生物選修三 大腸桿菌的培養(yǎng)與分離課件

生物技術(shù)概述也叫生物工程,是應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理,以微生物、動(dòng)物、植物作為反應(yīng)器,將物料進(jìn)行加工,以提供產(chǎn)品為社會服務(wù)的技術(shù)。例如：以酵母為反應(yīng)器制酒、以醋桿菌為反應(yīng)器制醋、以轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌為反應(yīng)器生產(chǎn)生長激素、以羊?yàn)榉磻?yīng)器生產(chǎn)人乳?，F(xiàn)代生物技術(shù)的目的對生物體進(jìn)行改造，培育出具有優(yōu)良品質(zhì)的動(dòng)物、植物、微生物新品系。利用微生物、動(dòng)物、植物為反應(yīng)器對原料進(jìn)行加工，生產(chǎn)出人類所需要的產(chǎn)品。進(jìn)行疾病的防治、診斷和治療。環(huán)境污染的檢測生物工程包括:基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程和蛋白質(zhì)工程。基因工程的主要原理利用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)，通常是脫氧核糖核酸（DNA）分離出來，在體外進(jìn)行切割、拼裝和重組。然后將重組了的DNA導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞或個(gè)體，從而改變它們的遺傳品性；有的還使新的遺傳信息在新的宿主細(xì)胞或個(gè)體中大量表達(dá)，以獲得基因產(chǎn)物。蛋白質(zhì)工程：通過改變個(gè)別的氨基酸來改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。這種加工改造就叫蛋白質(zhì)工程。酶工程：與蛋白質(zhì)工程一樣，就是用基因工程的手段改變酶或蛋白質(zhì)的折疊方式、空間結(jié)構(gòu)、催化活性和穩(wěn)定性等。1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)。3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實(shí)驗(yàn)原理。實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?設(shè)備及用品(21頁)三.材料(22頁)四.步驟(22頁)細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)要用LB液體培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)）劃線分離要用LB固體培養(yǎng)基（用于分離、鑒定、計(jì)數(shù)）。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識：

(一)微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱。(二)細(xì)菌的常識1、結(jié)構(gòu)2、分裂3、生殖4、變異類型5、在基因工程中的應(yīng)用大腸桿菌細(xì)菌的外形與大小大腸桿菌屬于桿狀菌圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌細(xì)菌的革蘭氏染色革蘭氏染色法是一種用于細(xì)菌的染色法。將細(xì)菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細(xì)菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細(xì)胞壁的成分不同。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌4.培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：擴(kuò)增細(xì)菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），鑒定、保藏菌種單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)?！罹?/p>

☆無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。（無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。）成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。（1）消毒定義：2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌的定義：是指利用化學(xué)或物理方法，殺滅病原微生物的方法。是指以化學(xué)劑或物理方法殺滅或清除

環(huán)境中一切微生物

（包括芽胞、孢子）的方法1）、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2）、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3）、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4）、紫外線消毒……消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：1kg/cm2、121℃下維持15-30min.1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考1二、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)操作

（一）器具的滅菌

P20

無菌操作的首要條件是各種器皿必須是無菌的，如各種大小的培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、取樣器的頭（槍頭）、移液管、三角刮刀、接種環(huán)、鑷子等等。這些用具通常用高壓蒸汽滅菌法滅菌。滅菌前各種用品均需用牛皮紙或報(bào)紙包好。培養(yǎng)皿可以幾個(gè)包在一起；試管加棉花塞或塑料蓋后也是幾個(gè)包在一起；三角瓶可用封口膜（即通氣又不使細(xì)菌進(jìn)入）或6層紗布封口，再用牛皮紙或報(bào)紙封口；移液管上端用鑷子放入少量棉花，再用牛皮紙包上。。。

在121度（1kg/cm2壓力）下滅菌15分鐘。

*實(shí)驗(yàn)中所需的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。滅菌后通常見實(shí)驗(yàn)用具放入60-80度烘箱中烘干，以除去滅菌時(shí)的水分。

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作前，將需要使用的用具從烘箱中取出，放到超凈臺上然后打開紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30min。

二、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)操作

（二）培養(yǎng)基的配制與滅菌

P21取2個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后121度高壓鍋滅菌15min。

如果培養(yǎng)基中有葡萄糖，為防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2壓力（90度以上）滅菌30min。有些不能加熱滅菌的化合物，如尿素（加熱會分解）等，只能用G6玻璃砂漏斗過濾，但玻璃砂漏斗使用前也要在121度下用紙包好滅菌。G6孔徑最小，細(xì)菌不能濾過。玻璃砂漏斗用后續(xù)用1mol/L的HCL浸泡并濾去酸，再用蒸餾水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。

（詳見課本）倒平板技術(shù)//////1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和涂布平板法

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法

1、劃線分離法無菌操作臺上用接種環(huán)取菌后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線.（五）大腸桿菌的劃線分離平板劃線的操作不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個(gè)條狀的菌落。1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次。2平板劃線時(shí)不能劃破培養(yǎng)基3.劃線首尾不能相接4.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h注意事項(xiàng)：一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個(gè)條狀的菌落。問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。涂布分離法1、系列稀釋操作2、涂布平板操作問題討論涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。分離后,一個(gè)菌體便會形成一個(gè)菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡便方法之一。劃線分離法和涂布分離法哪個(gè)更好呢？劃線分離：方法簡單，但單菌落較難分開。涂布分離：單菌落更易分開，但操作復(fù)雜。微生物的恒溫培養(yǎng)（六）微生物的恒溫培養(yǎng)（七）大腸桿菌分離后保存1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細(xì)，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細(xì)菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（3）上述方法較難區(qū)別同類的不同物種，需借助化學(xué)和進(jìn)一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)為什么要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離目的。4.實(shí)驗(yàn)完成后,接種過細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理?所有接觸過菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養(yǎng)基）；使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄5.如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌,如何保證不被普通的大腸桿菌所污染?轉(zhuǎn)基因用的質(zhì)粒不是細(xì)菌中原有的，而是經(jīng)過改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基對菌體進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離步驟與操作:1、將LB固體和液體培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿滅菌2、將滅菌后冷卻到60℃的LB固體培養(yǎng)基倒入滅菌過的培養(yǎng)皿中，制備培養(yǎng)基平板。3、將大腸桿菌從斜面接種到LB液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床中振蕩培養(yǎng)12h。4、用接種環(huán)取振蕩培養(yǎng)后的菌液，在固體培養(yǎng)基平板上劃線，然后將劃線后的培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h，觀察菌落。5、用接種環(huán)取單個(gè)菌落，劃線接種于斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再放入4℃冰箱保存?！菊n堂練習(xí)】例1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（）

A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽