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第二章基因工程的工具酶第二章基因工程的工具酶1一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制(restriction)修飾(modification)限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能:自我保護功能(只切外來的DNA,自身DNA被甲基化后切不動)一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制2核酸酶:水解斷裂多核苷酸鏈的兩個相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵核糖核酸酶(RNase):脫氧核糖核酸酶(DNase):核酸外切酶(exonuclease):核酸內(nèi)切酶(endonuclease):限制性核酸內(nèi)切酶:核酸酶:水解斷裂多核苷酸鏈的兩個相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵3二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識別序列特異性非對稱性序列特異性4-8bp旋轉(zhuǎn)對稱序列特異性非對稱性序列切割位點距識別序列1kb處隨機性切割識別序列內(nèi)或附近特異性切割距識別序列下游24-26bp用途無應(yīng)用價值應(yīng)用廣泛無應(yīng)用價值二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III4平末端粘性末端1單位酶活性(1unit1U):在最適反應(yīng)條件下1小時完全切割1ugλDNA樣品的酶量。同序同裂酶(識別及酶切位點相同):同序異裂酶(識別位點相同但酶切位點不同):同尾酶(酶切位點不同但產(chǎn)生相同的粘性末端):平末端5酶切位點的計算:四核苷酸識別序列:44=256六核苷酸識別序列:46=40962個假設(shè):a隨機排列;bGC含量50%如:用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb):理論上的切點數(shù):49000/4096=12個實際情況?酶切位點的計算:四核苷酸識別序列:44=2566三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年H.Smith和D.Nathans提議①每一種酶都由產(chǎn)生并純化生出該酶的細菌的種屬名中的三個英文字母合起來代表:第一個字母采用細菌屬名的第一個字母大寫;第二和第三個字母小寫,采用細菌種名的前兩個字母;如大腸桿菌(Escherichiacoli)用Eco表示,代表從大腸桿菌中分離出的限制性內(nèi)切酶。②第四個字母表示菌株的類型(大小寫均有),如EcoR中的R代表大腸桿菌R株。③如果一個菌株有幾種限制酶,則在代表菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年H.Smith和D.Na7思考題:流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d菌株有三種限制酶,分別怎么表示?HindI、HindII、HindIIIBaciUusamyloliquefaciensH
StreptomycesalbusI思考題:HindI、HindII、HindIIIBaciU8一、天然DNA的制備
1、天然DNA的來源①染色體DNA②病毒和噬菌體DNA③質(zhì)粒DNA④線粒體和葉綠體DNA第二節(jié)DNA分子片段化一、天然DNA的制備1、天然DNA的來源第二節(jié)DNA92、天然DNA的提取
①準備生物材料。②裂解細胞。③分離和抽提DNA。2、天然DNA的提?、贉蕚渖锊牧稀?0二、DNA的純化
瓊脂糖凝膠電泳洗脫法適用于小劑量DNA的純化和酶切DNA片段的回收。二、DNA的純化瓊脂糖凝膠電泳洗脫法11三、
DNA的濃縮
乙醇沉淀法在含一價陽離子的DNA溶液中加入2體積的無水乙醇,使DNA沉淀(-20℃,時間在30min以上)通過離心收集沉淀的DNA溶于適量的TE緩沖液或無菌水中三、DNA的濃縮乙醇沉淀法12四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)1、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液
四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)1、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液132、單酶切法
若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子,完全酶切后,產(chǎn)生與識別序列數(shù)(n)相同的DNA片段數(shù),并且DNA片段的兩末端相同
若DNA樣品本來就是線形
DNA片段,完全酶切的結(jié)果,產(chǎn)生n+1個
DNA片段數(shù),其中有兩個片段的一端仍保留原來的末端
2、單酶切法若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子,完全酶切后,產(chǎn)14
3、雙酶切法
應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割,然后調(diào)節(jié)緩沖液的鹽濃度,再加入需要較高鹽濃度緩沖液的酶進行切割。如果兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同,則應(yīng)先用最適反應(yīng)溫度較低的酶進行切割,升溫后再加入第二種酶進行切割。若兩種限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)系統(tǒng)相差很大,會明顯影響雙酶切結(jié)果,則可以在第一種酶切割后,經(jīng)過凝膠電泳回收需要的DNA片段,再選用合適的反應(yīng)系統(tǒng),進行第二種限制性核酸內(nèi)切酶的切割。3、雙酶切法應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割154、部分酶切
當某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNA分子上有多個識別序列,并且其中一個識別序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上,若完全酶切,勢必將此待用的DNA片段從中切斷。在此情況下,對DNA樣品進行部分酶切,經(jīng)過凝膠電泳,根據(jù)待用DNA片段的大小,可回收待用的DNA片段
4、部分酶切當某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNA分165、DNA分子的限制性圖譜5、DNA分子的限制性圖譜17五
、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(1)DNA的純度(2)DNA的甲基化程度(3)酶切消化反應(yīng)的溫度(4)DNA的分子結(jié)構(gòu)
(5)星星活性
五、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(1)DNA的純度18第三節(jié)DNA聚合酶
第三節(jié)DNA聚合酶19一、DNA聚合酶概述DNA聚合酶(polymerase):以DNA或RNA為模板催化合成互補新鏈的酶。大多需要一個引物來起始互補新鏈的合成。
一、DNA聚合酶概述20
間斷(discontinuity):在DNA的一條鏈上某一位置兩個相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。缺刻(nick):某一位置上丟失了一個或幾個核苷酸。
間斷(discontinuity):在DNA的一條鏈上21(1)以DNA聚合酶I為代表的“合成型”
(2)以klenow聚合酶為代表,只有聚合酶活性和部分外切酶的活性
(3)逆轉(zhuǎn)錄酶類,以RNA作為聚合模板根據(jù)模板和作用方式的不同分為三類:(1)以DNA聚合酶I為代表的“合成型”
(2)以kleno22二、大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)1、性質(zhì):①5’→3’DNA聚合酶活性②3’→5’外切核酸酶活性③5’→3’外切核酸酶活性二、大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)1、性質(zhì):23三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段
(Klenow片段)
1、性質(zhì)
它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段
(Klenow片段)24四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA的作用更強。它的外切核酸酶活性比kenow片段要強200倍。2、用途1)補平或標記限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的3’凹端。2)對帶有3’突出端的DNA分子進行末端標記。四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)2、用途25五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)持續(xù)合成能力最強3’→5’外切核酸酶活性為klenow片段的1000倍沒有5’→3’外切酶活性。2、主要用途1)用于拷貝長段模板的引物延伸反應(yīng)。2)通過補平或交換(置換)反應(yīng)進行快速末端標記。五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)26六、TaqDNA聚合酶
具有5’→3’外切核酸酶活性。最佳作用溫度為75-80℃。無3’
→5’外切核酸酶活性,糾錯功能較差。用途
1)可使特定序列擴增106倍。2)用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR),對DNA片段進行體外擴增。六、TaqDNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活27七、逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)
依賴于RNA的DNA聚合酶商品化逆轉(zhuǎn)錄酶:①禽源反轉(zhuǎn)錄酶(AMV),②鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(Mo—MLV)反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性:以RNA為模板聚合cDNA鏈
雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈七、逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)28第四節(jié)PCR反應(yīng)及應(yīng)用PCR(PolymeraseChainReaction)稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴增技術(shù),是一種高效快速的體外DNA聚合程序。具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、對標本的純度要求低等特點。第四節(jié)PCR反應(yīng)及應(yīng)用PCR(PolymeraseCha29變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C基本反應(yīng)步驟變性延伸退火基本反應(yīng)步驟30
PCR技術(shù)的特點
高特異性
高靈敏度
簡便快速
低純度標本也可使用PCR技術(shù)的特點
高特異性
高靈敏度
簡便快速31第五節(jié)
DNA連接酶(ligase)
第五節(jié)DNA連接酶(ligase)32DNA連接酶:將兩個DNA片段通過催化形成3’,5’-磷酸二酯鍵而連接起來的酶。T4
DNA連接酶:可連接DNA鏈(平粘端均可),也可連RNA鏈,應(yīng)用廣泛。E.coliDNA連接酶:平端連接效率遠低于T4DNA連接酶,不能連接RNA分子。T4
RNA連接酶:可催化兩個單鏈DNA或RNA分子的連接。DNA連接酶:將兩個DNA片段通過催化形成3’,5’-磷酸二33一、連接酶功能1、間斷修復(fù)功能2、連接功能一、連接酶功能34三、粘性末端連接技術(shù)1、銜接體(linker)技術(shù)2、結(jié)合體(adaptor)技術(shù)3、同聚體(homopolymer)加尾技術(shù)三、粘性末端連接技術(shù)1、銜接體(linker)35第六節(jié)結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用
—AFLP第六節(jié)結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用
—AFLP36AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)AFLP一詞是1991年Gustavo提出的;該方法結(jié)合了RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)技術(shù)和RAPD技術(shù)的特點;使用人工接頭(Adaptor)與限制性內(nèi)切酶酶切的基因組DNA片段連接并以此為DNA模板,合成系列3`—末端隨機變化數(shù)個堿基且與人工接頭序列相互補的PCR引物,來進行PCR特異條帶擴增,經(jīng)電泳檢測后可獲得DNA指紋圖譜。AFLP37此項技術(shù)優(yōu)點(1)穩(wěn)定,重復(fù)性好;(2)需用的DNA量少,適用于分析的DNA大小范圍寬;(3)能產(chǎn)生更多的多態(tài)性標志,得到的條帶也更密集,一般比RFLP和RAPD多10~100倍,便于比較分析;(4)操作易于標準化和自動化,適于大批量的樣品分析。第二章基因工程工具酶(簡化版)課件38
第七節(jié)基因工程的其它酶類第七節(jié)基因工程的其它酶類39一、DNA及RNA的修飾酶(一)未端(脫氧核苷酸)轉(zhuǎn)移酶(二)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)(三)多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)一、DNA及RNA的修飾酶(二)堿性磷酸酶(alkaline40二、單鏈核酸內(nèi)切酶(一)S1核酸酶(二)Bal31核酸酶二、單鏈核酸內(nèi)切酶(一)S1核酸酶41
核酸外切酶底物切割位點大腸桿菌核酸外切酶ⅠssDNA5’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅢdsDNA3’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅤDNA3’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅦssDNA
3’末端,5’P末端λ噬菌體λ核酸外切酶dsDNA5’P末端T7噬菌體核酸外切酶dsDNA5’P末端三、核酸外切酶(exonucleases)核酸外切酶底物42本章復(fù)習(xí)要點限制性內(nèi)切酶三種類型酶及各自特征;II型酶的相關(guān)概念;酶切位點的估算;酶切反應(yīng)。DNA聚合酶
DNA聚合酶I、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶及Taq酶各自的作用特點及用途;PCR的作用原理及幾種延伸技術(shù)。DNA連接酶
T4DNA連接酶的作用特點;銜接體、人工接頭及同聚物加尾三種技術(shù)的原理;AFLP技術(shù)的原理。其它工具酶末端轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶及T4多聚核苷酸激酶的特點及用途。本章復(fù)習(xí)要點限制性內(nèi)切酶43第二章基因工程的工具酶第二章基因工程的工具酶44一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制(restriction)修飾(modification)限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能:自我保護功能(只切外來的DNA,自身DNA被甲基化后切不動)一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制45核酸酶:水解斷裂多核苷酸鏈的兩個相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵核糖核酸酶(RNase):脫氧核糖核酸酶(DNase):核酸外切酶(exonuclease):核酸內(nèi)切酶(endonuclease):限制性核酸內(nèi)切酶:核酸酶:水解斷裂多核苷酸鏈的兩個相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵46二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識別序列特異性非對稱性序列特異性4-8bp旋轉(zhuǎn)對稱序列特異性非對稱性序列切割位點距識別序列1kb處隨機性切割識別序列內(nèi)或附近特異性切割距識別序列下游24-26bp用途無應(yīng)用價值應(yīng)用廣泛無應(yīng)用價值二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III47平末端粘性末端1單位酶活性(1unit1U):在最適反應(yīng)條件下1小時完全切割1ugλDNA樣品的酶量。同序同裂酶(識別及酶切位點相同):同序異裂酶(識別位點相同但酶切位點不同):同尾酶(酶切位點不同但產(chǎn)生相同的粘性末端):平末端48酶切位點的計算:四核苷酸識別序列:44=256六核苷酸識別序列:46=40962個假設(shè):a隨機排列;bGC含量50%如:用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb):理論上的切點數(shù):49000/4096=12個實際情況?酶切位點的計算:四核苷酸識別序列:44=25649三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年H.Smith和D.Nathans提議①每一種酶都由產(chǎn)生并純化生出該酶的細菌的種屬名中的三個英文字母合起來代表:第一個字母采用細菌屬名的第一個字母大寫;第二和第三個字母小寫,采用細菌種名的前兩個字母;如大腸桿菌(Escherichiacoli)用Eco表示,代表從大腸桿菌中分離出的限制性內(nèi)切酶。②第四個字母表示菌株的類型(大小寫均有),如EcoR中的R代表大腸桿菌R株。③如果一個菌株有幾種限制酶,則在代表菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年H.Smith和D.Na50思考題:流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d菌株有三種限制酶,分別怎么表示?HindI、HindII、HindIIIBaciUusamyloliquefaciensH
StreptomycesalbusI思考題:HindI、HindII、HindIIIBaciU51一、天然DNA的制備
1、天然DNA的來源①染色體DNA②病毒和噬菌體DNA③質(zhì)粒DNA④線粒體和葉綠體DNA第二節(jié)DNA分子片段化一、天然DNA的制備1、天然DNA的來源第二節(jié)DNA522、天然DNA的提取
①準備生物材料。②裂解細胞。③分離和抽提DNA。2、天然DNA的提?、贉蕚渖锊牧?。53二、DNA的純化
瓊脂糖凝膠電泳洗脫法適用于小劑量DNA的純化和酶切DNA片段的回收。二、DNA的純化瓊脂糖凝膠電泳洗脫法54三、
DNA的濃縮
乙醇沉淀法在含一價陽離子的DNA溶液中加入2體積的無水乙醇,使DNA沉淀(-20℃,時間在30min以上)通過離心收集沉淀的DNA溶于適量的TE緩沖液或無菌水中三、DNA的濃縮乙醇沉淀法55四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)1、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液
四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)1、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液562、單酶切法
若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子,完全酶切后,產(chǎn)生與識別序列數(shù)(n)相同的DNA片段數(shù),并且DNA片段的兩末端相同
若DNA樣品本來就是線形
DNA片段,完全酶切的結(jié)果,產(chǎn)生n+1個
DNA片段數(shù),其中有兩個片段的一端仍保留原來的末端
2、單酶切法若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子,完全酶切后,產(chǎn)57
3、雙酶切法
應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割,然后調(diào)節(jié)緩沖液的鹽濃度,再加入需要較高鹽濃度緩沖液的酶進行切割。如果兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同,則應(yīng)先用最適反應(yīng)溫度較低的酶進行切割,升溫后再加入第二種酶進行切割。若兩種限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)系統(tǒng)相差很大,會明顯影響雙酶切結(jié)果,則可以在第一種酶切割后,經(jīng)過凝膠電泳回收需要的DNA片段,再選用合適的反應(yīng)系統(tǒng),進行第二種限制性核酸內(nèi)切酶的切割。3、雙酶切法應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割584、部分酶切
當某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNA分子上有多個識別序列,并且其中一個識別序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上,若完全酶切,勢必將此待用的DNA片段從中切斷。在此情況下,對DNA樣品進行部分酶切,經(jīng)過凝膠電泳,根據(jù)待用DNA片段的大小,可回收待用的DNA片段
4、部分酶切當某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNA分595、DNA分子的限制性圖譜5、DNA分子的限制性圖譜60五
、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(1)DNA的純度(2)DNA的甲基化程度(3)酶切消化反應(yīng)的溫度(4)DNA的分子結(jié)構(gòu)
(5)星星活性
五、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(1)DNA的純度61第三節(jié)DNA聚合酶
第三節(jié)DNA聚合酶62一、DNA聚合酶概述DNA聚合酶(polymerase):以DNA或RNA為模板催化合成互補新鏈的酶。大多需要一個引物來起始互補新鏈的合成。
一、DNA聚合酶概述63
間斷(discontinuity):在DNA的一條鏈上某一位置兩個相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。缺刻(nick):某一位置上丟失了一個或幾個核苷酸。
間斷(discontinuity):在DNA的一條鏈上64(1)以DNA聚合酶I為代表的“合成型”
(2)以klenow聚合酶為代表,只有聚合酶活性和部分外切酶的活性
(3)逆轉(zhuǎn)錄酶類,以RNA作為聚合模板根據(jù)模板和作用方式的不同分為三類:(1)以DNA聚合酶I為代表的“合成型”
(2)以kleno65二、大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)1、性質(zhì):①5’→3’DNA聚合酶活性②3’→5’外切核酸酶活性③5’→3’外切核酸酶活性二、大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)1、性質(zhì):66三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段
(Klenow片段)
1、性質(zhì)
它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段
(Klenow片段)67四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA的作用更強。它的外切核酸酶活性比kenow片段要強200倍。2、用途1)補平或標記限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的3’凹端。2)對帶有3’突出端的DNA分子進行末端標記。四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)2、用途68五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)持續(xù)合成能力最強3’→5’外切核酸酶活性為klenow片段的1000倍沒有5’→3’外切酶活性。2、主要用途1)用于拷貝長段模板的引物延伸反應(yīng)。2)通過補平或交換(置換)反應(yīng)進行快速末端標記。五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)69六、TaqDNA聚合酶
具有5’→3’外切核酸酶活性。最佳作用溫度為75-80℃。無3’
→5’外切核酸酶活性,糾錯功能較差。用途
1)可使特定序列擴增106倍。2)用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR),對DNA片段進行體外擴增。六、TaqDNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活70七、逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)
依賴于RNA的DNA聚合酶商品化逆轉(zhuǎn)錄酶:①禽源反轉(zhuǎn)錄酶(AMV),②鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(Mo—MLV)反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性:以RNA為模板聚合cDNA鏈
雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈七、逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)71第四節(jié)PCR反應(yīng)及應(yīng)用PCR(PolymeraseChainReaction)稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴增技術(shù),是一種高效快速的體外DNA聚合程序。具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、對標本的純度要求低等特點。第四節(jié)PCR反應(yīng)及應(yīng)用PCR(PolymeraseCha72變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C基本反應(yīng)步驟變性延伸退火基本反應(yīng)步驟73
PCR技術(shù)的特點
高特異性
高靈敏度
簡便快速
低純度標本也可使用PCR技術(shù)的特點
高特異性
高靈敏度
簡便快速74第五節(jié)
DNA連接酶(ligase)
第五節(jié)DNA連接酶(ligase)75DNA連接酶:將兩個DNA片段通過催化形成3’,5’-磷酸二酯鍵而連接起來的酶。T4
DNA連接酶:可連接DNA鏈(平粘端均可),也可連RNA鏈,應(yīng)用廣泛。E.coliDNA連接酶:平端連接效率遠低于T4DNA連接酶,不能連接RNA分子。T4
RNA連接酶:可催化兩個單鏈DNA或RNA分子的連接。DNA連接酶:將兩個DNA片段通過催化形成3’,5’-磷酸二76一、連接酶功能1、間斷修復(fù)功能2、連接功能一、連接酶功能77三、粘性末端連接技術(shù)1、銜接體(linker)技術(shù)2、結(jié)合體(adaptor)技術(shù)3、同聚體(homopolymer)加尾技術(shù)三、粘性末端連接技術(shù)1、銜接體(linker)78第六節(jié)結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用
—AFLP第六節(jié)結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用
—AFLP79AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)AFLP一詞是1991年Gustavo提出的;該方法結(jié)合了RFLP(restrictionfragmentleng
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