第八章哺乳動(dòng)物基因工程-BiotechnologySe課件

生物工程專業(yè)核心課程基

因

工

程華東理工大學(xué)張惠展生物工程專業(yè)核心課程基因工程華東理工大學(xué)張惠展基因工程5

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基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過(guò)程目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動(dòng)物基因工程高等植物基因工程基因工程523416789基因工程的基本概D高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動(dòng)物基因工程C高等哺乳動(dòng)物的載體系統(tǒng)B高等哺乳動(dòng)物的受體系統(tǒng)A高等哺乳動(dòng)物基因工程的基本概念E利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白D高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動(dòng)物基因工程CA高等哺乳動(dòng)物基因工程的基本概念8哺乳動(dòng)物基因工程高等哺乳動(dòng)物基因工程高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體動(dòng)物工程細(xì)胞哺乳動(dòng)物遺傳性狀改良藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型人體基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型A高等哺乳動(dòng)物基因工程的基本概念8哺乳動(dòng)物基因工B高等哺乳動(dòng)物的受體系統(tǒng)8哺乳動(dòng)物基因工程高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞B高等哺乳動(dòng)物的受體系統(tǒng)8哺乳動(dòng)物基因工程高等哺高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征：錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長(zhǎng)分裂血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長(zhǎng)因子才能生長(zhǎng)接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長(zhǎng)便受到抑制形態(tài)依賴性：細(xì)胞稱扁平狀，并有長(zhǎng)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長(zhǎng)，即單層細(xì)胞生長(zhǎng)。有時(shí)，正常細(xì)胞會(huì)改變某些特征而越過(guò)生理臨界點(diǎn)，繼續(xù)增殖并無(wú)限制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時(shí)的細(xì)胞成為細(xì)胞系。高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件

細(xì)胞系特征喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大

遺傳穩(wěn)定性外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長(zhǎng)期保存合適的標(biāo)記便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持

生長(zhǎng)快且齊分裂周期短，生長(zhǎng)均一，便于控制規(guī)模培養(yǎng)大多數(shù)正常的高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不能同時(shí)具備上述條件，癌細(xì)胞能

安全性能好不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌滿足上述前四項(xiàng)要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黃嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成途徑補(bǔ)救合成途徑高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞5高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補(bǔ)含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補(bǔ)（hprt-）高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞含高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常見(jiàn)的遺傳選擇標(biāo)記遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機(jī)理APH-

氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 G418

APH滅活G418DHFR

二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤

DHFR變體抗氨甲喋呤

HPH-

潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素B

HPH滅活潮霉素B

TK-

胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤

TK合成TMPXGPRT-

黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸

XGPRT合成GMPADA-

腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷

ADA滅活Xyl-A

高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常見(jiàn)的遺傳選擇常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞主要還是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO），其優(yōu)勢(shì)有如下幾個(gè)方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國(guó)FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（GRAS）常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞迄今為止，用于醫(yī)療C高等哺乳動(dòng)物的載體系統(tǒng)8哺乳動(dòng)物基因工程人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNAC高等哺乳動(dòng)物的載體系統(tǒng)8哺乳動(dòng)物基因工程人腺病人腺病毒DNA腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無(wú)包膜，呈二十面體，共有93個(gè)成員，分哺乳動(dòng)物腺病毒和禽腺病毒兩個(gè)屬。目前已鑒定的人腺病毒腺病毒的生物學(xué)特性有6個(gè)亞屬，其中常用來(lái)構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人細(xì)胞時(shí)呈裂解型，不致癌；但對(duì)嚙齒目動(dòng)物來(lái)說(shuō)，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。人腺病毒DNA腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，人腺病毒DNA腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因組DNA全長(zhǎng)36kb，其包裝上限為原基因組的105%，DNA兩端各有一個(gè)反向重復(fù)序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子，L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會(huì)影響病毒顆粒的成熟，不影響基因組的復(fù)制功能，因而在構(gòu)建載體時(shí)往往除去這個(gè)2.2kb的片段，使得載體的裝載量提高到4kb以上。人腺病毒DNA腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E人腺病毒DNA基因重排低外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個(gè)周期腺病毒DNA載體的特點(diǎn)安全性能好不整合人的染色體DNA，不會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤宿主范圍廣對(duì)受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格使用效果好外源基因在載體上容易高效表達(dá)人腺病毒DNA基因重排低外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)猴多瘤病毒DNA（SV40）

SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40的生物學(xué)特性SV40可以與所有哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。

SV40感染猴細(xì)胞時(shí)呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動(dòng)物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40屬于乳多猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基因組DNAt/T基因編碼病毒的小抗原和大SV40DNAoriVP2TVP3VP1t抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān)

SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時(shí)，每個(gè)宿主細(xì)胞含有105個(gè)病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基因組DNA猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建

重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過(guò)包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40pV2-GPT是一種SV40DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其中g(shù)pt為細(xì)菌來(lái)源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔b-珠蛋白.猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40DNA載體表達(dá)外源基因的程序SV40載體病毒晚期基因啟動(dòng)子篩選標(biāo)記ori缺陷的SV40輔助病毒去除細(xì)菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉(zhuǎn)化篩選增殖感染猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40DNA載體表達(dá)外源猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表達(dá)好外源基因能高效表達(dá)SV40DNA載體的特點(diǎn)基因重排高病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞裝載量較小猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表達(dá)好外源基因能高效表人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨(dú)立于染色體而自人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性主復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個(gè)拷貝人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒（BK人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建BKV-E.coli穿梭載體BKVoriBKVgeneDREMMTPAprE.colioriSV40PNeor刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成穿梭載體，它不能整合，同時(shí)也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。安裝細(xì)胞色素P450dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng)子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動(dòng)子MMTP，由其帶動(dòng)外源基因的表達(dá)。SV40來(lái)源的啟動(dòng)子控制Neor

標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建BKV人牛痘病毒DNA人牛痘病毒是一個(gè)大型DNA病毒，基因組長(zhǎng)185kb，能在宿主細(xì)胞質(zhì)中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建人牛痘病毒的生物學(xué)特性出的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動(dòng)子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外DNA重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。人牛痘病毒DNA人牛痘病毒是一個(gè)大型DNA病毒人牛痘病毒DNA目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒其基因組上插入了一個(gè)可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在人牛痘病毒DNA表達(dá)載體的構(gòu)建外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大量表達(dá)T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動(dòng)子的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞，此時(shí)外源基因整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達(dá)的。人牛痘病毒DNA目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序牛痘病毒啟動(dòng)子T7RNA聚合酶基因T7啟動(dòng)子外源基因細(xì)菌重組質(zhì)粒感染轉(zhuǎn)化培養(yǎng)收集人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序牛痘病毒D高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動(dòng)物基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法D高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動(dòng)物基因工程哺乳動(dòng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列，這對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后，往往以多拷貝的形式隨機(jī)整合在染色體DNA上，導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時(shí)DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；此時(shí)細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進(jìn)入受體細(xì)胞；磷酸鈣共沉淀法將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時(shí)棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。如果在外源DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA，可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這是人們對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時(shí)高壓電場(chǎng)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時(shí)電擊轉(zhuǎn)化法常用于對(duì)磷酸鈣共沉淀法無(wú)效的細(xì)胞類型，如生長(zhǎng)在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。電擊轉(zhuǎn)化法DNA片段便可不經(jīng)過(guò)胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。合，DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和HeLa脂質(zhì)體介導(dǎo)法將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會(huì)與受體細(xì)胞膜融細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法通過(guò)激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；性原核內(nèi)。上述程序多用于動(dòng)物個(gè)體的轉(zhuǎn)基因過(guò)程，由于必須單細(xì)胞逐一操顯微注射法借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄作，所以不太適用于基因的克隆和表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法通過(guò)激素療法使雌鼠超數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法

血影細(xì)胞是指哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞同時(shí)，外源DNA也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可恢復(fù)原來(lái)的通透性。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將血影細(xì)胞介導(dǎo)法核結(jié)構(gòu)。在溶血過(guò)程中，紅細(xì)胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法血影細(xì)胞是指哺乳動(dòng)物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無(wú)法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家禽和牲畜細(xì)胞等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法以病毒DNA為載體可以E利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白8哺乳動(dòng)物基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIIIE利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白8哺乳動(dòng)物基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是動(dòng)物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來(lái)的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò)增。這些抗性細(xì)胞正是通過(guò)增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因（DHFR）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時(shí)被擴(kuò)增。哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理基因擴(kuò)增哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因DHFR-MTX高效表達(dá)系統(tǒng)外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr-細(xì)胞系單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)移0.05mMMTX培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移5mMMTX0.25mMMTX培養(yǎng)單克隆外源基因擴(kuò)增至100拷貝哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因GS-MSX高效表達(dá)系統(tǒng)

谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亞砜（MSX）對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)中不必使用GS缺陷型的受體細(xì)胞，而且在正常的MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-胞中，由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過(guò)程MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表達(dá)外源基因在載體上安裝病毒或細(xì)胞來(lái)源的強(qiáng)啟AprM13oriColE1oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40TPolyAsignal高效表達(dá)載體mRNA前體AAAAAAAAAmRNA動(dòng)子以及有效的翻譯元件，也是使外源基因高效表達(dá)的一種手段，如：細(xì)胞巨化病毒CMV的啟動(dòng)子動(dòng)物珠蛋白基因的內(nèi)含子SV40的終止子和polyA化信號(hào)序列

絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)閙RNA前體的剪切能促進(jìn)成熟mRNA向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利于翻譯。有的還含有各種信號(hào)肽序列。哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但在哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：b

干擾素 g

干擾素凝血因子VIII 凝血因子IX促紅細(xì)胞生成素（EPO）

生長(zhǎng)因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原單克隆抗體 CD4受體組織型纖溶酶原激活劑（tPA） 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴Neor鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子b

肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子抗體輕鏈cDNAb

肌動(dòng)蛋白終止子pLdhfrSV40啟動(dòng)子b

肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子抗體重鏈cDNAb

肌動(dòng)蛋白終止子pH瘤細(xì)胞表面上都有一種特異性的糖蛋白campath用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍金淋巴細(xì)胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)。利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴Neo利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑第一個(gè)由重組哺乳動(dòng)物dhfr啟動(dòng)子人tPAcDNA終止子細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白是治療急性心肌梗塞的溶血栓藥物：人組織纖溶酶原激活劑（tPA）。同樣采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)，受體細(xì)胞選用CHO系統(tǒng)。目前，用該工藝路線生產(chǎn)的重組人tPA已經(jīng)商品化。信號(hào)肽編碼序列此外，人tPA也可由重組大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑第利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII

凝血因子VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。多年來(lái)，血友病病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII生物制品進(jìn)行治療，然而由于人的血源污染乙肝病毒或愛(ài)滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制品的血友病人慘遭感染，其中10%的病人最終死于愛(ài)滋病而非血友病。

早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鑒定，血源的污染則加速了利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)該藥物的進(jìn)程。與tPA相似，人凝血因子VIII也是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，必須通過(guò)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，但目前商品化了的重組人凝血因子VIII尚不能滿足幾代血友病人的大量需求。利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII凝血生物工程專業(yè)核心課程基

因

工

程華東理工大學(xué)張惠展生物工程專業(yè)核心課程基因工程華東理工大學(xué)張惠展基因工程5

2

3

4

1

6

7

8

9

基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過(guò)程目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動(dòng)物基因工程高等植物基因工程基因工程523416789基因工程的基本概D高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動(dòng)物基因工程C高等哺乳動(dòng)物的載體系統(tǒng)B高等哺乳動(dòng)物的受體系統(tǒng)A高等哺乳動(dòng)物基因工程的基本概念E利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白D高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動(dòng)物基因工程CA高等哺乳動(dòng)物基因工程的基本概念8哺乳動(dòng)物基因工程高等哺乳動(dòng)物基因工程高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體動(dòng)物工程細(xì)胞哺乳動(dòng)物遺傳性狀改良藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型人體基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型A高等哺乳動(dòng)物基因工程的基本概念8哺乳動(dòng)物基因工B高等哺乳動(dòng)物的受體系統(tǒng)8哺乳動(dòng)物基因工程高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞B高等哺乳動(dòng)物的受體系統(tǒng)8哺乳動(dòng)物基因工程高等哺高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征：錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長(zhǎng)分裂血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長(zhǎng)因子才能生長(zhǎng)接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長(zhǎng)便受到抑制形態(tài)依賴性：細(xì)胞稱扁平狀，并有長(zhǎng)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長(zhǎng)，即單層細(xì)胞生長(zhǎng)。有時(shí)，正常細(xì)胞會(huì)改變某些特征而越過(guò)生理臨界點(diǎn)，繼續(xù)增殖并無(wú)限制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時(shí)的細(xì)胞成為細(xì)胞系。高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件

細(xì)胞系特征喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大

遺傳穩(wěn)定性外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長(zhǎng)期保存合適的標(biāo)記便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持

生長(zhǎng)快且齊分裂周期短，生長(zhǎng)均一，便于控制規(guī)模培養(yǎng)大多數(shù)正常的高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不能同時(shí)具備上述條件，癌細(xì)胞能

安全性能好不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌滿足上述前四項(xiàng)要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黃嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途徑嘧啶核苷酸生物合成途徑次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成途徑補(bǔ)救合成途徑高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞5高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補(bǔ)含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補(bǔ)（hprt-）高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞含高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常見(jiàn)的遺傳選擇標(biāo)記遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機(jī)理APH-

氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 G418

APH滅活G418DHFR

二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤

DHFR變體抗氨甲喋呤

HPH-

潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素B

HPH滅活潮霉素B

TK-

胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤

TK合成TMPXGPRT-

黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸

XGPRT合成GMPADA-

腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷

ADA滅活Xyl-A

高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常見(jiàn)的遺傳選擇常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞主要還是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO），其優(yōu)勢(shì)有如下幾個(gè)方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國(guó)FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（GRAS）常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞迄今為止，用于醫(yī)療C高等哺乳動(dòng)物的載體系統(tǒng)8哺乳動(dòng)物基因工程人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNAC高等哺乳動(dòng)物的載體系統(tǒng)8哺乳動(dòng)物基因工程人腺病人腺病毒DNA腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無(wú)包膜，呈二十面體，共有93個(gè)成員，分哺乳動(dòng)物腺病毒和禽腺病毒兩個(gè)屬。目前已鑒定的人腺病毒腺病毒的生物學(xué)特性有6個(gè)亞屬，其中常用來(lái)構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人細(xì)胞時(shí)呈裂解型，不致癌；但對(duì)嚙齒目動(dòng)物來(lái)說(shuō)，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。人腺病毒DNA腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，人腺病毒DNA腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因組DNA全長(zhǎng)36kb，其包裝上限為原基因組的105%，DNA兩端各有一個(gè)反向重復(fù)序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子，L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會(huì)影響病毒顆粒的成熟，不影響基因組的復(fù)制功能，因而在構(gòu)建載體時(shí)往往除去這個(gè)2.2kb的片段，使得載體的裝載量提高到4kb以上。人腺病毒DNA腺病毒的基因組DNAITRITRE1E2E3E人腺病毒DNA基因重排低外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個(gè)周期腺病毒DNA載體的特點(diǎn)安全性能好不整合人的染色體DNA，不會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤宿主范圍廣對(duì)受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格使用效果好外源基因在載體上容易高效表達(dá)人腺病毒DNA基因重排低外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)猴多瘤病毒DNA（SV40）

SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40的生物學(xué)特性SV40可以與所有哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。

SV40感染猴細(xì)胞時(shí)呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動(dòng)物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40屬于乳多猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基因組DNAt/T基因編碼病毒的小抗原和大SV40DNAoriVP2TVP3VP1t抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān)

SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時(shí)，每個(gè)宿主細(xì)胞含有105個(gè)病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基因組DNA猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建

重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過(guò)包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40pV2-GPT是一種SV40DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其中g(shù)pt為細(xì)菌來(lái)源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔b-珠蛋白.猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40DNA載體表達(dá)外源基因的程序SV40載體病毒晚期基因啟動(dòng)子篩選標(biāo)記ori缺陷的SV40輔助病毒去除細(xì)菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉(zhuǎn)化篩選增殖感染猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40DNA載體表達(dá)外源猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表達(dá)好外源基因能高效表達(dá)SV40DNA載體的特點(diǎn)基因重排高病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞裝載量較小猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表達(dá)好外源基因能高效表人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨(dú)立于染色體而自人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性主復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個(gè)拷貝人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒（BK人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建BKV-E.coli穿梭載體BKVoriBKVgeneDREMMTPAprE.colioriSV40PNeor刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成穿梭載體，它不能整合，同時(shí)也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。安裝細(xì)胞色素P450dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng)子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動(dòng)子MMTP，由其帶動(dòng)外源基因的表達(dá)。SV40來(lái)源的啟動(dòng)子控制Neor

標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建BKV人牛痘病毒DNA人牛痘病毒是一個(gè)大型DNA病毒，基因組長(zhǎng)185kb，能在宿主細(xì)胞質(zhì)中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建人牛痘病毒的生物學(xué)特性出的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動(dòng)子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外DNA重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。人牛痘病毒DNA人牛痘病毒是一個(gè)大型DNA病毒人牛痘病毒DNA目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒其基因組上插入了一個(gè)可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在人牛痘病毒DNA表達(dá)載體的構(gòu)建外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大量表達(dá)T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動(dòng)子的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞，此時(shí)外源基因整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達(dá)的。人牛痘病毒DNA目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序牛痘病毒啟動(dòng)子T7RNA聚合酶基因T7啟動(dòng)子外源基因細(xì)菌重組質(zhì)粒感染轉(zhuǎn)化培養(yǎng)收集人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序牛痘病毒D高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動(dòng)物基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法D高等哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移8哺乳動(dòng)物基因工程哺乳動(dòng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列，這對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后，往往以多拷貝的形式隨機(jī)整合在染色體DNA上，導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時(shí)DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；此時(shí)細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進(jìn)入受體細(xì)胞；磷酸鈣共沉淀法將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時(shí)棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。如果在外源DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA，可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這是人們對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時(shí)高壓電場(chǎng)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時(shí)電擊轉(zhuǎn)化法常用于對(duì)磷酸鈣共沉淀法無(wú)效的細(xì)胞類型，如生長(zhǎng)在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。電擊轉(zhuǎn)化法DNA片段便可不經(jīng)過(guò)胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。合，DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和HeLa脂質(zhì)體介導(dǎo)法將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會(huì)與受體細(xì)胞膜融細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法通過(guò)激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；性原核內(nèi)。上述程序多用于動(dòng)物個(gè)體的轉(zhuǎn)基因過(guò)程，由于必須單細(xì)胞逐一操顯微注射法借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄作，所以不太適用于基因的克隆和表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法通過(guò)激素療法使雌鼠超數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法

血影細(xì)胞是指哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞同時(shí)，外源DNA也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可恢復(fù)原來(lái)的通透性。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將血影細(xì)胞介導(dǎo)法核結(jié)構(gòu)。在溶血過(guò)程中，紅細(xì)胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法血影細(xì)胞是指哺乳動(dòng)物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無(wú)法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家禽和牲畜細(xì)胞等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法以病毒DNA為載體可以E利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白8哺乳動(dòng)物基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIIIE利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白8哺乳動(dòng)物基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是動(dòng)物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來(lái)的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò)增。這些抗性細(xì)胞正是通過(guò)增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因（DHFR）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時(shí)被擴(kuò)增。哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理基因擴(kuò)增哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因DHFR-MT