淀粉脫分支酶（DBE）活性檢測試劑盒說明書-微量法UPLC-MS-4176

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微量法UPLC-MS-4176100T/48S試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體100mL×1瓶2-8℃保存試劑一液體8mL×1瓶2-8℃保存試劑二粉劑×2支2-8℃保存試劑三液體5mL×1瓶2-8℃保存試劑四液體18mL×1瓶2-8℃保存標準品粉劑×1支2-8℃保存溶液的配制：1、試劑二：臨用前取1支加入1.5mL試劑一，充分溶解后待用，用不完的試劑2-8℃保存4周；210mg1mL10mg/mL2-8℃（starchdebranchingα-1,6-DBE催化支鏈淀粉產(chǎn)生還原糖，其與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成棕紅色物質(zhì)，通過測定其在540nm下吸光值變化可計算得DBE活性。Amylopectin

DBE

ReducingSugarReducingSugar+3,5-DinitrosalicylicAcid 3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測?？梢姺止夤舛扔?酶標儀、臺式低溫離心機、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）1（g）（mL）15~10（0.1g1mL提取液15000g，4℃10min2（104個500~1000︰1500萬個1L（0w37315000g，4℃10min）3、液體：直接檢測。二、測定步驟1、分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。210mg/mL、0.2、0.1mg/mL序號稀釋前濃度（mg/mL）標準液體積（μL）蒸餾水體積（μL）稀釋后濃度（mg/mL）110100900121160400.831120800.641801200.451401600.261201800.1實驗中每個標準管需40μL標準溶液。3、取100L5（80054、操作表(在0.5mL或1.5mL離心管中)：試劑名稱（μL）對照管測定管標準管空白管煮沸樣本40樣本-40--標準溶液--40-蒸餾水40試劑一40-4040試劑二-40--混勻，37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱中準確反應(yīng)2h試劑三40404040試劑四1201201201205（54nm處吸光值A(chǔ)AAAAΔA=A-AΔA=A-A1-2次。2h三、DBE活性計算1、標準曲線的繪制：以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔAyy=kx+b，將ΔA帶（gL2、DBE活性的計算：酶活定義：每毫克蛋白每小時分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個酶活力單位。DBE酶活（U/mgprot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=0.5x×Cpr酶活定義：每克樣本每小時分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個酶活力單位。DBE酶活（U/g質(zhì)量）=x×V提取÷W÷T=0.5x÷W酶活定義：每104個細胞每小時分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個酶活力單位。DBE酶活（U/104cell）=x×V提取÷細胞數(shù)量（萬個）÷T=0.5x÷細胞數(shù)量（萬個）酶活定義：每mL樣本每小時分解支鏈淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為1個酶活力單位