克隆動物培育技術(shù)

關(guān)于克隆動物培育技術(shù)第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二十五章動物克隆技術(shù)第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日克隆動物(clonalanimal)是指人們采用動物克隆技術(shù)得到無性繁殖的在遺傳上與親本動物完全相同的動物。1997年世界衛(wèi)生組織解釋克隆為遺傳上同一的機體或細胞系(株)的無性生殖。分子水平上的克隆是指DNA分子的復(fù)制。細胞水平上的克隆是指細胞或組織培養(yǎng)。個體水平上的克隆是指動、植物的無性繁殖，其中，動物克隆偏重于指細胞核移植。第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)動物克隆技術(shù)的

理論基礎(chǔ)及發(fā)展簡況第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日動物克隆技術(shù)的理論基礎(chǔ)是動物細胞發(fā)育的全能性。①動物細胞核都含有與生殖細胞相同的遺傳信息，因此具有發(fā)育的全能性。兩方面突破：②卵母細胞的細胞質(zhì)中含有啟動供體核重新編程(reprogramming)的各種因子。已經(jīng)分化的細胞核重新回到未分化的起點，重新編程形成重構(gòu)胚并被激活。第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、細胞發(fā)育的全能性（一）全能性的概念全能性(totipotency)是指分裂球發(fā)育成為完整胚胎的能力。包括細胞發(fā)育全能性和細胞核發(fā)育全能性。第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日1、細胞的全能性細胞分化能力的強弱稱為發(fā)育潛能。根據(jù)發(fā)育潛能可以將細胞分成全能性、多能性、單能性細胞及終末分化細胞。受精卵以及胚胎干細胞的發(fā)育具有全能性；多能造血干細胞具有的發(fā)育潛能稱為多能性；終末分化細胞，如人的成熟紅細胞。細胞全能性的基礎(chǔ)在于所有細胞的細胞核包含一個物種的全套染色體組，具有發(fā)育成一個完整個體所需要的全部遺傳物質(zhì)。第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、細胞核的全能性細胞核的全能性是指一個細胞核具有該物種完整的遺傳信息，在適當(dāng)條件下能夠發(fā)育成一個完整個體的能力。將分化的細胞的細胞核導(dǎo)入去核的卵細胞或受精卵，發(fā)育成一個完整的個體（如體細胞克隆動物），就是細胞核全能性。第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）證明細胞全能性的研究事例1、動物早期胚胎細胞的全能性德國VirchowR.論斷“細胞來自細胞”。Roux(1888)用燒燙的針破壞蛙2細胞胚胎。Driesch(1892)以海膽做實驗。Spemann（1901～1903）用細發(fā)結(jié)扎蠑螈受精卵。Roux(1888)用燒燙的針破壞蛙2細胞胚胎觀察胚胎發(fā)育情況第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、已分化的動物細胞的全能性Spemann蠑螈受精卵結(jié)扎實驗⑴兩棲類的核移植實驗第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日Spemann的蠑螈受精卵結(jié)扎實驗(1938)

用頭發(fā)將受精卵沿第一次卵裂面結(jié)扎成2個半球，使細胞核留在其中的一個半球中，兩半球之間留有一條小縫隙，當(dāng)有核的一側(cè)發(fā)育到8細胞期時，另一側(cè)還未開始分裂；當(dāng)有核的一側(cè)發(fā)育到16細胞期時，一個細胞核進入無核的一側(cè)，此時將胚胎完全結(jié)扎；140d后，每一側(cè)都發(fā)育成為一個完整的胚胎。第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日1952年，美國科學(xué)家Briggs和King以美洲豹蛙做核移植實驗。將未分化的蛙囊胚細胞的細胞核移植到蛙去核受精卵中，獲得了正常發(fā)育的蝌蚪。后來的實驗得出結(jié)論：蛙胚胎細胞核的發(fā)育潛能隨著胚胎發(fā)育的進程、細胞分化的提高而逐步下降。第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日1962年，Gurdon通過連續(xù)核移植，將爪蟾蝌蚪已經(jīng)分化的腸上皮細胞核移植到去核的卵母細胞中，獲得了可育的成熟個體。第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日1977年，Gurdon以一只白化爪蟾蝌蚪細胞為供體，克隆到了30只白化非洲爪蟾。第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日⑵哺乳類的核移植實驗1981年，瑞士科學(xué)家Illmensee和美國科學(xué)家Hoppe首次報道哺乳動物細胞核移植獲得成功。ICR(白色)ICR(白色)(棕色)(黑色)第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日⑵哺乳類的核移植實驗1983年，McGrath和Solt結(jié)合顯微技術(shù)與細胞融合技術(shù)，將單細胞期小鼠胚胎與未受精卵用病毒誘導(dǎo)融合的方法獲得了后代。1996年，Campbell等采集9d齡的綿羊胚胎進行傳代培養(yǎng)，以培養(yǎng)液中血清濃度遞減的饑餓培養(yǎng)，誘導(dǎo)6-13代細胞進入靜止期，移入去核的卵母細胞，產(chǎn)下了克隆羊。這是用已分化細胞系經(jīng)誘導(dǎo)進入Go期核移植產(chǎn)下的首例克隆羊。第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日⑵哺乳類的核移植實驗1997年，英國Roslin研究所的Wilmut等用乳腺細胞核移植培育克隆綿羊——“多莉(Dolly)”。Wilmut等采用6歲母羊（白面）懷孕3個月時的乳腺細胞進行核移植。供體核在血清濃度從10％降至0.5％的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)至靜止期，然后移入去核卵母細胞，發(fā)育為桑椹胚和囊胚再移植到受體母羊（黑面），結(jié)果產(chǎn)羔l頭（白面），即著名的“多莉”。這是世界上首次用體細胞克隆獲得的后代，劃時代意義在于證明動物成體細胞核仍具有發(fā)育全能性。第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日體細胞核移植法培育克隆綿羊一多莉第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、供體核重新編程早期使用原核期的受精卵和2細胞胚胎。1986年后采用去核的處在MⅡ期(第二次分裂中期)的成熟卵母細胞作胞質(zhì)受體。1、受體細胞的來源第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、重構(gòu)胚核質(zhì)適應(yīng)機理Gurdon（1966）研究發(fā)現(xiàn)，核在移植前轉(zhuǎn)錄rRNA基因，移入卵后，核仁消失，rRNA基因失活；隨著胚胎的發(fā)育，rRNA基因活性恢復(fù)，核仁重現(xiàn)。表明卵細胞質(zhì)對核活性有重構(gòu)效應(yīng)。事實上，核重編程同核質(zhì)間蛋白質(zhì)交換有關(guān)。許多細胞質(zhì)因子，如組蛋白(去)、乙酰化酶、DNA甲基化/去甲基化酶等進入核內(nèi)；核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，如異染色質(zhì)蛋白、組蛋白H1等輸出核外。（1）核質(zhì)互作第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日（2）核重編程核重編程的過程就是基因重新被激活的過程。體細胞去分化過程伴隨著與染色質(zhì)相關(guān)的蛋白(如連接組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子)的重構(gòu)、基因組甲基化變化、組蛋白組裝及核小體形成等。染色質(zhì)解聚對核重編程可能是必須的。核重編程涉及到基因組DNA甲基/去甲基化和組蛋白乙酰化。通過基因組甲基化來改變DNA與蛋白質(zhì)間的作用。第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日（3）端粒在細胞分化過程中，核重編程須去除染色質(zhì)上的獲得性修飾。牛成纖維細胞核克隆胚胎的端粒酶活性比胚胎干細胞樣細胞的端粒酶活性顯著降低；用血清饑餓法進行細胞傳代，與不經(jīng)處理的早期傳代細胞相比，端粒酶活性降低30%-50%。體外培養(yǎng)牛胎兒成纖維細胞和胚胎干細胞樣細胞晚期傳代中發(fā)現(xiàn)了端粒縮短。第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、細胞周期細胞周期分四個時期，包括G1期，S期，G2期，M期。有絲分裂中，成熟促進因子（也叫M期促進因子MPF）調(diào)控細胞由間期向M期轉(zhuǎn)變。核受體一般是MⅡ期卵母細胞，但是MⅡ期卵母細胞MPF的含量依然很高，將誘導(dǎo)移植核發(fā)生一系列的形態(tài)變化，包括核膜破裂(NEBD)，早熟染色體凝集(PCC)。只能將G1期(二倍體)的核移入未經(jīng)活化的MⅡ期的卵母細胞的細胞質(zhì)，才能獲得染色體倍體正常且能正常發(fā)育的重組胚胎。第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日供體核重新編程的機理

具有全能性的細胞核是否具有重編程的能力，主要取決于細胞質(zhì)啟動供體核重新編程的因子。核重編程涉及到基因組DNA甲基/去甲基化和組蛋白乙酰化。在細胞分化過程中，核重編程須去除染色質(zhì)上的獲得性修飾。與端粒酶活性降低、端?？s短有關(guān)。第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)動物克隆技術(shù)方法第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日動物克隆技術(shù)方法可分為胚胎分割、胚胎嵌合、細胞核移植、雌核或雄核發(fā)育等。細胞核移植方法又分為胚胎細胞核移植、胚胎干細胞核移植、胎兒成纖維細胞核移植和體細胞核移植等。第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、細胞核移植克隆技術(shù)供體細胞（核供體）的準(zhǔn)備。受體細胞（細胞質(zhì)受體）的準(zhǔn)備。核移植。核質(zhì)融合及卵母細胞質(zhì)的激活。重構(gòu)胚的培養(yǎng)和移植。重復(fù)克隆?？寺游锏蔫b定。其基本技術(shù)環(huán)節(jié)除顯微操作技術(shù)外，主要包括：第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日體細胞克隆豬圖解細胞核移植技術(shù)進行動物克隆的主要步驟，包括供體細胞的選擇、受體細胞的去核、核移植、胚胎融合、重構(gòu)胚胎移植，以及連續(xù)核移植等等。第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日1、供體細胞的準(zhǔn)備常用的供體細胞有3大類：早期胚胎細胞、胚胎干細胞和體細胞。核移植時可以將整個細胞作為供體，也可以挑取細胞核或含有少量細胞質(zhì)的細胞移植到受體中供體細胞的準(zhǔn)備方面，通常采用建立細胞系的辦法。包括：①胚胎干細胞系的建立。②TNT4細胞系的建立。將供體細胞的細胞周期做同步法處理，即G0期的誘導(dǎo)。方法是：在5d內(nèi)將培養(yǎng)液的血清濃度由10.0%降至0.5%。第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日2、受體細胞的準(zhǔn)備受體細胞有3類：卵母細胞、原核期受精卵和2細胞期胚胎細胞。獲得卵母細胞多采用活體超排的方法。卵母細胞的去核目前多采用顯微操作法，即在顯微鏡下用外徑為20μm的微細玻璃管吸管吸取細胞核。常用的去核方法有盲吸法、半卵法和功能去核法等。第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、核移植在顯微操作儀下將供體細胞核移入受體細胞中。根據(jù)供體移入到受體細胞的不同部位，可以分為帶下（透明帶下）注射和細胞質(zhì)內(nèi)注射。第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日4、核質(zhì)融合及卵母細胞質(zhì)的激活核質(zhì)融合的方法有：(1)病毒融合法如將仙臺病毒與供體核一起注入去核的受精卵中，促進細胞融合。(2)電融合法將重構(gòu)胚置于電場下，以電脈沖促進融合。(3)Honolulu技術(shù)利用吸液管將遺傳物質(zhì)取出，然后注入卵細胞中。以機械和化學(xué)激活方式促使重構(gòu)胚的融合。第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日5、重構(gòu)胚的培養(yǎng)和移植一種是體外培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)到一定時期，然后進行胚胎移植。另一種方法是采用中間受體培養(yǎng)，在核質(zhì)融合后，將重構(gòu)胚用瓊脂糖包埋，移入動物的輸卵管或子宮，發(fā)育到桑椹胚或囊胚后，再重新移入假孕受體子宮。第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日6、重復(fù)克隆(連續(xù)核移植)如有必要，將核移植胚胎培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚后繼續(xù)做核供體重復(fù)克隆，可以顯著提高克隆成活率。第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日7、克隆動物的鑒定克隆動物出生后，從形態(tài)、性別上和分子生物學(xué)水平上鑒定，以確定所克隆的動物在遺傳上是否真的來源于供體細胞系。分子生物學(xué)鑒定方法有PCR、Southern、Northern等。第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日克隆綿羊——多莉（Dolly）的培育示意圖第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)技術(shù)關(guān)鍵：一是使精子的遺傳物質(zhì)失活且保持精子激活卵子發(fā)育的能力；二是誘導(dǎo)卵子二倍體形成。使精子遺傳物質(zhì)失活的辦法一般是采用輻射處理(如γ線、X射線、紫外線等)。誘導(dǎo)卵子二倍體形成的辦法，一是在受精后不久抑制第二極體排出；二是在受精卵第一次卵裂時，抑制有絲分裂?？梢杂脺囟?冷休克或熱休克)、靜水壓和化學(xué)(秋水仙素、細胞松弛素B等)等方法。第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日在受精過程的原核期中用顯微手術(shù)操作把雄性原核吸出，再把變成單倍體的卵子用細胞松弛素B處理回復(fù)到二倍體之后，再移植到假孕動物，使之發(fā)育成胎仔。第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)

紅鯽 鯉魚↓↓卵子←精子←紫外燈照射(激活)(遺傳物質(zhì)滅活)(30W,45min)↓單倍體胚胎←冷休克(0～4℃，30min)↓二倍體胚胎→純合二倍體紅鯽(近交系)雌核發(fā)育二倍體紅鯽的培育第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、胚胎嵌合技術(shù)選擇兩對毛色不同的近交系小鼠（例如白色的SJL小鼠與黑色的BL/10小鼠）。在8分裂球時，用蛋白酶消化透明帶，在37℃的條件下，將來自兩個品系的兩種分裂球彼此接觸，任其粘成一個具有雙倍體積的早期胚胎，繼續(xù)培養(yǎng)成胚囊，移植到寄養(yǎng)母鼠的子宮內(nèi)。新生小鼠表現(xiàn)出黑、白條或塊狀的毛色，說明是一只嵌合體小鼠。第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日嵌合體小鼠培育過程第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日四、胚胎分割技術(shù)用顯微術(shù)將未著床的早期胚胎一分為二、四或更多，然后分別移植給受體，妊娠產(chǎn)仔。胚胎分割不是嚴(yán)格意義上的克隆。胚胎分割已得到多種動物的胚胎雙生后代，如兔、小鼠、綿羊、牛、山羊、馬和豬的同胚雙生后代。80年代以來，牛胚胎二分割已應(yīng)用于生產(chǎn)。胚胎分割是胚胎移植的重要措施，也是性別鑒定和核移植等生物工程的基本技術(shù)。第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日第三節(jié)動物克隆技術(shù)的應(yīng)用第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、克隆技術(shù)為近交系實驗動物培育

提供了新途徑克隆技術(shù)為近交系實驗動物培育提供了新途徑，通過這一途徑培育的實驗動物，遺傳組成完全一致，并且比用傳統(tǒng)的近親繁殖方法更省時，品系更純。第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、克隆技術(shù)為解決

異體器官移植供體帶來了希望豬的器官在大小、形狀及生理特點等方面與人的器官非常相似?？梢詫⒇i作為異體器官移植的供體。在異源移植方面，最主要的問題就是急性排斥問題。將豬細胞的細胞膜上的A-1，3-半乳糖昔酶基因敲除或經(jīng)過修飾去除其免疫原性，可以解決豬器官在人體的急性排斥問題。第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、治療性克隆技術(shù)

已成為人類醫(yī)療史上革命性的技術(shù)治療性克隆是指利用克隆技術(shù)結(jié)合人的胚胎干細胞分離技術(shù)，在體外培養(yǎng)人體細胞、組織或器官來修復(fù)人體損傷的細胞、組織或器官的過程。將病人自身體細胞移植到去核的卵母細胞內(nèi)形成重構(gòu)胚，從重構(gòu)胚中分離出ES細胞，并誘導(dǎo)其定向分化為需要替代的細胞，如分化為心肌細胞修復(fù)受損的心臟、分化為胰島細胞治療糖尿病、分化為多巴胺神經(jīng)原治療帕金森氏癥等。人類治療