第二章基因工程工具酶(簡化版)課件

第二章基因工程的工具酶第二章基因工程的工具酶1一、限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內切酶限制(restriction)修飾(modification)限制性核酸內切酶的生物學功能：自我保護功能(只切外來的DNA，自身DNA被甲基化后切不動)一、限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內切酶限制2核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵核糖核酸酶（RNase）：脫氧核糖核酸酶（DNase）：核酸外切酶（exonuclease）：核酸內切酶（endonuclease）：限制性核酸內切酶：核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵3二、限制性核酸內切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識別序列特異性非對稱性序列特異性4-8bp旋轉對稱序列特異性非對稱性序列切割位點距識別序列1kb處隨機性切割識別序列內或附近特異性切割距識別序列下游24-26bp用途無應用價值應用廣泛無應用價值二、限制性核酸內切酶的分類主要特性I型II型III4平末端粘性末端1單位酶活性(1unit1U)：在最適反應條件下1小時完全切割1ugλDNA樣品的酶量。同序同裂酶(識別及酶切位點相同):同序異裂酶(識別位點相同但酶切位點不同):同尾酶(酶切位點不同但產生相同的粘性末端):平末端5酶切位點的計算：四核苷酸識別序列：44=256六核苷酸識別序列：46=40962個假設：a隨機排列；bGC含量50%如：用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb）:理論上的切點數(shù)：49000/4096=12個實際情況？酶切位點的計算：四核苷酸識別序列：44=2566三、限制性核酸內切酶的命名1973年H.Smith和D.Nathans提議①每一種酶都由產生并純化生出該酶的細菌的種屬名中的三個英文字母合起來代表：第一個字母采用細菌屬名的第一個字母大寫；第二和第三個字母小寫，采用細菌種名的前兩個字母；如大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示，代表從大腸桿菌中分離出的限制性內切酶。②第四個字母表示菌株的類型（大小寫均有），如EcoR中的R代表大腸桿菌R株。③如果一個菌株有幾種限制酶，則在代表菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。三、限制性核酸內切酶的命名1973年H.Smith和D.Na7思考題：流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）d菌株有三種限制酶，分別怎么表示？HindI、HindII、HindIIIBaciUusamyloliquefaciensH

StreptomycesalbusI思考題：HindI、HindII、HindIIIBaciU8一、天然DNA的制備

1、天然DNA的來源①染色體DNA②病毒和噬菌體DNA③質粒DNA④線粒體和葉綠體DNA第二節(jié)DNA分子片段化一、天然DNA的制備1、天然DNA的來源第二節(jié)DNA92、天然DNA的提取

①準備生物材料。②裂解細胞。③分離和抽提DNA。2、天然DNA的提?、贉蕚渖锊牧?。10二、DNA的純化

瓊脂糖凝膠電泳洗脫法適用于小劑量DNA的純化和酶切DNA片段的回收。二、DNA的純化瓊脂糖凝膠電泳洗脫法11三、

DNA的濃縮

乙醇沉淀法在含一價陽離子的DNA溶液中加入2體積的無水乙醇，使DNA沉淀（-20℃，時間在30min以上）通過離心收集沉淀的DNA溶于適量的TE緩沖液或無菌水中三、DNA的濃縮乙醇沉淀法12四、限制性核酸內切酶反應1、限制性核酸內切酶反應緩沖液

四、限制性核酸內切酶反應1、限制性核酸內切酶反應緩沖液132、單酶切法

若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產生與識別序列數(shù)（n）相同的DNA片段數(shù)，并且DNA片段的兩末端相同

若DNA樣品本來就是線形

DNA片段，完全酶切的結果，產生n＋1個

DNA片段數(shù)，其中有兩個片段的一端仍保留原來的末端

2、單酶切法若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產14

3、雙酶切法

應先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割，然后調節(jié)緩沖液的鹽濃度，再加入需要較高鹽濃度緩沖液的酶進行切割。如果兩種限制性核酸內切酶的最適反應溫度不同，則應先用最適反應溫度較低的酶進行切割，升溫后再加入第二種酶進行切割。若兩種限制性核酸內切酶的反應系統(tǒng)相差很大，會明顯影響雙酶切結果，則可以在第一種酶切割后，經過凝膠電泳回收需要的DNA片段，再選用合適的反應系統(tǒng)，進行第二種限制性核酸內切酶的切割。3、雙酶切法應先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割154、部分酶切

當某種限制性核酸內切酶在待切割的DNA分子上有多個識別序列，并且其中一個識別序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上，若完全酶切，勢必將此待用的DNA片段從中切斷。在此情況下，對DNA樣品進行部分酶切，經過凝膠電泳，根據待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段

4、部分酶切當某種限制性核酸內切酶在待切割的DNA分165、DNA分子的限制性圖譜5、DNA分子的限制性圖譜17五

、影響核酸內切限制酶活性的因素（1）DNA的純度（2）DNA的甲基化程度（3）酶切消化反應的溫度（4）DNA的分子結構

（5）星星活性

五、影響核酸內切限制酶活性的因素（1）DNA的純度18第三節(jié)DNA聚合酶

第三節(jié)DNA聚合酶19一、DNA聚合酶概述DNA聚合酶（polymerase）：以DNA或RNA為模板催化合成互補新鏈的酶。大多需要一個引物來起始互補新鏈的合成。

一、DNA聚合酶概述20

間斷(discontinuity)：在DNA的一條鏈上某一位置兩個相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。缺刻(nick)：某一位置上丟失了一個或幾個核苷酸。

間斷(discontinuity)：在DNA的一條鏈上21（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”

（2）以klenow聚合酶為代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性

（3）逆轉錄酶類，以RNA作為聚合模板根據模板和作用方式的不同分為三類：（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”

（2）以kleno22二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1、性質:①5’→3’DNA聚合酶活性②3’→5’外切核酸酶活性③5’→3’外切核酸酶活性二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1、性質:23三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段

（Klenow片段）

1、性質

它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段

（Klenow片段）24四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA的作用更強。它的外切核酸酶活性比kenow片段要強200倍。2、用途1）補平或標記限制性內切酶消化DNA后產生的3’凹端。2）對帶有3’突出端的DNA分子進行末端標記。四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質2、用途25五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質持續(xù)合成能力最強3’→5’外切核酸酶活性為klenow片段的1000倍沒有5’→3’外切酶活性。2、主要用途1）用于拷貝長段模板的引物延伸反應。2）通過補平或交換（置換）反應進行快速末端標記。五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質26六、TaqDNA聚合酶

具有5’→3’外切核酸酶活性。最佳作用溫度為75-80℃。無3’

→5’外切核酸酶活性，糾錯功能較差。用途

1）可使特定序列擴增106倍。2）用于聚合酶鏈式反應（PCR），對DNA片段進行體外擴增。六、TaqDNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活27七、逆轉錄酶（reversetranscriptase）

依賴于RNA的DNA聚合酶商品化逆轉錄酶：①禽源反轉錄酶（AMV），②鼠源反轉錄酶（Mo—MLV）反轉錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈

雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈七、逆轉錄酶（reversetranscriptase）28第四節(jié)PCR反應及應用PCR（PolymeraseChainReaction）稱為聚合酶鏈反應或PCR擴增技術，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、對標本的純度要求低等特點。第四節(jié)PCR反應及應用PCR（PolymeraseCha29變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C基本反應步驟變性延伸退火基本反應步驟30

PCR技術的特點

高特異性

高靈敏度

簡便快速

低純度標本也可使用PCR技術的特點

高特異性

高靈敏度

簡便快速31第五節(jié)

DNA連接酶（ligase）

第五節(jié)DNA連接酶（ligase）32DNA連接酶：將兩個DNA片段通過催化形成3’，5’－磷酸二酯鍵而連接起來的酶。T4

DNA連接酶：可連接DNA鏈（平粘端均可），也可連RNA鏈，應用廣泛。E.coliDNA連接酶：平端連接效率遠低于T4DNA連接酶，不能連接RNA分子。T4

RNA連接酶：可催化兩個單鏈DNA或RNA分子的連接。DNA連接酶：將兩個DNA片段通過催化形成3’，5’－磷酸二33一、連接酶功能1、間斷修復功能2、連接功能一、連接酶功能34三、粘性末端連接技術1、銜接體(linker)技術2、結合體(adaptor)技術3、同聚體(homopolymer)加尾技術三、粘性末端連接技術1、銜接體(linker)35第六節(jié)結合體技術的應用

—AFLP第六節(jié)結合體技術的應用

—AFLP36AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）AFLP一詞是1991年Gustavo提出的;該方法結合了RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)技術和RAPD技術的特點;使用人工接頭（Adaptor）與限制性內切酶酶切的基因組DNA片段連接并以此為DNA模板，合成系列3`—末端隨機變化數(shù)個堿基且與人工接頭序列相互補的PCR引物，來進行PCR特異條帶擴增，經電泳檢測后可獲得DNA指紋圖譜。AFLP37此項技術優(yōu)點（1）穩(wěn)定，重復性好；（2）需用的DNA量少，適用于分析的DNA大小范圍寬；（3）能產生更多的多態(tài)性標志，得到的條帶也更密集，一般比RFLP和RAPD多10～100倍，便于比較分析；（4）操作易于標準化和自動化，適于大批量的樣品分析。第二章基因工程工具酶(簡化版)課件38

第七節(jié)基因工程的其它酶類第七節(jié)基因工程的其它酶類39一、DNA及RNA的修飾酶（一）未端（脫氧核苷酸）轉移酶（二）堿性磷酸酶(alkalinephosphatase）（三）多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)一、DNA及RNA的修飾酶（二）堿性磷酸酶(alkaline40二、單鏈核酸內切酶（一）S1核酸酶（二）Bal31核酸酶二、單鏈核酸內切酶（一）S1核酸酶41

核酸外切酶底物切割位點大腸桿菌核酸外切酶ⅠssDNA5’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅢdsDNA3’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅤDNA3’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅦssDNA

3’末端，5’P末端λ噬菌體λ核酸外切酶dsDNA5’P末端T7噬菌體核酸外切酶dsDNA5’P末端三、核酸外切酶(exonucleases)核酸外切酶底物42本章復習要點限制性內切酶三種類型酶及各自特征；II型酶的相關概念；酶切位點的估算；酶切反應。DNA聚合酶

DNA聚合酶I、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反轉錄酶及Taq酶各自的作用特點及用途；PCR的作用原理及幾種延伸技術。DNA連接酶

T4DNA連接酶的作用特點；銜接體、人工接頭及同聚物加尾三種技術的原理；AFLP技術的原理。其它工具酶末端轉移酶、磷酸酶及T4多聚核苷酸激酶的特點及用途。本章復習要點限制性內切酶43第二章基因工程的工具酶第二章基因工程的工具酶44一、限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內切酶限制(restriction)修飾(modification)限制性核酸內切酶的生物學功能：自我保護功能(只切外來的DNA，自身DNA被甲基化后切不動)一、限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內切酶限制45核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵核糖核酸酶（RNase）：脫氧核糖核酸酶（DNase）：核酸外切酶（exonuclease）：核酸內切酶（endonuclease）：限制性核酸內切酶：核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵46二、限制性核酸內切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識別序列特異性非對稱性序列特異性4-8bp旋轉對稱序列特異性非對稱性序列切割位點距識別序列1kb處隨機性切割識別序列內或附近特異性切割距識別序列下游24-26bp用途無應用價值應用廣泛無應用價值二、限制性核酸內切酶的分類主要特性I型II型III47平末端粘性末端1單位酶活性(1unit1U)：在最適反應條件下1小時完全切割1ugλDNA樣品的酶量。同序同裂酶(識別及酶切位點相同):同序異裂酶(識別位點相同但酶切位點不同):同尾酶(酶切位點不同但產生相同的粘性末端):平末端48酶切位點的計算：四核苷酸識別序列：44=256六核苷酸識別序列：46=40962個假設：a隨機排列；bGC含量50%如：用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb）:理論上的切點數(shù)：49000/4096=12個實際情況？酶切位點的計算：四核苷酸識別序列：44=25649三、限制性核酸內切酶的命名1973年H.Smith和D.Nathans提議①每一種酶都由產生并純化生出該酶的細菌的種屬名中的三個英文字母合起來代表：第一個字母采用細菌屬名的第一個字母大寫；第二和第三個字母小寫，采用細菌種名的前兩個字母；如大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示，代表從大腸桿菌中分離出的限制性內切酶。②第四個字母表示菌株的類型（大小寫均有），如EcoR中的R代表大腸桿菌R株。③如果一個菌株有幾種限制酶，則在代表菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。三、限制性核酸內切酶的命名1973年H.Smith和D.Na50思考題：流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）d菌株有三種限制酶，分別怎么表示？HindI、HindII、HindIIIBaciUusamyloliquefaciensH

StreptomycesalbusI思考題：HindI、HindII、HindIIIBaciU51一、天然DNA的制備

1、天然DNA的來源①染色體DNA②病毒和噬菌體DNA③質粒DNA④線粒體和葉綠體DNA第二節(jié)DNA分子片段化一、天然DNA的制備1、天然DNA的來源第二節(jié)DNA522、天然DNA的提取

①準備生物材料。②裂解細胞。③分離和抽提DNA。2、天然DNA的提?、贉蕚渖锊牧稀?3二、DNA的純化

瓊脂糖凝膠電泳洗脫法適用于小劑量DNA的純化和酶切DNA片段的回收。二、DNA的純化瓊脂糖凝膠電泳洗脫法54三、

DNA的濃縮

乙醇沉淀法在含一價陽離子的DNA溶液中加入2體積的無水乙醇，使DNA沉淀（-20℃，時間在30min以上）通過離心收集沉淀的DNA溶于適量的TE緩沖液或無菌水中三、DNA的濃縮乙醇沉淀法55四、限制性核酸內切酶反應1、限制性核酸內切酶反應緩沖液

四、限制性核酸內切酶反應1、限制性核酸內切酶反應緩沖液562、單酶切法

若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產生與識別序列數(shù)（n）相同的DNA片段數(shù)，并且DNA片段的兩末端相同

若DNA樣品本來就是線形

DNA片段，完全酶切的結果，產生n＋1個

DNA片段數(shù)，其中有兩個片段的一端仍保留原來的末端

2、單酶切法若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產57

3、雙酶切法

應先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割，然后調節(jié)緩沖液的鹽濃度，再加入需要較高鹽濃度緩沖液的酶進行切割。如果兩種限制性核酸內切酶的最適反應溫度不同，則應先用最適反應溫度較低的酶進行切割，升溫后再加入第二種酶進行切割。若兩種限制性核酸內切酶的反應系統(tǒng)相差很大，會明顯影響雙酶切結果，則可以在第一種酶切割后，經過凝膠電泳回收需要的DNA片段，再選用合適的反應系統(tǒng)，進行第二種限制性核酸內切酶的切割。3、雙酶切法應先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進行切割584、部分酶切

當某種限制性核酸內切酶在待切割的DNA分子上有多個識別序列，并且其中一個識別序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上，若完全酶切，勢必將此待用的DNA片段從中切斷。在此情況下，對DNA樣品進行部分酶切，經過凝膠電泳，根據待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段

4、部分酶切當某種限制性核酸內切酶在待切割的DNA分595、DNA分子的限制性圖譜5、DNA分子的限制性圖譜60五

、影響核酸內切限制酶活性的因素（1）DNA的純度（2）DNA的甲基化程度（3）酶切消化反應的溫度（4）DNA的分子結構

（5）星星活性

五、影響核酸內切限制酶活性的因素（1）DNA的純度61第三節(jié)DNA聚合酶

第三節(jié)DNA聚合酶62一、DNA聚合酶概述DNA聚合酶（polymerase）：以DNA或RNA為模板催化合成互補新鏈的酶。大多需要一個引物來起始互補新鏈的合成。

一、DNA聚合酶概述63

間斷(discontinuity)：在DNA的一條鏈上某一位置兩個相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。缺刻(nick)：某一位置上丟失了一個或幾個核苷酸。

間斷(discontinuity)：在DNA的一條鏈上64（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”

（2）以klenow聚合酶為代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性

（3）逆轉錄酶類，以RNA作為聚合模板根據模板和作用方式的不同分為三類：（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”

（2）以kleno65二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1、性質:①5’→3’DNA聚合酶活性②3’→5’外切核酸酶活性③5’→3’外切核酸酶活性二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1、性質:66三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段

（Klenow片段）

1、性質

它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段

（Klenow片段）67四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA的作用更強。它的外切核酸酶活性比kenow片段要強200倍。2、用途1）補平或標記限制性內切酶消化DNA后產生的3’凹端。2）對帶有3’突出端的DNA分子進行末端標記。四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質2、用途68五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質持續(xù)合成能力最強3’→5’外切核酸酶活性為klenow片段的1000倍沒有5’→3’外切酶活性。2、主要用途1）用于拷貝長段模板的引物延伸反應。2）通過補平或交換（置換）反應進行快速末端標記。五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質69六、TaqDNA聚合酶

具有5’→3’外切核酸酶活性。最佳作用溫度為75-80℃。無3’

→5’外切核酸酶活性，糾錯功能較差。用途

1）可使特定序列擴增106倍。2）用于聚合酶鏈式反應（PCR），對DNA片段進行體外擴增。六、TaqDNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活70七、逆轉錄酶（reversetranscriptase）

依賴于RNA的DNA聚合酶商品化逆轉錄酶：①禽源反轉錄酶（AMV），②鼠源反轉錄酶（Mo—MLV）反轉錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈

雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈七、逆轉錄酶（reversetranscriptase）71第四節(jié)PCR反應及應用PCR（PolymeraseChainReaction）稱為聚合酶鏈反應或PCR擴增技術，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、對標本的純度要求低等特點。第四節(jié)PCR反應及應用PCR（PolymeraseCha72變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C基本反應步驟變性延伸退火基本反應步驟73

PCR技術的特點

高特異性

高靈敏度

簡便快速

低純度標本也可使用PCR技術的特點

高特異性

高靈敏度

簡便快速74第五節(jié)

DNA連接酶（ligase）

第五節(jié)DNA連接酶（ligase）75DNA連接酶：將兩個DNA片段通過催化形成3’，5’－磷酸二酯鍵而連接起來的酶。T4

DNA連接酶：可連接DNA鏈（平粘端均可），也可連RNA鏈，應用廣泛。E.coliDNA連接酶：平端連接效率遠低于T4DNA連接酶，不能連接RNA分子。T4

RNA連接酶：可催化兩個單鏈DNA或RNA分子的連接。DNA連接酶：將兩個DNA片段通過催化形成3’，5’－磷酸二76一、連接酶功能1、間斷修復功能2、連接功能一、連接酶功能77三、粘性末端連接技術1、銜接體(linker)技術2、結合體(adaptor)技術3、同聚體(homopolymer)加尾技術三、粘性末端連接技術1、銜接體(linker)78第六節(jié)結合體技術的應用

—AFLP第六節(jié)結合體技術的應用

—AFLP79AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）AFLP一詞是1991年Gustavo提出的;該方法結合了RFLP(restrictionfragmentleng