微生物的保藏技術(shù)

微生物的保藏方法

主要內(nèi)容常用的保藏方法1保藏原理2注意事項(xiàng)3菌種保藏的原因通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時(shí)間內(nèi)不死亡，不會被其他微生物污染，不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進(jìn)行。菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。菌種保藏原理根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。美國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心ATCC是美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。ATCC的成立可追溯到1925年，一個(gè)科學(xué)委員會認(rèn)識到科學(xué)研究對于微生物的大量需求而萌發(fā)了創(chuàng)建一個(gè)微生物相關(guān)制品供應(yīng)中心的想法。ATCC以生命科學(xué)領(lǐng)域全方位知識的獲取，分類，匯總，完善進(jìn)而廣泛傳播為己任，以期為推動生物原料，生物信息，生物技術(shù)，知識產(chǎn)權(quán)，規(guī)范等相關(guān)領(lǐng)域的前沿性、合法化、實(shí)用性發(fā)揮一定的作用。ATCC擁有目前世界上最大的、品種最豐富的微生物、細(xì)胞系以及重組DNA原料，同時(shí)它也是科研工作者公認(rèn)的提供世界級的可靠的研究材料的供應(yīng)商。美國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心

美國典型微生物菌種保藏中心,AmericanTypeCultureCollection(ATCC)

ATCC主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類學(xué)、食品科學(xué)等的研究。

該中心保藏有藻類111株，細(xì)菌和抗生素16865株，細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動物1800株，動物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務(wù)。該中心保藏的菌種可出售。

中國菌種保藏管理中心中國菌保會是國際認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)，下設(shè)7個(gè)全國性菌種保藏管理中心：（1）普通微生物菌種保藏管理中心；（2）農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；（3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；（4）醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；（5）抗生素菌種保藏管理中心；（6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；（7）林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。（1984年增加）

中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心我國唯一的國家級工業(yè)微生物菌種資源保藏管理中心，中國微生物菌種保藏管理委員會和國際菌種保藏聯(lián)合會成員之一，隸屬于中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，專業(yè)從事工業(yè)微生物菌種資源保藏管理的公益基礎(chǔ)性資源保藏機(jī)構(gòu)，負(fù)責(zé)全國工業(yè)生產(chǎn)與研究應(yīng)用微生物菌種資源的收集、整理、鑒定、保藏、供應(yīng)與國際交流。中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）保藏各種工業(yè)微生物菌種資源包括：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個(gè)屬251種，近3000株，庫藏備份80000余支。中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心AgriculturalCultureCollectionofChin（ACCC）

ACCC是中國國家級農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理專門機(jī)構(gòu),負(fù)責(zé)全國農(nóng)業(yè)微生物菌種的收集、鑒定、評價(jià)、保藏、供應(yīng)及國際交流任務(wù).庫藏菌種2490株,其中細(xì)菌1004株,放線菌69株,絲狀真菌355株,酵母菌124株,食用菌582.

中國標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心成立（英文縮寫：CGMCC，設(shè)立在中國科學(xué)院微生物研究所）1985年，開始用于專利程序的微生物保存1995年，獲得布達(dá)佩斯條約國際保藏中心（IDA）的資格1995年，加入中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會宗旨和任務(wù)。作為一個(gè)非贏利性、公益性、服務(wù)性技術(shù)支撐機(jī)構(gòu)，CGMCC的宗旨是廣泛收集國內(nèi)外的微生物資源，妥善保存，以公開的保藏機(jī)構(gòu)的名義為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護(hù)、科研教育提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料,在保證生物安全和保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的前提下，為第三者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務(wù)，最大限度的實(shí)現(xiàn)微生物資源的保護(hù)、共享和持續(xù)利用。德國與韓國國標(biāo)準(zhǔn)生物物保藏中心心德國微生物物菌物保藏藏中心(DSMZ)，保藏有9400種細(xì)菌、2400種真菌、500種酵母菌、、300種質(zhì)粒、500種動物細(xì)胞胞、500種植物細(xì)胞胞、170種動物雜腫腫瘤、600種植物病毒毒、90種細(xì)菌病毒毒等（德文文，英文））。韓國國家農(nóng)農(nóng)業(yè)生物技技術(shù)研究所所——農(nóng)業(yè)微生物物菌種保藏藏（KACC），保藏有有細(xì)菌890種、真菌1581種、酵母菌菌62種、cDNA600種（英文））。法國標(biāo)準(zhǔn)生生物保藏中中心法國國家歷歷史自然博博物館——Algothequedu實(shí)驗(yàn)室菌種種保藏中心心AlgothequeduLaboratoiredeCryptogamie,MuseumNationald'HistoireNaturelle（ALCP）ALCP隸屬于法國國國家歷史史自然博物物館，主要要從事于工工業(yè)微生物物學(xué)，應(yīng)用用微生物學(xué)學(xué)，微生物物系統(tǒng)分類類學(xué)，培養(yǎng)養(yǎng)和保藏方方法等方面面的研究，，以及藻類類等微生物物的分離，，鑒定，保保藏工作。。保藏有藻藻類600種、細(xì)菌200種。該中心心保藏的菌菌種可出售售。各國標(biāo)準(zhǔn)生生物保藏中中心法國巴斯德德研究所L'InstitutPasteur菌物保藏中中心CollectiondeL'InstitutPasteurOfInstitutPasteur(CIP)加拿大國家家微生物健健康實(shí)驗(yàn)室室微生物菌菌種保藏中中心NationalMicrobiologyLaboratoryHealthCanadaCultureCollections（NML-HCCC）日本生物技技術(shù)研究所所微生物菌菌種保藏中中心MarineBiotechnologyInstituteCultureCollection,MarineBiotechnologyInstituten(MBIC)傳代培培養(yǎng)保保藏一、傳傳代培培養(yǎng)保保藏原理1優(yōu)缺點(diǎn)2注意事項(xiàng)3傳代培培養(yǎng)的的原理理有些微微生物物當(dāng)遇遇到冷冷凍或或干燥燥等處處理時(shí)時(shí)，會會很快快死亡亡，因因此在在這種種情況況下，，只能能求助助于傳傳代培培養(yǎng)保保存法法。傳傳代培培養(yǎng)就就是要要定期期地進(jìn)進(jìn)行菌菌種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)接、、培養(yǎng)養(yǎng)后再再保存存，它它是最最基本本的微微生物物保存存法，，例如如酸奶奶等常常用生生產(chǎn)菌菌種的的保存存。傳代培培養(yǎng)優(yōu)優(yōu)缺點(diǎn)點(diǎn)傳代培培養(yǎng)保保存法法雖然然簡便便，但但其缺缺點(diǎn)也也很明明顯，，如：：①菌菌種管管棉塞塞經(jīng)常常容易易發(fā)霉霉；②②菌株株的遺遺傳性性狀容容易發(fā)發(fā)生變變異；；③反反復(fù)傳傳代時(shí)時(shí)，菌菌株的的病原原性、、形成成生理理活性性物質(zhì)質(zhì)的能能力以以及形形成孢孢子的的能力力等均均有降降低；；④需需要定定期轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)種，，工作作量大大；⑤⑤雜菌菌的污污染機(jī)機(jī)會較較多。。傳代培培養(yǎng)的的注意意事項(xiàng)項(xiàng)傳代保保存時(shí)時(shí)，培培養(yǎng)基基的濃濃度不不宜過過高，，營養(yǎng)養(yǎng)成分分不宜宜過于于豐富富，尤尤其是是碳水水化合合物的的濃度度應(yīng)在在可能能的范范圍內(nèi)內(nèi)盡量量降低低。培培養(yǎng)溫溫度通通常以以稍低低于最最適生生長溫溫度為為好。。若為為產(chǎn)酸酸菌種種，則則應(yīng)在在培養(yǎng)養(yǎng)基中中添加加少量量碳酸酸鈣。。一般地地，大大多數(shù)數(shù)菌種種的保保藏溫溫度以以5℃為好，，像厭厭氧菌菌、霍霍亂弧弧菌及及部分分病原原真菌菌等微微生物物菌種種則可可以使使用37℃℃進(jìn)行保保存，，而蕈蕈類等等大型型食用用菌的的菌種種則可可以室室溫直直接保保存。。二、冷冷凍保保藏原原理適用于于抗凍凍力強(qiáng)強(qiáng)的微微生物物。這這些微微生物物可在在其菌菌體細(xì)細(xì)胞外外遭受受凍結(jié)結(jié)的情情況下下而不不受損損傷，，而對對其它它大多多數(shù)微微生物物而言言，無無論在在細(xì)胞胞外凍凍結(jié)還還是在在細(xì)胞胞內(nèi)凍凍結(jié)，，都會會對菌菌體造造成損損傷，，使其其代謝謝作用用停止止，可可達(dá)到到保藏藏的目目的。。常用的的冷凍凍保藏藏法液氮保藏法1低溫冰箱保存法2干冰保存法3液氮保保存法法一、適適用范范圍液氮溫溫度在在-196以下下,用用于快快速制制冷,速凍凍,機(jī)機(jī)械安安裝等等,一一般不不用于于日常常生活活,此此法除除適宜宜于一一般微微生物物的保保藏外外，對對一些些用冷冷凍干干燥法法都難難以保保存的的微生生物如如支原原體、、衣原原體、、氫細(xì)細(xì)菌、、難以以形成成孢子子的霉霉菌、、噬菌菌體及及動物物細(xì)胞胞均可可長期期保藏藏，而而且性性狀不不變異異。缺缺點(diǎn)是是需要要特殊殊設(shè)備備。二、保保藏方方法a、裝裝安瓶管：使使用盡盡量濃濃厚的的菌體體懸浮浮于含含有適適當(dāng)防防凍劑劑（保保存霉霉菌不不用防防凍劑劑）的的滅菌菌溶液液中，，將0.2～1ml的這這種溶溶液分分裝于于安瓶瓶中，，或在在裝有有分散散劑的的安瓶瓶中直直接接接種，，或?qū)⒕z絲體瓊瓊脂塊塊直接接懸浮浮于分分散劑劑中。。b、熔熔封安安瓶管管：若若直接接貯存存于氣氣相液液氮中中（－－150℃℃～－－170℃℃）時(shí)時(shí)，則則不需需熔封封。c、檢查查安瓶瓶管是是否熔熔封良良好：：即在在4℃下，將將熔封封安瓶瓶管在在適當(dāng)當(dāng)?shù)纳厝苋芤褐兄薪菖?～30分鐘后后，觀觀察有有無色色素進(jìn)進(jìn)入安安瓶。。d、緩慢慢冷卻卻：將將熔封封安瓶瓶管置置于小小罐中中，然然后用用液氮氮?dú)庖砸约s1℃/min的速度度冷卻卻至－－25℃℃左右，，也可可在－－20℃℃～－25℃℃的冰箱箱內(nèi)緩緩慢冷冷卻30～60min。e、速冷冷：最最后浸浸入液液氮中中快速速冷卻卻至－－196℃℃。這種種方方法法適適用用范范圍圍廣廣，，而而且且是是目目前前常常用用的的較較理理想想的的，，繁繁而而高高效效。。保保藏藏期期2~3年年，，甚甚至至長長達(dá)達(dá)9年年。。低溫溫冰冰箱箱保保存存法法一、、適適用用范范圍圍－20℃℃、、－－50℃℃或或－－85℃℃二、、保保藏藏方方法法低溫溫冷冷凍凍保保存存時(shí)時(shí)使使用用螺螺旋旋口口試試管管較較為為方方便便，，也也可可在在棉棉塞塞試試管管外外包包裹裹塑塑料料薄薄膜膜。。保保存存時(shí)時(shí)菌菌液液加加量量不不宜宜過過多多，，有有些些可可添添加加保保護(hù)護(hù)劑劑。。此此外外，，也也可可用用φ5mm的玻玻璃璃珠珠來來吸吸附附菌菌液液，，然然后后把把玻玻璃璃珠珠置置于于塑塑料料容容器器內(nèi)內(nèi)，，再再放放入入低低溫溫冰冰箱箱內(nèi)內(nèi)進(jìn)進(jìn)行行保保存存的的。。干冰保保存法法一、適適用范范圍－70℃左左右二、保保藏方方法將菌種種管插插入干干冰內(nèi)內(nèi)，再再置于于冰箱箱內(nèi)進(jìn)進(jìn)行冷冷凍保保存。。菌種保保藏的的共同同注意意點(diǎn)：：1、嚴(yán)格格的無無菌操操作；；2、用于于保存存的微微生物物在生生長前前必須須處于于它生生長良良好的的狀態(tài)態(tài)；3、保藏藏過程程中要要防止止退化化的發(fā)發(fā)生（（不同同的保保藏方方法，，分別別有不不同的的保存存時(shí)間間。））注意事事項(xiàng)①要選選擇適適于冷冷凍干干燥的的菌齡齡細(xì)胞胞；②要選選擇適適宜的的培養(yǎng)養(yǎng)基，，因?yàn)闉槟承┬┪⑸飳鋬鰞龅牡值挚沽αΓ３ｋS培培養(yǎng)基基成分分的變變化而而顯示示出巨巨大差差異；；③要選選擇合合適的的菌液液濃度度，通通常菌菌液濃濃度越越高，，生存存率越越高，，保存存期也也越長長；④最好好在菌菌液內(nèi)內(nèi)不添添加電電解質(zhì)質(zhì)（如如食鹽鹽等））；⑤可在在菌液液內(nèi)添添加甘甘油（（甘油油管冷冷凍保保藏法法）等等保護(hù)護(hù)劑，，以防防止在在冷凍凍過程程中出出現(xiàn)菌菌體大大量死死亡的的現(xiàn)象象。同同樣，，也可可添加加各種種糖類類、去去纖維維血液液和脫脫脂牛牛乳等等具有有良好好保護(hù)護(hù)效果果的溶溶劑，，但對對有些些微生生物而而言，，不加加保護(hù)護(hù)劑時(shí)時(shí)更有有效。。⑥原則上應(yīng)應(yīng)盡快進(jìn)行行冷凍處理理，但當(dāng)加加入保護(hù)劑劑時(shí)，可靜靜置一段時(shí)時(shí)間后再進(jìn)進(jìn)行處理。。⑦就動物細(xì)細(xì)胞而言，，應(yīng)在－20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度度緩慢降溫溫，此后必必須盡快降降到貯藏溫溫度；而對對絕大多數(shù)微生物而而言，則不不必如此，，如結(jié)構(gòu)較較為復(fù)雜的的原蟲則可可在－35℃范圍內(nèi)進(jìn)行行緩慢降溫溫，而噬菌菌體則必需需采用上述述的二階段段法進(jìn)行冷冷凍；⑧若進(jìn)行長長期保存，，則貯藏溫溫度越低越越好；⑨取用冷凍凍保存的菌菌種時(shí)，應(yīng)應(yīng)采取速融融措施，即即在35～40℃溫水中輕輕輕振蕩使之之迅速融解解。而就厭厭氧菌來說說，則應(yīng)選選擇靜置融融化的措施施。當(dāng)冷凍凍菌融化后后，應(yīng)盡量量避免再次次冷凍，否否則菌體的的存活率將將顯著下降降?？傊?，首先先保持原菌菌優(yōu)良性狀狀長期穩(wěn)定定，同時(shí)考考慮方法的的通用性、、操作的簡簡便性和設(shè)設(shè)備的普及及性。三、干燥保保藏法1、沙土管保保存2、冷凍真空保保藏沙土管保存存1、主要用于于能形成孢孢子或孢囊囊的微生物物菌種的保保藏，如：：芽孢桿菌菌、放線菌菌等。2、方法：將將菌種接種種斜面，培培養(yǎng)至長出出大量的孢孢子后，洗洗下孢子制制備孢子懸懸液，加入入無菌的沙沙土管中，，減壓干燥燥，直至將將水分抽干干，最后用用石蠟、膠膠塞等封閉閉管口，置置冰箱保存存。沙土管保藏藏：用棉塞塞塞住安瓿瓿管，放在在能夠抽真真空的干燥燥器中，然然抽干后將將真空干燥燥器的旋塞塞關(guān)閉即可可。不用火火焰封口，，用時(shí)將真真空干燥器器放氣打開開取出，剩剩余的繼續(xù)續(xù)抽真空，，抽至真空空后關(guān)閉旋旋塞保藏即即可。此法簡單易易行，并可可以將微生生物保藏較較長時(shí)間，，適合一般般實(shí)驗(yàn)室及及以放線菌菌等為菌種種的發(fā)酵工工廠采用。。冰凍真空保保藏原理是首先先將加有保保護(hù)劑的細(xì)細(xì)胞樣品先先預(yù)冷，使使其凍結(jié)，，然后在減減壓下利用用升華現(xiàn)象象除去水分分。事實(shí)上上，從菌體體中除去大大部分水分分后，細(xì)胞胞的生理活活動就會停停止，因此此可以達(dá)到到長期維持持生命狀態(tài)態(tài)的目的。。該方法適適用于絕大大多數(shù)微生生物菌種（（包括噬菌菌體和立克克次氏體等等）的保存存。達(dá)到干燥的的樣品可在在真空或惰惰性氣體的的密閉環(huán)境境中置低溫溫保存，從從而使微生生物處于干干燥、缺氧氧及低溫的的狀態(tài)，生生命活動處處于休眠，，可以達(dá)到到長期保藏藏的目的。。用冰升華的的方式除去去水分，手手段比較溫溫和，細(xì)胞胞受損傷的的程度相對對較小，存存活率及保保藏效果均均不錯(cuò)，而而且經(jīng)抽真真空封閉的的菌種安瓿瓿瓶的保存存、郵寄、、使用均很很方便。因因此冷凍真真空干燥保保藏是目前前使用最普普遍、最重重要的微生生物保藏方方法。注意事項(xiàng)a、冷凍干燥燥前的培養(yǎng)養(yǎng)條件：首首先檢驗(yàn)菌菌種純度。。一般地說說，將待