DNA電泳及應(yīng)用技術(shù)精美生物醫(yī)學(xué)

找答案……基因操作中常用電泳有哪些？差別在哪里？影響凝膠電泳的因素有哪些？聚丙烯酰胺凝膠是怎么樣構(gòu)成的？電泳：是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。

概述凝膠電泳：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì)作支持體的電泳。特點：1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點在凝膠的孔中泳動。2.電泳操作方法簡便，電泳速度快3.分辨率高，重復(fù)性好，電泳圖譜清晰。4.適用于生化，免疫等定性定量測定

瓊脂糖凝膠天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。瓊脂糖（agarose）瓊脂膠（agaropectin）瓊脂糖半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。

瓊脂糖凝膠的特點

（一）優(yōu)點1.分離范圍廣，約200bp——50kb的核酸均可。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定6.有熱可逆性（二）缺點1.機械強度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。4.與聚丙烯酰胺電泳相比，分辨率低。

影響核酸凝膠電泳的因素：1．樣品核酸的性質(zhì)2．電場強度和電場方向3．電泳環(huán)境：緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率4．凝膠孔徑的大小。什么是遷移率帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度影響因素有：1、DNA的分子大小線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

2、瓊脂糖濃度DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的

DNA分子大小來確定。

瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍

3、DNA分子的構(gòu)象相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度超螺旋DNA最快,而開環(huán)雙鏈DNA移動最慢。

4、電源電壓在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。隨著電場強度的增加，片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶（EB）用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間，使線狀DNA遷移率降低15％。

常用染料EB:溴化乙錠，能插入DNA分子堿基對之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。DNA吸收的260nm的紫外光傳遞給EB，或者結(jié)合的EB本身在300和360吸收的射線，均可在可見光區(qū)以590波長發(fā)射出來，呈橙紅色。優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以加到樣品中。EB是誘變劑，使用時一定要戴手套。EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價格較昂貴。Genefinder:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣膠中，價格較低。6、離子強度影響電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

常用的電泳緩沖液一般配制成濃縮母液,儲于4℃保存?zhèn)溆?實驗步驟

⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。

植物總（核）DNA樣品應(yīng)呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶。瓊脂糖凝膠電泳的實驗技巧和方法1.）加樣時槍頭不要碰壞凝膠壁，否則DNA的帶型將不會整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液，以趕走樣品空中的氣泡。2.）每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。3.）應(yīng)注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積，以免加樣時樣品流入附近樣品孔造成交叉污染，影響結(jié)果分析。4.）在實驗加樣中不一定每一個樣品都換一個槍頭，可在陽極槽中反復(fù)吸打電泳緩沖液以清洗。（對于需要回收DNA片段的電泳除外。）

注意事項1.）凝膠中加入EB進行電泳，便于紫外線下觀察電泳狀態(tài)，但EB會導(dǎo)致線形DNA遷移率下降。2.）判斷正負極的另一方法是負極氣泡（H2）比正極氣泡（O2）多一倍。3.）電泳過程中，EB與DNA泳動的方向相反，長時間會造成靠正極方向的凝膠中EB含量低，會對含量較少的小分子DNA片段檢測困難。處理方法是：將凝膠在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分鐘。操作使用3mg的DNAMarkerDL

2,000（500ng/條帶）進行1%的瓊脂糖凝膠電泳后，各DNA條帶自上至下分別為2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠是三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，其為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。在成分：丙烯酰胺(簡稱Acr)

和N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱Bis)加速劑：N，N，N，N—四甲基乙二胺(簡稱

TEMED)催化劑：過硫酸銨((NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(即vitaminB2)的作用下聚合交聯(lián)形成聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)：通過改變Acr及Bis的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高：尤其在不連續(xù)凝膠電泳中較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。

圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

圖2夾心垂直板電泳槽示意圖

圖3凝膠模示意圖

不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。

圖4電泳過程示意圖

A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子

B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。

（二）影響凝膠聚合的因素1、試劑質(zhì)量2、凝膠濃度3、溫度和氧氣的影響凝膠電泳的操作要點1凝膠制備2電極緩沖液3樣品處理及加樣4電泳5染色與固定6脫色7分析實驗步驟

1.膠模固定：將兩塊洗凈的玻璃板，按要求對齊，夾好。將膠模裝入電泳槽固定好，并將膠模下端封好，防漏。

(電泳槽按要求清洗干凈)。2.制備分離膠：按分離膠配制方法配好分離膠，緩慢注入膠模中（占玻璃板的2/3），室溫下聚合40min。制備濃縮膠：配制好3%濃縮膠。將膠模中上層水傾倒出去，用濾紙吸干余水。倒入濃縮膠插好樣品梳，注意避免汽泡出現(xiàn)。電泳：將膠模裝好，去膠條后，裝入電泳槽中，檢查是否漏液后，倒入電泳緩沖液，膠模內(nèi)側(cè)的液面沒過矮板但不可超過高板（矮板在內(nèi)）。上樣：將樣品梳拔出，用電極緩沖液沖洗樣品孔。樣品與樣品緩沖液按一定比例混合好。用微量注射器加入加樣孔，加樣量為5～10μl。電泳:連接直流穩(wěn)壓電源，矮板連負極，打開電源開關(guān)。調(diào)節(jié)電流，進入分離膠之前為

10mA，進入分離膠之后為2OmA。染色:關(guān)閉電源，取下凝膠模。用剪刀、靠水流壓力和潤滑作用，將玻璃板與膠分開。在脫色搖床上用考馬斯亮蘭染色1h。8．脫色：將膠取出，蒸餾水沖洗數(shù)次后，放入脫色液中，數(shù)小時換液一次，直至背景清晰為止。煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（一）基本原理在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS（陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉），不影響凝膠