實(shí)驗(yàn)六 生物氧化與電子傳遞

實(shí)驗(yàn)六生物氧化與電子傳遞（3學(xué)時(shí)）一實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1.掌握電子在電子傳遞鏈中的傳遞過程；2.了解體外實(shí)驗(yàn)中研究電子傳遞鏈的方法。二實(shí)驗(yàn)原理生物氧化過程中代謝物脫下的氫由NAD+或FAD接受生成還原型NADH或FADH2，再經(jīng)一系列電子傳遞體傳遞，最后與氧結(jié)合生成水。這些存在于線粒體內(nèi)膜上的氧化還原酶及其輔酶依次排列，順序地起傳遞電子或電子和質(zhì)子的作用，稱為電子傳遞鏈或呼吸鏈。在體內(nèi)，代謝中間產(chǎn)物琥珀酸在線粒體琥珀酸脫氫酶（輔酶FAD）的作用下脫氫氧化生成延胡索酸，脫下的氫使FAD還原成FADH2，再經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，即FADH2→Q→細(xì)胞色素（b→c1→c→aa3），最后與氧結(jié)合生成水。在體外實(shí)驗(yàn)中，組織細(xì)胞生物氧化生成琥珀酸的量可采用在琥珀酸脫氫時(shí)伴有顏色變化的化合物作氫受體來研究。本實(shí)驗(yàn)以2，6-二氯酚錠酚（DPI）為氫受體，藍(lán)色的DPI從還原型黃素蛋白（FADH2）接受電子，生成無色的還原型DPI·2H，藍(lán)色消失，其反應(yīng)過程如下：琥珀酸+FAD→延胡索酸+FADH2DPI（藍(lán)色）+FADH2→DPI·2H（無色）+FAD根據(jù)褪色時(shí)間可測(cè)定生物氧化過程中各代謝物與琥珀酸之間在代謝途徑中的距離。三、試劑及材料磷酸鉀緩沖溶液（PBS，50mmol/L，pH7.4）：0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液500ml和0.2mol/L氫氧化鈉溶液395ml混合加水至2000ml。豬心，2，6-二氯酚錠酚（1.5mmol/LPBS），葡萄糖溶液（90mmol/LPBS），琥珀酸溶液（90mmol/LPBS），乳酸溶液（90mmol/LPBS），NAD+（5mmol/L磷酸鹽緩沖溶液）。四、儀器設(shè)備絞肉機(jī)，紗布，細(xì)砂，研缽，冰浴，恒溫水浴。五、操作方法1.心肌提取液的制備稱取絞碎的心肌糜3g，置250ml燒杯中，加冰冷的去離子水200ml，攪拌1min，靜置1min，小心傾去水層，同法洗滌3次后，以細(xì)紗布過濾并輕輕擠壓除去過多液體。將肉糜轉(zhuǎn)移至冰冷的研缽中，加等量細(xì)砂和PBS5ml，在冰浴中研磨至糊狀，再加PBS15ml，抽提（至少5min），雙層紗布過濾，濾液收集于試管，置冰浴中備用。2.底物的氧化取6支試管編號(hào)，按下表依次加入各試劑（單位ml）管號(hào)123456DPI0.50.50.50.50.50.5葡萄糖溶液0.50.5————琥珀酸溶液——0.50.5——乳酸溶液————0.50.5NAD+0.5—0.5—0.5—PBS0.51.00.51.00.51.0將試管搖勻后于37℃中保溫5min，加已經(jīng)37℃水浴預(yù)保溫5分鐘的心肌提取液各1ml，混勻并繼續(xù)保溫。3.觀察觀察各管顏色變化，記錄各管褪色時(shí)間，30min不褪色者記為不褪色。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果所說明的問題。六、注意事項(xiàng)1.無色（還原型）DPI·2H與氧接觸可重新氧化成藍(lán)色的（氧化型）DPI，所以觀察本實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)切勿振搖試管。2.體外實(shí)驗(yàn)亦可用甲烯藍(lán)作為受氫體，再類似實(shí)驗(yàn)條件下藍(lán)色的甲烯藍(lán)（氧化型）受氫還原成無色甲烯藍(lán)（還原型）。七、思考題1.名詞解釋：電子傳遞鏈；氧化磷酸化作用；解偶聯(lián)作用；高能化合物2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄及分析3.討論下列問題：常見的呼吸鏈電子傳遞抑制劑有哪些？它們的作用機(jī)制是什么？實(shí)驗(yàn)七SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量（4學(xué)時(shí)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的實(shí)驗(yàn)原理，掌握相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（Acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N–甲叉雙丙烯酰胺（Methylence-bisacry-lamide，簡(jiǎn)稱Bis）在催化劑和加速劑的作用下聚合交聯(lián)形成的具有分子篩效應(yīng)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。凡以此凝膠為支持物的電泳均稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE）。凝膠篩孔大小、機(jī)械強(qiáng)度和透明度等物理參數(shù)，主要取決于凝膠濃度（T%）及交聯(lián)度（C%），隨著這兩個(gè)參數(shù)的改變，可獲得對(duì)待測(cè)分子進(jìn)行分離、分辨的最適孔徑。T%=[(丙烯酰胺g+甲叉雙丙烯酰胺g)/總體積]×100C%=[甲叉雙丙烯酰胺g/(丙烯酰胺g+甲叉雙丙烯酰胺g)]×100丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。在連續(xù)系統(tǒng)中緩沖溶液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下主要靠電荷及分子篩效應(yīng)得以分離；而在不連續(xù)系統(tǒng)中，不僅具有前兩種效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，使電泳具有良好的清晰度和分辨率。電泳時(shí)樣品的濃縮效應(yīng)主要由以下原因產(chǎn)生：（1）凝膠孔徑的不連續(xù)。在不連續(xù)的PAGE中，電泳凝膠由上下兩層不同pH、不同孔徑的濃縮膠和分離膠組成，在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔的濃縮膠中泳動(dòng)的速度快，當(dāng)進(jìn)入小孔分離膠時(shí)，其泳動(dòng)過程受阻，因而在兩層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的這種不連續(xù)性造成樣品位移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。（2）緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性。在Tris-甘氨酸緩沖體系中，各膠層中均含有HCl，HCl在任何pH溶液體系中均容易離解出Cl-，它在電場(chǎng)中遷移率最大；甘氨酸等電點(diǎn)為6.0，在pH6.8的濃縮膠中，離解度很低，僅有0.1%~1%的NH2CH2COO-，因而在電場(chǎng)中的遷移速度很慢；大部分蛋白質(zhì)pI在5.0左右，在此電泳環(huán)境中都以負(fù)離子形式存在。通電后，這三種負(fù)離子在濃縮膠中都向正極移動(dòng)而且它們的泳動(dòng)率按mdach>mpap>mqaq排序（有效遷移率等于遷移率m與離解度a的乘積）。于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處，被壓縮成極窄的區(qū)帶。（3）是由電位梯度的不連續(xù)性所至。電泳開始后，由于Cl_-的遷移率最大，很快超過蛋白質(zhì)，因此在快離子后面，形成一個(gè)離子濃度低的電導(dǎo)區(qū)，由此產(chǎn)生一個(gè)高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢甘氨酸離子在快離子后面加速移動(dòng)，當(dāng)快離子和慢離子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立后，由于蛋白質(zhì)的有效遷移率正好介于快、慢離子之間而被濃縮形成一狹小的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，凝膠pH變?yōu)?.8，此時(shí)甘氨酸解離度大大增加，其有效遷移率也因此加大，并超過所有蛋白質(zhì)分子。這樣，快慢離子的界面（由溴酚藍(lán)指示劑標(biāo)記）總是跑在被分離的蛋白質(zhì)樣品之前，不再存在不連續(xù)的高電勢(shì)梯度區(qū)域。于是，蛋白質(zhì)樣品在一個(gè)均一的電勢(shì)梯度和均一的pH條件下，通過凝膠的分子篩作用，根據(jù)各種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷不同，具有不同遷移率而達(dá)到分離目的。垂直平板電泳凝膠是在兩塊垂直放置、間隔幾個(gè)毫米的平行玻璃中進(jìn)行的，所得的是垂直平板狀的凝膠。垂直平板電泳有以下優(yōu)點(diǎn)：一系列樣品能在同一塊凝膠板上進(jìn)行，顯色條件也相同；平板表面大，有利于凝膠冷卻；易于進(jìn)行光密度掃描測(cè)定。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是聚丙烯酰胺凝膠電泳的一種特殊形式。實(shí)驗(yàn)證明，在蛋白質(zhì)溶液中加入十二烷基硫酸鈉（SDS）這陰離子表面活性劑和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)–SDS復(fù)合物。大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.4克SDS，蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的SDS陰離子，所帶負(fù)電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的電荷量，從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差別。同時(shí)，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，使它們?cè)谒芤褐械男螤罱朴陂L(zhǎng)橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度均為1.8mm，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量成正比的變化。這樣的蛋白質(zhì)–SDS復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，僅取決蛋白質(zhì)分子量的大小。故可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)和遷移率所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出未知物的分子量。三、試劑與儀器（一）試劑（所用水為重蒸水）1．30%單位膠儲(chǔ)備液（Acr:Bis=29:1）稱58g丙烯酰胺（Acr）溶于180mL雙蒸水，再加入2g甲叉雙丙烯酰胺（Bis），溶解后定容至200mL，過濾備用。2．分離膠緩沖液（pH8.8，3mol/LTris-HCl）稱取36.33gTris溶于80mL雙蒸水中，在pH計(jì)上用HCl調(diào)pH至8.8，然后定容至100mL。3．濃縮膠緩沖液（pH6.8，1mol/LTris-HCl）稱12.11gTris溶于80mL雙蒸水中，在pH計(jì)上用HCl調(diào)pH至6.8，加水定容至100mL。4．10%SDS：稱取10gSDS，在65℃下用水溶解并定溶至100mL。5．10%過硫酸銨（AP，聚合用催化劑）稱5gAP溶解于50mL雙蒸水中，最好臨用之前新鮮配制。也可置于4℃冰箱中避光保存，7天后重配。10%N，N，N，N–四甲基乙二胺（TEMED）（聚合用加速劑）移取0.1mLTEMED稀釋至1.0mL。置于4℃保存。7．Tris-Gly電極緩沖溶液：稱取7.5gTris鹽和36g甘氨酸用水溶解，再加入10%SDS25mL，用水定容至500mL，備用。臨用時(shí)稀釋5倍。8．50mmol/LTris-HCl(pH6.8)緩沖溶液稱取0.606gTris溶于80mL雙蒸水，在pH計(jì)上用HCl調(diào)pH至6.8，然后加水至100mL。9．加樣緩沖溶液：吸取50mmol/LTris-HCl(pH6.8)緩沖溶液3.2mL、10%SDS溶液11.5mL、β-巰基乙醇2.5mL、溴酚藍(lán)2mg以及甘油5mL，用水溶解并定容至50mL。10．染色液稱取0.5g考馬斯亮藍(lán)R–250溶于甲醇和冰醋酸混合液（80mL/20mL）中，過濾備用。11．脫色液取150mL甲醇與50mL冰醋酸混溶，加雙蒸水至500mL。12．3%瓊脂溶液。13．標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白（電泳專用試劑）。（二）儀器1、直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，電流100mA，電壓400V—500V。2、夾芯式垂直電泳槽，DYYⅢ2A型，1.0mm梳槽。四、操作方法（一）電泳槽安裝夾芯式垂直電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩電極槽中間夾有一個(gè)由凹形硅膠框，長(zhǎng)短玻璃板及樣品槽模板組成（如圖所示）。電泳槽分上貯槽（白金電極面對(duì)短玻璃板）、下貯槽（白金電極面對(duì)長(zhǎng)玻璃板），回紋狀玻璃管用于冷凝。兩電泳槽與凝膠模間靠貯液槽螺釘固定。夾心垂直電泳槽示意圖凝膠模示意圖1、導(dǎo)線接頭；2、下電極緩沖液槽；1、樣品槽定位模扳；2、長(zhǎng)玻璃板；3、凹型橡膠板；4、樣品槽模板；3、短玻璃板；4、凹型橡膠框。5、固定螺絲；6、上電極緩沖液槽；7、冷凝系統(tǒng)。圖1垂直板電泳槽結(jié)構(gòu)示意圖組裝前各部件應(yīng)做徹底清洗，尤其是長(zhǎng)短玻璃及凹形帶槽橡膠框，須用少許洗衣粉徹底清洗，晾干后才能使用。把長(zhǎng)短玻璃分別插入相應(yīng)的凹形橡膠框，注意手指不要接觸膠面的玻璃板。用點(diǎn)滴管或進(jìn)樣槍，把已經(jīng)融化的瓊脂密封長(zhǎng)、短玻璃板的間隙，瓊脂以滲入長(zhǎng)、短兩玻璃鍵間隙的高度1.0cm為宜，可略抬起膠框的一端在瓊脂末凝固之前排去瓊脂膠層的氣泡。而后垂直放置膠框，讓瓊脂完全凝固。把帶正極的電泳槽有機(jī)玻璃板仰放于臺(tái)面，將已經(jīng)用瓊脂密封好的玻璃板凝膠模，以長(zhǎng)玻璃板面對(duì)正極的方式，平放于玻璃板上方，然后把帶有負(fù)極的另一側(cè)電泳槽有機(jī)玻璃板按螺絲銷釘裝好，并以對(duì)角線的方式逐漸旋緊螺絲帽，松緊程度以電泳槽不滲漏電極緩沖液而樣品槽梳子又能夠方便插入為宜。（二）灌膠1、配膠由于SDS電泳分離不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于所形成SDS—蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的正確選擇尤為重要。如凝膠濃度太大，孔徑太小，電泳時(shí)樣品分子不能進(jìn)入凝膠。如凝膠濃度太小，孔徑太大，則樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨著凝膠緩沖液流向前推進(jìn)，而不能得以很好地分離。因此實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)分析樣品的分子量大小選擇合適的凝膠配比。不同濃度分離膠配比參考如下：表不連續(xù)緩沖系統(tǒng)電泳中不同網(wǎng)孔凝膠溶液配方參考表試劑分離膠凝膠濃度（12.5T%）分離膠凝膠濃度（10T%）分離膠凝膠濃度（7.2T%）濃縮膠凝膠濃度（4T%）分離膠緩沖液3.15mL3.15mL3.15mL/濃縮膠緩沖液///2.5mL單體膠儲(chǔ)備液10mL8.5mL6.0mL2.7mL10%SDS0.25mL0.25mL0.25mL0.25mL重蒸水11.2mL12.7mL15.2mL14.2mL10%過硫酸銨0.2mL0.2mL0.2mL0.2mLTEMED?40μL40μL40μL40μL總體積25mL25mL25mL20mL?此溶液在灌膠前最后加入，以避免膠體凝固無法灌膠。2、灌膠a分離膠制備：將配制好的分離膠，連續(xù)緩慢地沿長(zhǎng)玻璃板板壁注入凝膠模，直至膠液的高度達(dá)到低玻璃板板面2/3左右，用注射器小心流加入2cm左右高度的雙蒸水覆蓋膠面，其加水速度應(yīng)控制在不破壞膠層分度。約60min左右后，當(dāng)凝膠與水層間出現(xiàn)折射率不同的分層面時(shí)，表明凝膠聚合完成。傾去膠層蒸餾水，再用雙蒸水洗滌膠面，以除去未聚合膠液，并用濾紙吸干多余的水。b濃縮膠置備：用微量的未加TEMED的濃縮膠洗滌分離膠面一次，傾去洗滌用的濃縮膠液，用濾紙吸干多余的膠液。然后將配好的濃縮膠連續(xù)緩慢加到已聚合的分離膠的上方，直至距離短玻璃板上緣約1mm處為止，隨后將樣品槽梳子輕輕插入濃縮膠內(nèi)。待凝膠聚合后，小心拔出槽梳板，注意不要弄斷或弄裂膠層。用長(zhǎng)針頭輕而有序地將每個(gè)凹形樣品槽修飾整理，加雙蒸水清洗槽坑，最后用針筒抽干凹槽內(nèi)的雙蒸水。將稀釋5倍的Tris–Gly電極緩沖液，倒入電泳儀上、下貯槽中，緩沖液高度以浸泡短玻璃板0.5cm以上為宜，即可準(zhǔn)備加樣。（三）樣品處理與上樣1、電泳樣品前處理（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣處理：按購(gòu)置標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品說明書操作，取一定體積標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品溶液于1.5mL離心管，加入適量加樣緩沖液，混勻，在100℃沸水中浴中加熱3~5min，取出冷卻后上樣。若上樣液中渾濁，離心后備用。（2）待分析蛋白樣品前處理：根據(jù)待測(cè)樣品蛋白含量，加入適量的加樣緩沖溶液溶解，使樣品濃度約為0.5~2mg/mL，混勻，按上述方法加熱處理，冷卻，離心后備用。處理后的樣品可放在4℃的冰箱中短期保存，-20℃冰箱中保存6個(gè)月，使用前在仍需在沸水浴中加熱3~5min后上樣。2、加樣向樣品槽加入20~25μL樣品，一般以上樣體積≤樣品槽總體積2/3為宜。如樣品槽出現(xiàn)氣泡，可用注射器剔除。加樣時(shí)把裝有樣液注射器的針頭小心伸進(jìn)樣品槽內(nèi)，并盡量接近其底部，切勿捅穿膠層，輕輕推動(dòng)注射器將樣液注入樣品槽底部，由于加樣緩沖液中含有甘油，從而使樣品液的比重增加并可自動(dòng)沉將于樣品槽的底部。由于兩端樣品槽的樣點(diǎn)易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)影響，影響分子量分布的分析結(jié)果，所以凝膠板兩端的樣品槽一般不作點(diǎn)樣用，僅注入溴酚藍(lán)指示液跟蹤樣品在電場(chǎng)中的泳動(dòng)情況。（四）電泳正確聯(lián)接電泳槽與電泳儀的正負(fù)極，接通冷凝水，開啟電泳儀開關(guān)，采用穩(wěn)流電泳。首先把電壓調(diào)整電位器向右旋轉(zhuǎn)6~7圈，使電泳過程電壓有足夠的上升區(qū)間，調(diào)整電流旋鈕將電流調(diào)至25mA后開始電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)指示液泳動(dòng)遷移至距離橡膠框前沿約1.5cm時(shí)，將電流回調(diào)至零，關(guān)閉電源及冷卻水，電泳結(jié)束。（五）凝膠剝離旋松電泳槽固定螺絲，取下凝膠模，卸下硅橡膠框，用不銹鋼小鏟撬離短玻璃板，棄去濃縮膠，小心剝離分離膠，并在凝膠片基線處切下一角作為加樣基線標(biāo)記，用雙蒸水略沖膠面。（六）染色與脫色把膠片移入染色液中，染色6小時(shí)以上，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，更換脫色液直到電泳區(qū)帶清晰為止。五、結(jié)果計(jì)算與分析由電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，記錄標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子以及樣品蛋白分子相對(duì)遷移加樣端距離(cm)、溴酚藍(lán)染料相對(duì)遷移加樣端距離(cm)。根據(jù)下式計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子的相對(duì)遷移率：相對(duì)遷移率=以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（lgMw）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品蛋白的相對(duì)遷移率從標(biāo)準(zhǔn)