+8.5g／L卡拉膠

4）繼代培養(yǎng)基：MS＋BA1.0mg／L＋NAA0.5mg／L＋30g／L白糖+8.5g／L卡拉膠

1.2方法

1.2.1外植體消毒

將煙草葉片洗凈，將煙草葉片左右墊與牛皮紙上用手術(shù)刀切取2cm長，2cm寬的無主葉脈、主側(cè)葉脈的長方形葉片塊（10片左右），置于加了1-2滴土溫的0.1%的升汞溶液中消毒10-15min，期間注意不斷搖動，取出葉片置于無菌水中清洗3次，留于最后清洗的無菌水中備用。

1.2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

將煙草葉片取出將葉片周遍切去，再將每片葉切成2片，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每7天觀察記錄一次。

1.2.3培養(yǎng)條件：

培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d，,每個星期觀察一次。

2、實驗結(jié)果與分析：

1）誘導(dǎo)培養(yǎng)全部被污染，污染率100%，誘導(dǎo)率為0。

原因可能是：①滅菌不徹底，整組均被污染

②用升汞消毒的時間過短，因此應(yīng)適當(dāng)延長消毒時間。

③操作過程染菌

附錄1、第一次煙草誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果統(tǒng)計表

接種瓶數(shù)誘導(dǎo)數(shù)污染數(shù)誘導(dǎo)率污染率

4040100%

2）未能進(jìn)行繼代培養(yǎng)

3、注意事項

1）整個實驗過程要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；

2）倒培養(yǎng)基時要邊用玻璃棒攪拌，邊倒培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基的濃度不均勻；

3）觀察記錄時，要注意拿組培瓶的方式，手要握住組培瓶的下方而不要握住組培瓶的蓋子；

4）發(fā)現(xiàn)污染的外植體，要及時清理干凈，以免污染其他的；

5）觀察記錄時要仔細(xì)，認(rèn)真描述并做好記錄。

實驗三、木薯的微繁技術(shù)

前言：在我國南亞熱帶地區(qū)，木薯是僅次于水稻、甘薯、甘蔗和玉米的作物。木薯是用其莖干來進(jìn)行無性繁殖的，但是往往新品種剛剛出現(xiàn)時，其莖干是非常有限的，因此，對優(yōu)質(zhì)品種的迅速推廣是非常不利的。利用組織培養(yǎng)的方法不僅可以保持母樹的性狀，而且繁殖速度快，有利于品種的推廣。本實驗利用木薯的莖段作為外植體。

1、實驗材料與方法：

1.1實驗材料：

(4)1）、木薯幼枝、無菌紙、鑷子、酒精燈等

2）、以MS為基本培養(yǎng)基

3）、誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS＋CuSO40.05mg／L＋2,4-D0.02mg／L＋30g／L白糖+8.5g／L卡拉膠

1.2方法

1.2.1外植體的消毒：

1.從苗圃剪取幼嫩木薯枝條，剪去葉子。

2.以一個芽節(jié)為一段（芽節(jié)上下端保持1.5cm左右）切下，置于75%的酒精溶液中消毒5s。

3.再置于0.1%升汞溶液中消毒10-15min左右，其間注意不斷搖動，取出木薯枝條置于無菌水中清洗3次。

1.2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒好的木薯枝條取出，置于無菌的牛皮紙上，切去上下端各一小部分后，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種5瓶，7天后觀察。

1.2.3培養(yǎng)條件：

培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d，每個星期觀察一次。

2、實驗結(jié)果與分析

總共接種5瓶木薯，每瓶中接種2個木薯莖段。培養(yǎng)一周后觀察，幾乎所有的莖段都被污染了，污染率幾乎達(dá)到100%。其中有三瓶誘導(dǎo)成功。

可能的原因如下：1、在升汞中消毒的時間不夠，應(yīng)再適當(dāng)延長消毒時間；

2、取材的時間不合理，致使外植體表面帶有大量的菌，進(jìn)而導(dǎo)致外植體脫毒困難。

因此，取材時要選擇向陽的健壯的枝條并在天氣晴朗時取材，而不宜在陰雨天取

材。

3、注意事項

1）整個實驗過程要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；

2）倒培養(yǎng)基時要邊用玻璃棒攪拌，邊倒培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基的濃度不均勻；

實驗四、桉樹再生體系的建立

前言：桉樹是異花授粉植物，有性繁殖很容易引起變異，很難保持物種的優(yōu)良性狀，無性繁殖如扦插等繁殖得很慢，無法滿足生產(chǎn)的需要。而桉樹組培快繁可使桉樹保持其遺傳穩(wěn)定性，其繁殖系數(shù)大，一年內(nèi)一個桉樹帶節(jié)莖段，可以繁育百萬株以上的苗木。本實驗利用桉樹的莖段作為外植體。

1、實驗材料與方法：

1.1實驗材料：

(5)1）、桉樹幼枝、無菌紙、鑷子、酒精燈等

2）、以MS為基本培養(yǎng)基

3）、芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS＋BA1mg／L＋NAA0.5mg／L＋30g／L白糖+8.5g／L卡拉膠

1.2、方法

1.2.1外植體的消毒：

采取幼嫩桉樹枝條（選取腋芽還沒有抽出芽枝的），剪去葉子，置于清水下洗凈，在洗衣粉水中浸泡20min左右，清洗干凈后用流水（自來水）沖洗到下午做實驗時。取出以一個芽節(jié)為一段（芽節(jié)上端保持1-1.5cm，下端2cm左右）切下，置于75%的酒精溶液中消毒5s，在置于0.1%升汞溶液中消毒

10-15min，其間注意不斷搖動，取出桉樹枝條置于無菌水中清洗3次。

1.2.2芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒好的桉樹枝條取出，置于無菌的牛皮紙上，切去上下端各一小部分后，接入芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種5瓶。

1.2.3培養(yǎng)條件：

培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d，每個星期觀察一次。

2、實驗結(jié)果與分析

總共接種5瓶桉樹，每瓶中接種2個桉樹莖段。培養(yǎng)一周后觀察，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的莖段都被真菌或細(xì)菌污染了，污染率幾乎達(dá)到100%。

可能的原因如下：1、在升汞中消毒的時間不夠，應(yīng)再適當(dāng)延長消毒時間；

2、取材的時間不合理，致使外植體表面帶有大量的菌，進(jìn)而導(dǎo)致外植體脫毒困難。

3、滅菌不徹底

3、注意事項

1）整個實驗過程要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；

2）倒培養(yǎng)基時要邊用玻璃棒攪拌，邊倒培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基的濃度不均勻；

實驗五玉米、花生成熟胚的培養(yǎng)

1、實驗材料與方法：

1.1實驗材料：

1）、玉米、花生成熟種子

2）、培養(yǎng)基MS+30g/L白糖+8.5g/L卡拉膠PH=5.8

1.2方法

均設(shè)置三組對比：①不做任何處理，直接接種。各1瓶

②取成熟玉米和花生粒（15粒左右），直接置于0.1%升汞溶液中消毒10-20min左右，期間注意不斷搖動，取出置于無菌水中清洗后切開，取帶胚的一半進(jìn)行培養(yǎng)。各1瓶

③消毒方法同上，用無菌水沖洗后小心剝離出胚單獨培養(yǎng)。各2瓶

1.2.3培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d，每個星期觀察一次。

2、實驗結(jié)果與分析

一周后觀察。

玉米：接種了4瓶培養(yǎng)基。①已經(jīng)污染②長勢良好，無污染③長勢健壯

花生：接種了4瓶培養(yǎng)基。①污染嚴(yán)重②無污染，長勢較好③有一瓶被污染，另一瓶長勢良好分析：如果對花生玉米不作處理，極易被污染。

單獨分離出胚的長勢更好一些

3、注意事項

1）整個實驗過程要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；

2）倒培養(yǎng)基時要邊用玻璃棒攪拌，邊倒培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基的濃度不均勻；

3）觀察記錄時，要注意拿組培瓶的方式，手要握住組培瓶的下方而不要握住組培瓶的蓋子；

4）發(fā)現(xiàn)污染的外植體，要及時清理干凈，以免污染其他的。

實驗六、柱花草葉片組織培養(yǎng)

1、材料和方法:

1.1材料

(6)1）、柱花草葉片、無菌紙、鑷子、酒精燈等

2）、MS為基本培養(yǎng)基

3）、誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+BA4mg/L+NAA1.0mg/ml

1.2方法

1.2.1外植體消毒

將柱花草葉片洗凈，然后將葉片放在牛皮紙上，用手術(shù)刀切取2cm長的片塊（10片左右），置于0.1%的升汞溶液中消毒10-15min，期間注意不斷搖動，取出葉片置于無菌水中清洗3次，留于最后清洗的無菌水中備用。

1.2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

將柱花草葉片取出放入超凈工作臺中無菌的牛皮紙上，然后將葉片兩端切去少許，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種4瓶，每7天觀察記錄一次。

1.2.3培養(yǎng)條件：

培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d，,每個星期觀察一次。

2、實驗結(jié)果與分析：

1）第一次對柱花草進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)時，污染率25%，誘導(dǎo)率為50%，污染率很高。原因可能是，用升汞消毒的時間過短，或者是升汞濃度較低，因此應(yīng)適當(dāng)延長消毒時間或適當(dāng)提高升汞的濃度或者嘗試別的消毒方法。

附錄1、柱花草誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果統(tǒng)計表

接種瓶數(shù)誘導(dǎo)數(shù)污染數(shù)誘導(dǎo)率污染率

42150%25%

實驗結(jié)果結(jié)論：

由實驗結(jié)果與分析可知，柱花草葉片的組織培養(yǎng)污染率比較高，說明取材方法和消毒措施不佳，應(yīng)采用合理的消毒方法，以降低污染率。

3、注意事項

1）整個實驗過程要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；

2）倒培養(yǎng)基時要邊用玻璃棒攪拌，邊倒培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基的濃度不均勻；

3）觀察記錄時，要注意拿組培瓶的方式，手要握住組培瓶的下方而不要握住組培瓶的蓋子；

4）發(fā)現(xiàn)污染的外植體，要及時清理干凈，以免污染其他的；

5）觀察記錄時要仔細(xì)，認(rèn)真描述并做好記錄。

實驗七、水稻盾片的組織培養(yǎng)

前言：水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有40%的世界人口以稻米為主食，因此，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻品種一直是世界范圍的重要研究課題。水稻的花藥培養(yǎng)使人們得到了純合二倍體植株，大大縮短了水稻的雜交育種年限。提高選擇效率。由于水稻盾片取材方便，在實際的研究工作中作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體材料來源應(yīng)用越來越廣泛。

1、實驗材料與方法：

1.1實驗材料：

(7)1）、水稻干燥成熟種子、無菌紙、鑷子、酒精燈等

2）、水稻發(fā)芽培養(yǎng)基MS

3）、誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS＋2，4-D2.5mg／L＋＋30g／L白糖+8.5g／L卡拉膠

1.2方法

1.2.1外植體的消毒：

取水稻種子20-30粒，在室溫下直接浸于0.1%升汞溶液中消毒20min左右，其間注意不斷搖動，取出種子置于無菌水中清洗3次。

1.2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

①將消毒好的水稻種子取出，接入發(fā)芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)（共接4瓶）。

②一周后，取已發(fā)芽的水稻種子，切除芽不要，將種子直接接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.3培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d，每個星期觀察一次。

2、實驗結(jié)果與分析

①用MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)水稻種子發(fā)芽，接種的4瓶培養(yǎng)基均長出小苗，未污染。發(fā)芽率100%

②第二次誘導(dǎo)培養(yǎng)的4瓶，有三瓶長勢良好，一瓶已被污染。

可能原因：操作過程不規(guī)范，導(dǎo)致染菌

3、注意事項

1）整個實驗過程要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；

2）倒培養(yǎng)基時要邊用玻璃棒攪拌，邊倒培養(yǎng)基，防止培養(yǎng)基的濃度不均勻。

自

選

實

驗

開

題

報

告

實驗題目：

班級：

姓名：

學(xué)號：

指導(dǎo)老師：

洋蔥的組織培養(yǎng)

選題依據(jù)及意義：洋蔥是百合科蔥屬植物，以肉質(zhì)鱗片和鱗芽構(gòu)成產(chǎn)品器官的二年生草本植物,

營養(yǎng)豐富,而且具有殺菌、降脂、降壓、抗哮喘等多種保健功能,深受人們喜愛,起源于中亞地區(qū),歷史悠久,分布廣泛,是世界第四大蔬菜作物。由于洋蔥兩年生,異花受粉,異質(zhì)性強,必須保持高度雜合,自交兩三代就失去育性。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雄性不育系,但通過分子生物學(xué)的方法可以得到性狀更優(yōu)良的品種,通過組織培養(yǎng)建立植株再生體系是轉(zhuǎn)基因的必要手段,各國學(xué)者對此做了大量的工作,近幾十年來成果主要集中于以下幾個方面:1研究進(jìn)展1.1器官發(fā)生型自1997年Dunstan首次由洋蔥獲得離體植株后,各國學(xué)者相繼作了成功的報道。1980年Hussey首次把雙鱗片作為外植體誘導(dǎo)得到芽,又以得到的芽縱切后為二代外植體,得到離體植株。Kahane(1992a)報道以鱗莖盤為外植體,經(jīng)芽擴繁,植株個體化,生根馴化得到再生植株,三個步驟為一個周期,約3～4個月,擴繁系數(shù)為10,大大縮短了再生時間并部分解決取材的季節(jié)性限制。接著Yassen(1993)報道以未成熟的花作試材,直接形成小鱗莖,有效地避免和減少了繼代培養(yǎng)的次數(shù),同樣繁殖系數(shù)約為10。將收獲的新鮮洋蔥球冷藏，然后剝除外皮至直徑為2-3cm，然后對它進(jìn)行消毒處理；然后在無菌條件下將消毒處理后的洋蔥球切除成外植體，然后將外植體接種到洋蔥增殖培養(yǎng)基；經(jīng)過培養(yǎng)，獲得已長出若干個側(cè)芽的無菌材料；其后每20-30天就可擴繁一次；將擴繁得到的洋蔥單株壯苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得成活洋蔥苗。

材料與方法：

1.材料

1）洋蔥、無菌紙、鑷子、酒精燈等

2）采用MS為基本培養(yǎng)基

3）誘導(dǎo)培養(yǎng)基：、MS+BA0.5mg/L+2,4-D2mg/L＋30g／L白糖+8.5g／L卡拉膠

2.方法

2.1外植體消毒方法

①洋蔥用流水沖洗5h后，剝?nèi)ネ馄ぶ林睆綖?-3cm

②于超凈工作臺上先用70％酒精浸泡30s、0.1％的升汞中消毒7min，然后用無菌水沖洗5次．最后將消毒好的材料置于無菌濾紙上吸干水分。

2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

將經(jīng)消毒的洋蔥鱗莖尖接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，共接5瓶，每7天觀察記錄一次。

2.3培養(yǎng)條件：

培養(yǎng)溫度為28（-1、+1）℃，光照強度2000—3000LX，光照時間為12h/d，每個星期觀察一次。

仙人掌的組織培養(yǎng)

選題依據(jù)及意義：仙人掌類植物原產(chǎn)南北美洲熱帶、亞熱帶大陸及附近一些島嶼，部分生長在森

林中。多漿植物的多數(shù)種類原產(chǎn)南非，僅少數(shù)分布于其它各洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)。目前仙人掌科的植物將近有2000種，其中大多數(shù)有良好的食用和藥用價值，在食用和醫(yī)療方面有著廣闊的應(yīng)用前景及巨大的開發(fā)潛力。仙人掌科植物最早在歐洲一些發(fā)達(dá)國家開始栽培和研究．目前已經(jīng)進(jìn)入工廠化種植，且組培苗在交易中占有一定比例。

國內(nèi)外研究趨勢及發(fā)展?fàn)顩r：我國近年引進(jìn)的仙人掌科植物逐漸增多。但對仙人掌植物的研

究和應(yīng)用仍處于起步階段。仙人掌科植物的繁殖方法主要以傳統(tǒng)的扦插為主。繁殖一般較容易，但由于生長緩慢、繁殖系數(shù)低，多數(shù)名貴種類繁殖困難，尤其對斑錦變異和畸形變異品種的性狀保持較難，大大影響了該類植物的擴大栽培。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以大幅提高繁殖系數(shù)，保持品種性狀．?dāng)U大突變品種、新特品種和珍稀品種的繁殖．降低栽培成本。

材料與方法：

2.材料

1）仙人掌嫩莖、無菌紙、鑷子、酒精燈等

2）MS培養(yǎng)基

3）誘導(dǎo)培養(yǎng)基：、MS+BA2．0mg／L+NAAO．2mg／L

4）增殖培養(yǎng)基：MS+BA0．5mg／L+NAA0．2mg／L

5）生根培養(yǎng)基：1／2MS+IBA0．5mg／L

2.方法

2.1外植體消毒方法

嫩莖用流水沖洗5h后，于超凈工作臺上先用70％酒精浸泡30s、0.1％的升汞中消毒7min，然后用無菌水沖洗5次．最后將消毒好的材料置于無菌濾紙上吸干水分。

2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

將經(jīng)消毒的嫩莖切割成外表面0．6cm長，0.6cm寬帶刺座的接種塊。接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，共接10瓶，每7天觀察記錄一次。

自選實驗：洋蔥、仙人掌的組織培養(yǎng)

前言：①洋蔥是百合科蔥屬植物，以肉質(zhì)鱗片和鱗芽構(gòu)成產(chǎn)品器官的二年生草本植物，異花受粉,異質(zhì)性強,必須保持高度雜合,自交兩三代就失去育性將收獲的新鮮洋蔥球冷藏，然后剝除外皮至直徑為2-3cm，然后對它進(jìn)行消毒處理；然后在無菌條件下將消毒處理后的洋蔥球切除成