F肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的相互作用研究

F肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的相互作用研究【內(nèi)容摘要】細(xì)胞膜的內(nèi)膜含有大量的負(fù)電荷磷脂，研究f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂的互相作用將有助于更深切進(jìn)入地了解細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜的體內(nèi)互相作用機(jī)制。在金片和金電極上分別構(gòu)建了負(fù)電荷磷脂的雜化雙層磷脂膜，通過外表等離子體共振方法(spr)和電化學(xué)阻抗技術(shù)研究了f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的互相作用。結(jié)果表示清楚，f肌動蛋白能夠在沒有中間聯(lián)絡(luò)蛋白的情況下，直接與負(fù)電荷磷脂膜發(fā)生互相作用。鈣離子能夠有效地促進(jìn)它們的互相作用，表示清楚鈣離子在其中發(fā)揮了主要作用。高濃度的kcl顯著抑制它們的互相作用，表示清楚這種互相作用重要受靜電作用影響。實驗結(jié)果進(jìn)一步證明在f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜互相作用時，除了能夠通過其它蛋鶴發(fā)生間接互相作用外，還能夠與磷脂膜發(fā)生直接的互相作用?！颈疚年P(guān)鍵詞語】肌動蛋白負(fù)電荷磷脂膜外表等離子體共振電化學(xué)阻抗1引言肌動蛋白是一種在細(xì)胞中廣泛存在的細(xì)胞骨架蛋白，參與例如細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂、吞噬作用、細(xì)胞黏附和形態(tài)發(fā)生等細(xì)胞經(jīng)過[1]。以單體形式存在的肌動蛋白稱為g肌動蛋白。在二價陽離子如ca2+、mg2+等存在的條件下，肌動蛋白單體在濃度高于某一關(guān)鍵濃度時會多聚化成為纖維狀分子，稱為f肌動蛋白[2]。肌動蛋白一般以其多聚化的形式發(fā)揮功能。在多聚化經(jīng)過中，結(jié)合的atp分子水解為adp[3]。f肌動蛋白必需錨定到細(xì)胞膜上能力發(fā)揮它的功能。事實上，細(xì)胞骨架蛋白，包含f肌動蛋白、中間纖維、微管及相關(guān)蛋白都必需以一定方式錨定到漿膜上來發(fā)揮功能[4]。一般以為f肌動蛋白通過膜蛋白復(fù)合物連接到細(xì)胞膜上，包含膜橋蛋白[5]、肌漿球蛋白i[6]、富組親動蛋白[7]、血影蛋白[8]等等。，有研究指出，肌動蛋白可以以在沒有中間聯(lián)絡(luò)蛋白的情況下直接與膜磷脂發(fā)生互相作用[1]，其作用機(jī)制可能包含靜電互相作用。然而，多數(shù)研究中采取的磷脂為帶正電荷的磷脂或中性磷脂，f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂的互相作用很少有人報道。眾所周知，細(xì)胞膜的內(nèi)膜含有大量的負(fù)電荷磷脂，因而研究f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂的互相作用將有助于更深切進(jìn)入地了解細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜的體內(nèi)作用機(jī)制。外表等離子體共振〔spr〕已經(jīng)被廣泛用來研究生物分子互相作用，包含dna蛋白、抗原抗體、酶底物、受體配體等[9，１０]。電化學(xué)阻抗也是一種外表敏感的技術(shù)，因其簡單性及高的靈敏性，已經(jīng)被廣泛用來研究生物分子的互相作用[1１]。本研究在spr金基底上和金電極上分別構(gòu)建了負(fù)電荷磷脂的雜化雙層膜〔hbm〕，并通過spr和電化學(xué)阻抗方法研究了f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的互相作用。2實驗部分2.1儀器與試劑spr實驗采取autolabspr系統(tǒng)(ecochemiebv,荷蘭)，金片在使用前于新制的piranha洗液(75％h2so4/25％h202)中浸泡2min，然后用蒸餾水和乙醇依次洗滌。金片通過折射率匹配液固定在半圓棱鏡上，再將spr檢測池安裝在金片上。spr數(shù)據(jù)的記錄頻率為0.5hz。電化學(xué)實驗在autolabpgstat30電化學(xué)分析系統(tǒng)上進(jìn)行(ecochemieb.v.荷蘭)，循環(huán)伏安測定控制軟件為gpes4.9。電化學(xué)阻抗測定控制軟件為frasoftware4.9。采取傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，金電極作為工作電極，ag/agcl(飽和kcl)電極作為參比電極，大的鉑片作為對電極。5mmol/lk4[fe(cn)6]/k3[fe(cn)6]溶于２mmol/ltrishcl溶液中(含0.1mol/lkcl,ph7.4)作為氧化復(fù)原探針。阻抗記錄頻率為0.1～100000hz，擾動幅度為5mv。肌動蛋白(牛的肌肉組織)購自sigma公司，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化，所得蛋白為單體形式，溶于低離子強(qiáng)度的緩沖液中：2mmol/ltrishcl,0.2mmol/latp，ph7.4(g緩沖液)。肌動蛋白的多聚化在f緩沖液(2mmol/ltrishcl，ph7.4,0.2mmol/latp,不同濃度的cacl2和kcl)中完成，hexanethiol由acros公司購得。1,2dipalmitoylsnglycero3phosphorac(1glycerol)sodiumsalt(dppg)磷脂購自sigma公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。實驗用水是二次蒸餾水再經(jīng)美國milliq公司超純水處理系統(tǒng)處理得到的超純水。2.2脂質(zhì)體的制備脂質(zhì)體的制備參照文獻(xiàn)[12]：dppg磷脂溶于氯仿/甲醇(2/1)中，置于玻璃瓶中。溶劑用氮氣吹干，將樣品放在真空枯燥器中過夜，以除去殘留的氯仿。再用2mmol/ltrishcl(ph7.4，含0.1mol/lkcl)緩沖液將磷脂重懸，使其終濃度為0.5g/l,然后將磷脂的懸液在水浴中超聲至澄清(約2h)。2.3spr實驗自組裝hbm經(jīng)過及f肌動蛋白與hbm的互相作用通過spr系統(tǒng)實時監(jiān)測。每次打針前，spr檢測池用2mmol/ltrishcl(含0.1mol/lkcl,ph7.4)平衡大約10min，反應(yīng)完成后，再用同樣的緩沖液清洗。組裝烷基硫醇單層時，將1mmol/l的烷基硫醇的乙醇溶液注入spr檢測池中，至少組裝12h。用緩沖液沖刷后，將脂質(zhì)體打針入spr檢測池中。hbm的構(gòu)成經(jīng)過通過一系列spr角度變化曲線實時監(jiān)測。用緩沖液沖刷幾次spr檢測池，將f肌動蛋白注入spr檢測池中，記錄spr的時間曲線。2.4電化學(xué)實驗金電極首先在拋光布上用al2o3拋光粉(1,0.3,0.05μm)細(xì)心拋光，并用超純水清洗，然后在1mol/lh2so4中在－0.2～1.55v之間進(jìn)行循環(huán)電位掃描直至得到標(biāo)準(zhǔn)的金電極的氧化復(fù)原峰。金電極再經(jīng)大量水和乙醇沖刷，并用氮氣吹干。清洗后的金電極放置于1mmol/l烷基硫醇的乙醇溶液中12h進(jìn)行自組裝，然后用乙醇和水依次沖刷，除去非特異吸附的物質(zhì)。在電化學(xué)鑒定烷基硫醇的自組裝膜后，電極再放入脂質(zhì)體中進(jìn)行組裝。hbm構(gòu)成后，金電極再轉(zhuǎn)入到f肌動蛋白的溶液中。3結(jié)果與討論圖1裸金外表(a),烷基硫醇修飾的金外表(b)和磷脂膜修飾的金外表(c)的spr角度曲線〔略〕fig.1angleresolvedsurfaceplasmonresonance(spr)curvesforabareaufilm(a)andthesamesurfacemodifiedwithhexanethiol(b)andthencoatedwithlipidmembrane(c)3.1spr系統(tǒng)圖1顯示的是hbm構(gòu)成經(jīng)過的spr角度曲線。當(dāng)烷基硫醇的自組裝膜在金基底上構(gòu)成后，spr角向正方向遷移；當(dāng)脂質(zhì)體沉積在烷基硫醇上并構(gòu)成磷脂膜后，spr角進(jìn)一步向正方向遷移。在biacorespr儀器中，在傳感外表完全覆蓋一層磷脂酰膽堿(dppc)的單層膜時,能夠引起2200ru的信號響應(yīng)[13]，相當(dāng)于在傳感外表磷脂的外表濃度為2.2ng/mm2(0.92±0.05pg/(mmru)。在autolabspr儀器中，外表磷脂濃度變化1ng/mm2將會引起132毫度的spr角度變化。本實驗中，磷脂膜的構(gòu)成引起了320毫度的spr角度遷移，能夠推算出320毫度的spr角度遷移相當(dāng)于外表磷脂的濃度為2.4ng/mm2。使用的dppg磷脂的分子量與磷脂酰膽堿相近，因而外表磷脂濃度變化2.4ng/mm2相當(dāng)于在傳感外表上構(gòu)成了磷脂的單層膜。在ca2+存在的條件下，肌動蛋白單領(lǐng)會被激活。當(dāng)?shù)竭_(dá)臨界濃度時，肌動蛋白單領(lǐng)會發(fā)生多聚化。根據(jù)文獻(xiàn)報道，在本文采取的實驗條件下，臨界濃度為4.4mg/l[3]。本實驗中，所用的肌動蛋白的最低濃度為5mg/l，因而能夠確保所得到的激活后的樣品為f肌動蛋白。圖2為不同濃度的f肌動蛋白與dppg磷脂膜互相作用的實時傳感圖。從傳感圖上，能夠直接觀察到f肌動蛋白與磷脂膜的結(jié)合和解離。隨著f肌動蛋白濃度的增長(5,10,15,20和30mg/l)，spr角分別向正方向遷移了76.0,118.4,151.5,167.6,193．０毫度。結(jié)果表示清楚f肌動蛋白能夠在沒有中間聯(lián)絡(luò)蛋白的情況下，直接結(jié)合到負(fù)電荷的磷脂膜上，而且結(jié)合的數(shù)量與蛋白的濃度成正相關(guān)。3.2電化學(xué)阻抗表征電化學(xué)阻抗技術(shù)也被用來研究f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的互相作用。圖3顯示的是裸金電極(曲線a)、烷基硫醇修飾的金電極(曲線b)、磷脂膜修飾的金電極(曲線c)的阻抗圖。用改良的randle等效電路對阻抗結(jié)果進(jìn)行擬合(圖3內(nèi)插圖)。根據(jù)文獻(xiàn)[1４]，在烷基硫醇/磷脂膜系統(tǒng)中，磷脂層的特異性電容(cmpl)為得到雙層電容(cmbilayer)和硫醇自組裝層的電容(cmmonolayer)串聯(lián)計算得到。圖2不同濃度的f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜互相作用的實時傳感圖〔略〕fig.2representativeoverlaidsensorgramsillustratingtherealtimeinteractionoffactinatdifferentconcentrationswiththenegativelychargedlipidmembranef肌動蛋白濃度(concentrationoffactin)：a．5mg/l；b．10mg/l；c．15mg/l；d．20mg/l；e．30mg/l；f緩沖液構(gòu)成(thecompositionoffbuffer)：2mmol/ltrishcl(ph7.4),0.2mmol/ladenosinetriphosphate(atp),2mmol/lcacl2,0.1mol/lkcl。圖3復(fù)合阻抗圖。內(nèi)插圖為擬合阻抗數(shù)據(jù)用的平衡電路〔略〕fig．3complexplaneimpedanceplots.inset:equivalentcircuitmodelusedtofittheimpedancedataa．裸的金電極外表(baregoldelectrode)；b．烷基硫醇修飾的金電極外表(hexanethiolmodifiedelectrode)；c．磷脂膜修飾的金電極外表(1,2dipalmitoylsnglycero3phosphorac(1glycerol)sodiumsalt(dppg)coatedelectrode)。圖4復(fù)合阻抗圖〔略〕fig．4complexplaneimpedanceplotsa．磷脂膜修飾的金電極外表(dppgcoatedelectrode)；b．磷脂膜修飾的金電極浸入到不含f肌動蛋白的f緩沖液中(dppgcoatedelectrodeafterincubationinfbufferwithoutfactin)；c．磷脂膜修飾的金電極與10mg/lf肌動蛋白互相作用(dppgcoatedelectrodeafterinteractionwith10mg/lfactin)。f緩沖液構(gòu)成(thecompositionoffbuffer)：2mmol/ltrishcl(ph7.4),0.2mmol/latp,2mmol/lcacl2,0.1mol/lkcl。將磷脂膜作為平板電容器來處理，磷脂膜的電容和厚度的關(guān)系能夠表示為：cmpl=ε0к/d〔2〕其中ε0為真空介電常數(shù)(ε0=8.85×10－14f／cm),к為磷脂的介電常數(shù)(к=2.1)[1４]。通過計算，得到磷脂膜的厚度大約為3.32nm，而dppg單層膜的厚度為3.12nm[1５]，因而所構(gòu)成的膜為磷脂單層膜。這也表示清楚在金電極上成功構(gòu)建了硫醇/磷脂的雜化雙層膜。hbm修飾的金電極首先浸入到不含f肌動蛋白的f緩沖溶液(2mmol/ltrishcl,0.2mmol/latp,2mmol/lcacl2,0.1mol/lkcl,ph7.4)中約3h，如此圖4所示，磷脂膜的電子轉(zhuǎn)移阻抗rm值為192kω，略有下降(曲線b)，這重要是由于ca2+結(jié)合到了磷脂膜上的兩相鄰磷脂分子的極性頭部，進(jìn)而導(dǎo)致了磷脂分子的重排[1６]。當(dāng)此電極再浸入到10mg/lf肌動蛋白中0.5h后，rm值顯著增長，為282.6kω(曲線c)，表示清楚f肌動蛋白結(jié)合到了磷脂膜上，并產(chǎn)生了一個大的電子轉(zhuǎn)移阻抗阻礙了氧化復(fù)原探針到達(dá)電極外表。阻抗結(jié)果也證明了f肌動蛋白能夠直接和負(fù)電荷的磷脂膜互相作用。圖5顯示的是不同濃度的f肌動蛋白與磷脂膜互相作用后電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化值(δrm)。其中，δrm為不同濃度的f肌動蛋白與磷脂膜互相作用后的rm與磷脂膜在fbuffer中穩(wěn)定后的rm之差。δrm隨著f肌動蛋白濃度的增長而增長，表示清楚f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的互相作用與蛋白濃度有關(guān)。圖5不同濃度的f肌動蛋白與磷脂膜互相作用后電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化值〔略〕fig．5ｐlotoftheδrmvaluesvstheconcentrationsoffactin3.3ca2+與鹽濃度對f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜互相作用的影響已有許多文獻(xiàn)報道了f肌動蛋白與正電荷及中性磷脂膜互相作用，其互相作用力中都包括靜電作用。本實驗通過用spr技術(shù)研究ca2+與鹽濃度對f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜互相作用的影響，并對它們的互相作用力進(jìn)行了初步討論。ca2+在肌動蛋白磷脂復(fù)合物的構(gòu)成經(jīng)過中起側(cè)重要作用。ca2+對f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜互相作用的影響如此圖6所示。ca2+在樣品中的濃度越大，spr角度向正方向遷移的也越多，表示清楚ca2+能夠有效的促進(jìn)f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的互相作用。在高濃度的鹽溶液中，f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜互相作用遭到抑制。如此圖7所示，0.1mol/lkcl即可顯著抑制f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的結(jié)合。當(dāng)kcl濃度增高時，抑制造用愈加明顯。然而，在1mol/lkcl的溶液中，仍然有少量f肌動蛋白結(jié)合在負(fù)電荷的磷脂膜上。表示清楚靜電力在f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的互相作用中起著重要作用，磷脂的?；溑c肌動蛋白疏水區(qū)域的疏水力也起著一定作用。圖6ca2+對f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜互相作用的影響〔略〕fig．6effectofca2+ontheinteractionoffactinwiththenegativelychargedlipidmembranef肌動蛋白濃度(theconcentrationoffactin):5mg/l。f緩沖液構(gòu)成(thecompositionoffbuffer)：2mmol/ltrishcl(ph7.4)，0.2mmol/latp,0.1mol/lkcl,0～10mmol/lcacl2。圖7鹽濃度對f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的互相作用的影響〔略〕fig．7effectofthesaltconcentrationontheinteractionoffactinwiththenegativelychargedlipidmembranef肌動蛋白濃度(theconcentrationoffactin):5mg/l。f緩沖液構(gòu)成(thecompositionoffbuffer)：2mmol/ltrishcl(ph7.4),0.2mmol/latp,2mmol/lcacl2,0～1mol/lkcl。在ph7.4時，f肌動蛋白與dppg磷脂膜都帶負(fù)電荷，它們應(yīng)該是相互排擠的。然而，實驗中發(fā)現(xiàn)它們能夠發(fā)生直接互相作用，而且高濃度的kcl能夠顯著抑制這種互相作用。表示清楚雖然有其它作用力的存在，它們的互相作用重要受靜電作用控制。ca2+能夠有效地促進(jìn)f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂膜的互相作用,表示清楚ca2+在其中發(fā)揮了主要作用。文獻(xiàn)［１７］報道，二價陽離子如ca2+、mg2+等，能夠結(jié)合在負(fù)電荷磷脂的頭部區(qū)域，并中和磷脂所帶的電荷，進(jìn)而減弱f肌動蛋白與負(fù)電荷磷脂的排擠力。g肌動蛋白已被證明能夠直接結(jié)合在負(fù)電荷磷脂膜上(在ph7.0時，g肌動蛋白也是負(fù)電性的)，其作用機(jī)制重要源于g肌動蛋白中含有3個荷正電的氨基酸殘基(hisarglys)，通過靜電作用能夠吸附在負(fù)電荷磷脂膜上。而f肌動蛋白是由g肌動蛋白構(gòu)成的，因而f肌動蛋白可以能通過這種靜電作用結(jié)合在負(fù)電荷磷脂膜上。bihan等［１８］采取膜平衡技術(shù)研究了氣水界面上的肌動蛋白磷脂復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)f肌動蛋白通過一種典型的靜電作用方式與負(fù)電荷磷脂膜互相作用?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】1gicquaudc,wongp.biochem.j.,1994,303:769～7742schroeterm,chalovichjm.biochemistry,2004,43:13875～138823bouchardm,parec,dutastajp,chauvetjp,gicquaudc,augerm.biochemistry,1998,37:3149～31554niggliv.trendsinｂiochemicalｓcience,2001,26:604～6105wuestehubel,lunae.j．cell．biol．,1987,105:1741～17516korne