免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能總結(jié)

關(guān)于免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能總結(jié)第一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1、定義用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）技術(shù)。第二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日2、原理根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理,組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，最后通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光來(lái)顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。第三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日常用的標(biāo)記物有熒光素、酶和放射性同位素：標(biāo)記熒光素的稱為免疫熒光法，常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(rhodamine)等。標(biāo)記酶的稱為免疫酶法，常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase)等。標(biāo)記同位素的稱為放射免疫法，常用的同位素有3H、14C、32S和31P等。第四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

二、免疫酶/免疫熒光三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、石蠟切片/冰凍切片講解提綱第五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（1）石蠟切片的制作

蒸餾水洗滌2遍二甲苯約20min、二甲苯/石蠟(1:1)30min,純蠟Ⅰ、Ⅱ各30min常規(guī)石蠟切片，切片厚度為7μm50％、70％、80％酒精各15min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ各15min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ各15min，無(wú)水乙醇/二甲苯(1:1)15min于干凈載玻片上進(jìn)行展片，37℃烤干取材、固定酒精脫水洗滌展片、烤片包埋、切片透明、浸蠟第六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮、準(zhǔn)確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。所采集材料應(yīng)立即放入固定液，并編號(hào)，注明采集時(shí)間、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當(dāng)，即要能說(shuō)明問(wèn)題，又要考慮固定劑的穿透能力。如：角膜、TE-HC等組織材料細(xì)胞材料肝臟、魚卵取材第七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

取材后，應(yīng)立即進(jìn)行固定。固定是制片極為關(guān)鍵的一個(gè)步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣除與材料的新鮮程度有關(guān)外，還取決于最初的固定是否適當(dāng)和完全。固定的意義新鮮的組織被割取后,由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用和細(xì)菌的繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應(yīng)立即采用一種方法．將組織盡可能保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且有利于保存和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。固定第八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日固定的目的和作用在于：①防止組織自溶和腐??；②使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來(lái)從而保存細(xì)胞的各種組成成分使其保持與生活時(shí)相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；③因沉淀及凝固的關(guān)系，使細(xì)胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學(xué)上的差別，使原來(lái)在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細(xì)胞各部易于染色；④固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，有利于操作。

第九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日名稱10%甲醛4%多聚甲醛苦味酸冰醋酸鋨酸固定效果好好沉淀一切蛋白對(duì)染色質(zhì)固定好好組織收縮大小大小小主要用途常規(guī)病理切片免疫化學(xué)不單獨(dú)使用不單獨(dú)使用---核型電鏡缺點(diǎn)長(zhǎng)期用其固定的組織變?yōu)樗嵝圆焕谌旧?，特別是細(xì)胞核的著色固定的時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以24小時(shí)以內(nèi)為宜滲透力弱，對(duì)組織收縮大使組織膨脹，一般不單獨(dú)使用價(jià)格昂貴；有毒第十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日混合固定劑（1）Bouin氏固定液：為常用的良好的固定劑，穿透速度快，組織收縮性較小，固定均勻，固定后組織有適當(dāng)?shù)挠捕?，?duì)于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小時(shí)，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黃色，在脫水時(shí)經(jīng)各濃度酒精也可洗去黃色。（2）Carnoy液：滲透力強(qiáng)，特別適宜于固定染色體、肝糖、粘液等一些較為細(xì)微的結(jié)構(gòu)。顯示DNA、RNA效果良好。（3）改良Bouin氏固定液：此液對(duì)一般組織固定效果都很好，固定時(shí)間為4~18小時(shí)，固定后直接放70%乙醇脫水，固定時(shí)間較長(zhǎng)對(duì)組織亦無(wú)損害。第十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日固定時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)（1）固定液及被固定的組織必須新鮮；（2）固定液的用量一般為組織體積的10~20倍，容器不要過(guò)小，材料也不要太多；應(yīng)避免組織緊貼瓶底或瓶壁，以免影響固定液的滲入；（3）固定時(shí)間視組織塊的種類、性質(zhì)、大小，固定液的種類、性質(zhì)、滲透力的強(qiáng)弱，固定時(shí)的溫度的高低，實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡龋唬?）固定所用的固定液，以新配的為好，放置過(guò)久會(huì)失效；（5）在固定期間搖動(dòng)組織或搖動(dòng)容器有利于固定液的滲入，對(duì)長(zhǎng)期固定的標(biāo)本，可經(jīng)常更換固定液;（6）取材固定應(yīng)同時(shí)作好記錄，包括組織名稱、固定液和時(shí)間等內(nèi)容。第十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日乙醇：高濃度的酒精對(duì)組織有強(qiáng)烈收縮及脆化的缺點(diǎn)，因此用乙醇脫水不能直接入純酒精中脫水，而必須經(jīng)過(guò)由低到高的一系列不同濃度的酒精，逐漸取代組織中水分，以保證組織脫水徹底，并避免組織過(guò)度收縮和硬化。脫水第十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)：

（1）脫水的時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊的大小和組織的類型而定。（2）組織塊在高濃度，特別是無(wú)水乙醇內(nèi)不能放置的時(shí)間太長(zhǎng)。無(wú)水乙醇吸水能力太強(qiáng)，容易造成組織塊的過(guò)度硬化，使得切片病理組織易碎裂。（3）在脫水的過(guò)程中可以將組織塊停留在70%~80%的酒精中。（4）每次更換新的脫水劑時(shí)（組織塊從低濃度到高濃度），都要把組織塊放在吸水紙上吸干，以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影響脫水效果。第十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日置換組織內(nèi)的脫水劑，為下一步的浸蠟起到橋梁作用；二甲苯：是現(xiàn)在應(yīng)用最廣的一種透明劑，價(jià)格較便宜，不能和水混合，遇水則變成乳白色渾濁，因此必完全脫水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蠟，透明力強(qiáng)；其最大的缺點(diǎn)是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不能在其停留過(guò)久，透明時(shí)間視組織塊的大小、性質(zhì)而定；有的組織如肌肉、肌腱、軟骨、骨、皮膚、頭皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因組織過(guò)硬不易切片；長(zhǎng)時(shí)間接觸，對(duì)粘膜有刺激作用。透明第十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（1）浸蠟的目的

置換組織中的透明劑，為包埋做準(zhǔn)備。（2）注意事項(xiàng)

溫箱中的溫度必須嚴(yán)格控制在60℃的范圍，不能超過(guò)60℃；浸蠟時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。浸蠟溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使組織收縮過(guò)度收縮和脆變。浸蠟第十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（1）步驟

①準(zhǔn)備包埋蠟：一般應(yīng)用硬蠟（56~58℃或60~62℃），所用的石蠟要求透明無(wú)雜質(zhì)，新的石蠟要反復(fù)熔凝，并有一定的粘韌性。包埋用過(guò)的石蠟可以反復(fù)使用。②準(zhǔn)備包埋框：可以用金屬的，也可以用硬紙摺疊。③點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好無(wú)齒尖鑷子，需作標(biāo)記應(yīng)先寫好標(biāo)簽。④在包埋框中倒入硬蠟，然后用無(wú)齒鑷子取組織塊放入石蠟中，置好方向。⑤包埋框或紙盒內(nèi)的蠟逐漸凝結(jié)，若表面已凝結(jié)形成一層固體狀，即可放入冷水中，加速其凝固。⑥待蠟塊完全凝固以后，便可拆卸包埋框架，或拆開紙盒，取出蠟塊。包埋第十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（2）注意事項(xiàng)

①包埋時(shí)夾取組織的鑷子，用酒精燈隨時(shí)燒熱，以免石蠟?zāi)Y(jié)后粘附在鑷子上，造成蠟塊凝固不均勻。②包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時(shí)間應(yīng)盡量縮短。③包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織周圍或組織的底部，應(yīng)考慮這樣幾個(gè)方面的問(wèn)題：a.脫水不徹底。b.包埋蠟溫度低了，組織進(jìn)行包埋時(shí)，包埋框中的蠟已成凝結(jié)狀。c.組織內(nèi)還殘留有較多的透明劑。d.石蠟不純。

④包埋箱中的溫度必須保持恒定。⑤如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋。⑥較小的組織可在脫水透明時(shí)開始用伊紅染色第十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺(tái)，以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上，夾在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)的蠟塊鉗內(nèi)，使蠟塊切面與切片刀刃平行，旋緊。

切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度。通常切片厚度為4～7微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。切片第十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是甘油蛋白。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層甘油蛋白，再將一定長(zhǎng)度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開成單個(gè)蠟片于溫水（45℃左右）中展平后，撈至玻片上鋪正，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45℃溫箱中干燥，也可在37℃溫箱中干燥，但需適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。展片第二十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn)：材料發(fā)生裂隙破碎或脫落原因：1．脫水不干凈2．有透明劑殘留3．石蠟透入時(shí)，溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)4．由于脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發(fā)脆5．材料太硬或太粗補(bǔ)救辦法：1．無(wú)法彌補(bǔ)2．增加浸蠟時(shí)間，重新包埋3．無(wú)法補(bǔ)救4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六環(huán)等進(jìn)行脫水和透明5．在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液常見問(wèn)題分析第二十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn)：石蠟帶彎曲不直原因：1．石蠟塊上下兩邊不平行2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行3．刀口鋒利不一，局部產(chǎn)生差異4．蠟塊的一邊較另一邊為軟或兩邊的硬度不一致5．材料未居蠟塊正中央6．材料大而形不正補(bǔ)救辦法：1．取下臺(tái)木，將兩邊修干2．調(diào)節(jié)標(biāo)本臺(tái)，使兩者平行3．移動(dòng)刀片，改用新的刀口4．待蠟塊冷卻后再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中6．在大的一邊切去少許石蠟第二十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn)：切片分離、不能連成帶狀原因：1．室溫過(guò)低2．石蠟過(guò)硬3．材料邊緣留蠟太少4．刀的角度不適合補(bǔ)救辦法：1．在切片機(jī)上方開一電燈或提高室溫2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟?zāi)Σ翂K面3．重新包埋4．矯正刀的角度第二十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn)：切片卷起呈圓筒狀原因：1．室溫過(guò)低2．石蠟過(guò)硬3．刀口太鈍4．刀的傾角太大補(bǔ)救辦法：1．提高室溫2．加軟蠟3用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3片即成帶4．減小傾角第二十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn)：切片粘附于切片刀，皺摺在一起原因：1．室溫過(guò)高2．石蠟過(guò)軟3．刀口上留有一層石蠟4．刀口鈍補(bǔ)救辦法：1．降低室溫2．將蠟塊投入涼水中稍浸3．切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟4．磨刀或移動(dòng)刀口第二十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn)：石蠟塊將蠟帶抬起原因：1．由于摩擦而產(chǎn)生靜電荷所致2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑3．刀口上附有石蠟碎屑補(bǔ)救辦法：1．提高室溫2．用刀片將碎屑清除3．用二甲苯或氧仿清除第二十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（2）冰凍切片的制作取材冰凍切片機(jī)切片冰凍膠固定展片第二十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日(一）優(yōu)點(diǎn)：

1．簡(jiǎn)便，可以不需要對(duì)組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。

2．快速，用時(shí)短。

3．組織變化不大。

4．能很好保存脂肪，類脂等成分。

5．能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對(duì)于那些對(duì)有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。第二十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

（二）缺點(diǎn)：

1．不容易做連續(xù)切片。

2．切取的組織不能過(guò)大，組織過(guò)大不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。

3．不容易制作較薄的切片。

4．組織塊在凍結(jié)過(guò)程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，并且組織結(jié)構(gòu)也不如石蠟切片清晰。第二十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日石蠟切片和冰凍切片的比較名稱石蠟切片冰凍切片操作步驟繁瑣簡(jiǎn)單抗原活性可能會(huì)破壞組織的抗原性完好地保存各種抗原活性及酶類切片厚薄薄厚優(yōu)點(diǎn)薄，觀察結(jié)構(gòu)清晰；連續(xù)切片抗原活性好，適合免疫組化；簡(jiǎn)便操作缺點(diǎn)做免疫組化時(shí)部分需抗原修復(fù)不能連續(xù)切片；不能較薄切片第三十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞通透脫蠟、復(fù)水封閉抗原修復(fù)封片、鏡檢二抗孵育一抗孵育浸洗浸洗DAB顯色（3）免疫酶法第三十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日脫蠟和復(fù)水：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。第三十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日抗原修復(fù)：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。一般用微波修復(fù)中火6min*4次，效果不錯(cuò)。注意微波修復(fù)后自然冷卻30min左右（只要你覺(jué)得修復(fù)液的溫度達(dá)室溫即可）。第三十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞通透：目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。第三十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日血清封閉：組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。一般室溫30min。但也要防止封閉過(guò)度。第三十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。建議一抗反應(yīng)在4度最佳，反應(yīng)溫和，但時(shí)間最好不超過(guò)16~24h。第三十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：①單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。②溫柔浸洗，防止切片的脫落。③沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。④PBS的pH和離子強(qiáng)度的使用和要求。建議pH在7.4-7.6濃度為0.01M。（中性及弱堿性條件（pH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）第三十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色背景，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗4度過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。第三十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)生組織切片非特異性染色1、抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。3、血清封閉時(shí)間不夠，這需要通過(guò)延長(zhǎng)動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；4、DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；5、PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗孵育后的浸洗尤為重要；6、標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

常見問(wèn)題分析第三十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日染色后切片著色呈陰性結(jié)果1、抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。2、抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；3、血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。4、DAB孵育時(shí)間過(guò)短。5、細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。6、組織切片本身這種抗原含量低；7、開始做免疫組化，建議一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。第四十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（4）免疫熒光固定、復(fù)水封閉二抗孵育一抗孵育封片、鏡檢浸洗浸洗細(xì)胞通透固定、復(fù)水封閉封片、鏡檢二抗孵育一抗孵育浸洗浸洗第四十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮/甲醇等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片保持避光和濕度。應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查；標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過(guò)2~3h；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無(wú)明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無(wú)熒光鏡油。第四十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日NIKON熒光顯微鏡操作規(guī)程使用須知操作流程注意事項(xiàng)第四十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日使用須知1. 在記錄本上登記“日期”、“使用人”、“實(shí)驗(yàn)內(nèi)容”，檢查使用記錄中的上次汞燈關(guān)閉時(shí)間，確保汞燈關(guān)閉后至少40min才能再次開啟使用。2. 進(jìn)入顯微鏡室后首先記錄顯微鏡汞燈指數(shù)，檢查汞燈指數(shù)和上次汞燈使用記錄是否一致，若不一致請(qǐng)聯(lián)系儀器負(fù)責(zé)人。記錄汞燈實(shí)際開啟時(shí)間后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，使用結(jié)束后記錄汞燈實(shí)際關(guān)閉時(shí)間并再次記錄汞燈指數(shù)，完成使用記錄后歸還鑰匙和記錄本。汞燈開啟時(shí)間不得超過(guò)2h。3. 使用過(guò)程中，顯微鏡后部的照明燈箱可產(chǎn)生高溫，請(qǐng)勿在亮燈或熄燈40min內(nèi)觸摸燈箱，也不要在燈箱周圍放置纖維織品、紙張或易燃物質(zhì)如酒精、二甲苯等。取下的防塵罩收入抽屜內(nèi)，一定不要搭在燈箱上。第四十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日操作流程—NIKON倒置熒光顯微鏡1. 取下防塵罩，確認(rèn)熒光控制閥旋在關(guān)閉位置（C），打開汞燈電源（使汞燈預(yù)熱），綠色指示燈亮。2. 打開顯微鏡電源，綠色指示燈亮。依次計(jì)算機(jī)電源，CCD電源。打開鹵燈開關(guān)（白色按鈕），旋轉(zhuǎn)亮度調(diào)控手輪調(diào)亮視野。將標(biāo)本置于載物臺(tái)中間，旋轉(zhuǎn)選擇4×物鏡，調(diào)節(jié)焦距至清晰度最佳。依次旋轉(zhuǎn)10倍、20倍、40

倍物鏡來(lái)選擇所需的高倍物鏡，每次調(diào)焦幅度要輕，以免損傷鏡頭（換用高倍物鏡后只允許使用細(xì)調(diào)焦手輪）。125634第四十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日操作流程4. 將鹵光強(qiáng)度調(diào)到最小后關(guān)閉鹵燈開關(guān)，熒光控制閥旋到開啟位置（O）。確保汞燈電源開啟3~5min后按下汞燈激發(fā)按鈕，手動(dòng)旋轉(zhuǎn)激發(fā)方式轉(zhuǎn)換盤選擇相應(yīng)濾片（G、B、UV）。5. 使用完畢，將熒光光閘旋到關(guān)閉位置（C），依次關(guān)閉汞燈電源、CCD電源、鹵燈電源、顯微鏡電源和計(jì)算機(jī)電源，順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦手輪使物鏡緩慢降至最低位，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器使無(wú)鏡頭筒沖上。6. 關(guān)閉電源40min待燈箱變涼后，蓋上防塵罩。125634第四十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)1. 在調(diào)節(jié)焦距時(shí)一定要在4×物鏡下進(jìn)行調(diào)節(jié)，然后再換成高倍鏡使用細(xì)調(diào)焦手輪進(jìn)行小幅調(diào)動(dòng)，直接在高倍鏡下直接調(diào)焦可能會(huì)造成物鏡鏡頭接觸到標(biāo)本，損傷到鏡頭。2. 在低倍物鏡換用高倍物鏡時(shí)，不要用手指直接轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡，應(yīng)手握轉(zhuǎn)換器上層的轉(zhuǎn)動(dòng)板來(lái)轉(zhuǎn)換物鏡，否則可能會(huì)使物鏡的光軸發(fā)生偏斜。且由于轉(zhuǎn)換器材料質(zhì)地軟、精度高，螺紋受力不均勻便容易松脫，螺紋損壞可能導(dǎo)致整個(gè)轉(zhuǎn)換器的報(bào)廢。第四十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)4.以上操作規(guī)程未涉及到的旋鈕、濾片等其他部件，切勿隨意按動(dòng)。5.請(qǐng)不要隨意改動(dòng)拍攝軟件的基本設(shè)置（曝光時(shí)間除外），若要改動(dòng)，請(qǐng)告知儀器負(fù)責(zé)人；顯微鏡使用完畢后將顯微鏡載物臺(tái)和桌面上的雜物清理干凈，待汞燈變涼后蓋上防塵罩。第四十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日使用熒光顯微鏡注意事項(xiàng)：1、嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序；2、檢查時(shí)間每次以1~2h為宜，最少開機(jī)30min才可關(guān)機(jī)。超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；3、熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。4、燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在30分鐘后開啟。5、使用完畢后請(qǐng)將干燥劑放回載物臺(tái)，待整個(gè)裝置冷卻后蓋好防塵罩。使用后嚴(yán)格登記制度，對(duì)使用時(shí)間、使用狀態(tài)、使用人都要有詳細(xì)的記錄。第四十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生不透明沉積物或有色產(chǎn)物，顏色深淺代表反應(yīng)的強(qiáng)弱。此顏色深淺可用酶標(biāo)儀精確地測(cè)定出來(lái)。第五十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1、ELISA的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。第五十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。第五十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。操作步驟如下：1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。3）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗體的量。第五十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（以間接性ELISA為例）：顯色第五十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日2、ELISA試劑的組成完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標(biāo)板）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物）；

（3）酶的底物；

（4）系列參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量測(cè)定）；

（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）反應(yīng)終止液。

第五十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3、ELISA試劑的作用固相載體：固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。

第五十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日酶標(biāo)記物：即酶標(biāo)記的抗原或抗體，是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的酶標(biāo)記物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標(biāo)記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤诿笜?biāo)記物中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標(biāo)記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。第五十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。E第五十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日TMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCl或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。第五十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日洗滌液

洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。第六十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。參考標(biāo)準(zhǔn)品

定量測(cè)定的ELISA試劑盒應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。第六十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日4、ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程加待測(cè)樣品固相包被加酶標(biāo)物比色判定結(jié)果加終止液加底物溫育溫育洗滌溫育洗滌第六十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日加樣

在ELISA實(shí)驗(yàn)中一般有5次加樣步聚，即加標(biāo)準(zhǔn)品、加樣本、加酶標(biāo)記物、加底物、加反應(yīng)終止液。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加樣時(shí)一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換槍頭，以免發(fā)

生交叉污染。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。第六十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉

封閉是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?？乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。

第六十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。但在間接法測(cè)定中，封閉一般是不可少的。第六十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日洗滌

ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。第六十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作主要為浸泡式，過(guò)程如下：

a.吸/甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過(guò)洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即吸去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸/甩干孔內(nèi)液體。吸/甩干應(yīng)徹底，也可吸/甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說(shuō)明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。第六十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日顯色和比色顯色

反應(yīng)的溫度和時(shí)間是影響顯色的因素。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。底物顯色一般在室溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達(dá)到顯色的頂峰，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，會(huì)使本底值增高。底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。產(chǎn)物用各類酸性終止液終止后會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。第六十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日比色

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比

色架中。

比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下

角，如TMB的吸收波長(zhǎng)為450nm，表示方法為"A450nm"或"OD450nm"。第六十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日5、結(jié)果判斷