基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)課件

第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)

菌體的生長(zhǎng)通常用比生長(zhǎng)速率來(lái)表示。工程菌培養(yǎng)可通過(guò)選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)。控制菌體的生長(zhǎng)對(duì)提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)菌體的生長(zhǎng)通常用比1一、菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長(zhǎng)。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用一、菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的2分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長(zhǎng)，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率3大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長(zhǎng)速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作為宿組主細(xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高4二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長(zhǎng)率提高，蛋白合成增加?；蚬こ叹|(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長(zhǎng)速率降低。二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨5質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長(zhǎng)速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)。質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝6“嚴(yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí),核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點(diǎn)的ppGpp的結(jié)果。ppGpp是一個(gè)重要的調(diào)控分子。它通過(guò)影響RNA鏈的延深過(guò)程減少轉(zhuǎn)錄。“嚴(yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí),核糖體在密碼子7它的濃度增加會(huì)導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時(shí)RNA聚合酶在模板上的移動(dòng)產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長(zhǎng)速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴(yán)緊控制的啟動(dòng)子如rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。也可能ppGpp是通過(guò)干擾RNA聚合酶與PL啟動(dòng)子專一識(shí)別反應(yīng)。它的濃度增加會(huì)導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時(shí)RN8第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性

基因工程菌在傳代過(guò)程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為：分裂不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過(guò)程中常出現(xiàn)質(zhì)9分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的10一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因

常見(jiàn)分裂不穩(wěn)定的兩個(gè)因素：⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；⑵這兩種菌比數(shù)率差異的大小。一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因11對(duì)同一工程菌控制不同的比生長(zhǎng)數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)粒拷貝數(shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低但對(duì)穩(wěn)定性不利。對(duì)同一工程菌控制不同的比生長(zhǎng)數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：12質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗生素

平板培養(yǎng)基10-12h100個(gè)菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基

10-12h統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)菌落數(shù)重復(fù)三次,計(jì)算比值(穩(wěn)定性stability)質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗生素10-12h10013二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：⑴先使菌體生長(zhǎng)至一定密度；⑵再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程14由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟15有些含質(zhì)粒菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長(zhǎng)速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過(guò)間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。有些含質(zhì)粒菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，16大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長(zhǎng)速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會(huì)改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長(zhǎng)。大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體17第七節(jié)基因工程菌中試基因工程菌中試應(yīng)考慮的問(wèn)題：適宜商品化生產(chǎn)的工程菌，設(shè)計(jì)發(fā)酵反應(yīng)器，選擇反應(yīng)過(guò)程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分，維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法，工藝監(jiān)測(cè)方法，工藝控制方法，工藝自動(dòng)化使用方法，生物催化劑使用，產(chǎn)品提取方法的選擇，分離精制技術(shù)的選擇。第七節(jié)基因工程菌中試基因工程菌中試應(yīng)考慮的問(wèn)題：適宜商品化18一工程菌選擇

用于中試的工程菌需具備的條件試能用一般基因重組技術(shù)獲得，有高產(chǎn)潛力，能有工業(yè)原料薇培養(yǎng)基，生產(chǎn)工期能采用一般工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，能產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)，不致病，無(wú)毒性，能安全生產(chǎn)，符合國(guó)家衛(wèi)生部門有關(guān)規(guī)定，產(chǎn)品有特異性，發(fā)酵液粘度小。一工程菌選擇19二反應(yīng)器設(shè)計(jì)三發(fā)酵培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成及作用：提供化學(xué)元素提供特殊營(yíng)養(yǎng)源提供能源控制代謝二反應(yīng)器設(shè)計(jì)20四工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測(cè)控制1.工藝最佳化是指最快周期，最高產(chǎn)量，最好質(zhì)量，最低消耗，最大安全性，最周全的服務(wù)處理效果，最佳化速度與最低失敗率等的綜合指標(biāo)2.參數(shù)監(jiān)測(cè)控制需監(jiān)測(cè)與控制的4種參數(shù)：A，主要參數(shù)：pH,溫度，溶氧。B，生物量：渾濁度，細(xì)胞組分，總氮量及菌絲干重。C，碳源：糖，有機(jī)酸，淀粉。D，產(chǎn)品。四工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測(cè)控制21五計(jì)算機(jī)的應(yīng)用五計(jì)算機(jī)的應(yīng)用22第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程包括:⑴通過(guò)搖瓶操作基因工程菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體細(xì)胞的影響;⑵通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程包括:23菌種一級(jí)種子搖瓶二級(jí)種子罐培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)

原料發(fā)酵培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離基配制

微生物工業(yè)發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)圖菌種一級(jí)種子搖瓶二24一基因工程菌的培養(yǎng)方式1.分批培養(yǎng)2.補(bǔ)料分批培養(yǎng)3.連續(xù)培養(yǎng)4.透析培養(yǎng)5.固定化培養(yǎng)一基因工程菌的培養(yǎng)方式252.補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的方法。2.補(bǔ)料分批培養(yǎng)26二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝

基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微27工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化。對(duì)發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素有：1.培養(yǎng)基的影響2.接種量的影響3.溫度的影響4.溶氧量的影響5.誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響6.誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響7.pH的影響工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化。對(duì)28⒈培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長(zhǎng)速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無(wú)機(jī)鹽、維生素等。⒈培養(yǎng)基的影響29不同的碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和外源基因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對(duì)lac啟動(dòng)子有阻遏作用。乳糖對(duì)lac啟動(dòng)子有利。不同的碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和外源基因表達(dá)有較大的影響。30在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對(duì)trp啟動(dòng)子控制的基因有影響。無(wú)機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響菌體生長(zhǎng)。在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨31⒉接種量的影響接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量小，菌體延遲期較長(zhǎng)，使菌齡老化，不利于外源基因表達(dá)。⒉接種量的影響32接種量大，可縮短生長(zhǎng)延遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適于表達(dá)外源基因。接種量過(guò)高，使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，代謝物積累過(guò)多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長(zhǎng)。接種量大，可縮短生長(zhǎng)延遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生33⒊溫度的影響

溫毒對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平上。溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應(yīng)速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向，影響代謝調(diào)控機(jī)制。⒊溫度的影響溫毒對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制34

適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長(zhǎng)，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會(huì)使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長(zhǎng)，又適合代謝產(chǎn)物35⒋溶解氧的影響對(duì)于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。⒋溶解氧的影響對(duì)于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參36發(fā)酵時(shí)，隨DO2濃度的下降，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，ST值下降，發(fā)酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對(duì)氧的需求。維持較高的DO2值，才能提高工程菌的生長(zhǎng)，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法,可改變培養(yǎng)過(guò)程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。發(fā)酵時(shí)，隨DO2濃度的下降，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，ST值37⒌誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響

對(duì)于λP啟動(dòng)子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的溫度敏感型突變株（clts857），在28～300C下培養(yǎng)時(shí)，該突變體能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)溫度升高420C時(shí)，該阻遏蛋白失活，使啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，提高目的基因的表達(dá)效率。一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。⒌誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響對(duì)于λP啟動(dòng)子型的工程菌，使用38在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109/個(gè)為止，這時(shí)菌體數(shù)目倍增，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧需求量急增，營(yíng)養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109/個(gè)為397pH的影響pH對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長(zhǎng)和代謝情況，對(duì)pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。7pH的影響pH對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都40如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長(zhǎng)條件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培養(yǎng)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,其最佳pH為6.0～6.5。如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長(zhǎng)條件，41總之,最佳化的工藝是獲得:最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度和最低失敗率等?？傊?最佳化的工藝是獲得:42三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。它不同于微生物發(fā)酵，微生物發(fā)酵目的是為了獲得初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長(zhǎng)并非主要目標(biāo)，而基因工程發(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌43發(fā)酵罐的組成有：發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無(wú)菌過(guò)濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng)、培養(yǎng)液配制和連續(xù)操作系統(tǒng)。發(fā)酵罐的組成有：44對(duì)發(fā)酵罐要求：提供菌體生長(zhǎng)最適生長(zhǎng)條件，培養(yǎng)過(guò)程不得污染，保證純菌培養(yǎng)，培養(yǎng)及消毒過(guò)程不得游離異物，不能干擾細(xì)菌代謝活動(dòng)等。對(duì)發(fā)酵罐要求：45基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)課件46第九節(jié)高密度發(fā)酵利用大腸桿菌表達(dá)重組基因產(chǎn)物與傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)不同，重組菌培養(yǎng)有自身的特點(diǎn)，即目的基因克隆自啊質(zhì)粒上，存在分裂不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性；隨著培養(yǎng)環(huán)境的改變，質(zhì)?？截悢?shù)會(huì)有增有減，基因劑量也會(huì)相應(yīng)變化；大多數(shù)克隆基因的表達(dá)是已知啟動(dòng)子控制的，因而易通過(guò)改變環(huán)境條件來(lái)調(diào)節(jié)。第九節(jié)高密度發(fā)酵利用大腸桿菌表達(dá)重組基因產(chǎn)物與傳統(tǒng)發(fā)酵培47高密度發(fā)酵是一個(gè)相對(duì)概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達(dá)200gDCW/L高密度發(fā)酵是一個(gè)相對(duì)概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在548一影響高密度發(fā)酵的因素1.培養(yǎng)基2.溶氧濃度3.pH4.溫度5.代謝副產(chǎn)物一影響高密度發(fā)酵的因素1.培養(yǎng)基49二實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法1.發(fā)酵條件的改進(jìn)（1）培養(yǎng)基的選擇（2）建立流加式培養(yǎng)的方式（3）提高供氧能力2.構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑（2）對(duì)碳代謝流進(jìn)行分流（3）限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流（4）引入血紅蛋白基因3.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌二實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法1.發(fā)酵條件的改進(jìn)50第十節(jié)基因工程藥物的分離純化基因工程藥物的分離、純化非常重要。表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì)。它的制得具有以下特點(diǎn)：①表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；第十節(jié)基因工程藥物的分離純化基因工程藥物的分離51②含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；③表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；④表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；⑤對(duì)其質(zhì)量要求純度高、無(wú)菌、無(wú)熱原。②含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；52一、建立分離純化工藝的根據(jù)⒈含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn)基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過(guò)程的各種因素對(duì)分離、純化工藝有影響。包括：①菌種的類型及其代謝特性。②原材料培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量。③生產(chǎn)工藝及條件。一、建立分離純化工藝的根據(jù)⒈含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn)53⒉物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。⒊目的產(chǎn)物特性。⒋產(chǎn)品質(zhì)量的要求⒉物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。54二、分離純化的基本過(guò)程

發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離濃縮初步分離高度純化制劑產(chǎn)品包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性二、分離純化的基本過(guò)程發(fā)酵液55三、分離純化的技術(shù)分離純化的技術(shù)要求：①技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。②選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達(dá)到較高的純化倍數(shù)。

三、分離純化的技術(shù)分離純化的技術(shù)要求：56③收率要高。④兩個(gè)技數(shù)間能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理。⑤純化過(guò)程要快，滿足高生產(chǎn)率的要求。③收率要高。57⒈細(xì)胞破碎與固液分離

⑴細(xì)胞收集：離心法、膜分離法。⑵細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法。⑶固液分離⒈細(xì)胞破碎與固液分離58⒉目的產(chǎn)物的分離純化

目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)決定。產(chǎn)物特性作用

等電點(diǎn)決定離子交換種類及條件相對(duì)分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時(shí)間⒉目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行59⒉目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)決定。⒉目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純60產(chǎn)物特性作用等電點(diǎn)決定離子交換種類及條件相對(duì)分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時(shí)間產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用產(chǎn)物特性作61分離純化的方法依賴色譜分離方法

⑴離子交換層析（ionexchangechromatographyIEC）離子交換層析的基本原理是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。

分離純化的方法依賴色譜分離方法

⑴離子交換層析（62⑵反相色譜（reversedphasechromatography，RPC）和

疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來(lái)分離純化的。反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)與非極性固定相之間相互作用力的大小以及溶質(zhì)分子中極性基團(tuán)與流動(dòng)相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進(jìn)行分離的。⑵反相色譜（reversedphasechromatog63常用固定相為硅膠烷基鍵合相。流動(dòng)相為低離子強(qiáng)度的酸性水溶液，加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機(jī)溶劑。由于固定相骨架疏水性強(qiáng)，吸附的蛋白質(zhì)需用有機(jī)溶劑才能洗脫下來(lái)。常用固定相為硅膠烷基鍵合相。64疏水色譜的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無(wú)機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜介質(zhì)表面的疏水性弱。為有機(jī)聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。流動(dòng)相為pH6～8鹽水溶液。疏水色譜的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白65在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介子的疏水基團(tuán)產(chǎn)生疏水性作用而被吸附；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水性作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來(lái)，蛋白質(zhì)疏水性越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)。與反相色譜相比，疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)變性可能性小。在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介子的疏水基66⑶親和層析（affinitychromatography，AC）親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。⑶親和層析（affinitychromatography，67配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。載體：與配基結(jié)合的支撐物。親和層析大體可分三步：①配基固定化②吸附目的物③樣品解吸配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。68⑷凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開(kāi)。⑷凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離69根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異，可以利用凝膠過(guò)濾來(lái)分離純化目的蛋白。主要應(yīng)用兩個(gè)方面：①脫鹽和更換緩沖液②蛋白質(zhì)分子的分級(jí)分離。在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異，70⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：⑴DNA的去除DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽(yáng)離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質(zhì)的去除熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除層析或過(guò)濾可將病毒去除。⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：71⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：⑴DNA的去除DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽(yáng)離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：72⑵熱原質(zhì)的去除熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除層析或過(guò)濾可將病毒去除。⑵熱原質(zhì)的去除熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去73四、選擇分離純化方法的依據(jù)

⒈根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮可用沉淀和超濾法。四、選擇分離純化方法的依據(jù)⒈根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇74產(chǎn)物在周質(zhì)表達(dá)是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)的一種形式,它可以避開(kāi)可溶性表達(dá)蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質(zhì),在一定程度上有利于分離純化.為了獲得周質(zhì)蛋白經(jīng)低濃度溶菌酶處理后,可采用滲透壓休克的方法來(lái)獲得。產(chǎn)物在周質(zhì)表達(dá)是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)的一種形75可溶性表達(dá)產(chǎn)物破菌后的細(xì)胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。可溶性表達(dá)產(chǎn)物破菌后的細(xì)胞上清，首選親和分離方法，或離76⒉根據(jù)分離單元之間的銜接選擇應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采用高效的分離手段。先將最多的雜質(zhì)去除，將費(fèi)用最高、最費(fèi)時(shí)的分離單元放在最后階段，即通常先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要雜質(zhì)（包括非蛋白類雜質(zhì)）。⒉根據(jù)分離單元之間的銜接選擇應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成77隨后采用高分辨率的操作單元（離子交換層析和親和層析）凝膠過(guò)濾放在最后，這樣可以提高分離效果。層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨效率，并有利于各步驟間的過(guò)渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過(guò)濾。隨后采用高分辨率的操作單元（離子交換層析和親和層析78⒊根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則：⑴具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性⑵盡可能減少組成工藝的步驟⑶各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)⒊根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇分離純化工藝應(yīng)79⑷工藝過(guò)程中盡可能少用試劑⑸工藝所用時(shí)間要短⑹工藝和技術(shù)必須高效收率高易操作能耗低⑺具有較高的安全性⑷工藝過(guò)程中盡可能少用試劑80第十一節(jié)變性蛋白的復(fù)性外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對(duì)宿主毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率一般都很低。第十一節(jié)變性蛋白的復(fù)性外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)81一.包涵體的特性與形成1.包涵體的定義、組成與特性：包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，具有很高的密度（約1.3mg/ml），無(wú)定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。NMR等新技術(shù)的應(yīng)用表明包涵體具有一定量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動(dòng)階段中具有一定的作用。一.包涵體的特性與形成1.包涵體的定義、組成與特性：822包涵體的形成：主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。2.1、基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過(guò)高，超過(guò)了細(xì)菌正常的代謝水平，由于細(xì)菌的δ因子的蛋白水解能力達(dá)到飽和，使之表達(dá)產(chǎn)物積累起來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)，過(guò)多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。2包涵體的形成：832.2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。2.3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。2.4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。2.2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包842.5、蛋白質(zhì)在合成之后，于中性pH或接近中性pH的環(huán)境下，其本身固有的溶解度對(duì)于包涵體的形成比較關(guān)鍵，即是說(shuō)，有的表達(dá)產(chǎn)率很高，如Aspartase和Cyanase,表達(dá)產(chǎn)率達(dá)菌體蛋白的30%,也不形成包涵體，而以可溶形式出現(xiàn)。2.6、在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。2.5、蛋白質(zhì)在合成之后，于中性pH或接近中性pH的環(huán)境下，85二.包涵體的分離和溶解1基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用：機(jī)械破碎、超聲破碎：?jiǎn)渭兂暺扑椋谛∫?guī)模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，這樣部分未破碎細(xì)胞與包涵體混在一起，給后期純化帶來(lái)困難。因此，在較大規(guī)模純化時(shí)先用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法，可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學(xué)方法破碎使細(xì)菌裂解,然后以5000-20000g15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。二.包涵體的分離和溶解1基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用862洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑,過(guò)高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解，如2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。2洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌873溶解：一般用強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl6M），通過(guò)離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來(lái)講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲酰化，特別是在堿性pH值下長(zhǎng)期保溫時(shí)。或用去垢劑，如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。KandulaSuntha等人用TritonX-100來(lái)溶解Zymononasmobilislevansucrase包涵體蛋白。

3溶解：一般用強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnH88另外，對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。還原劑的使用濃度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文獻(xiàn)使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無(wú)關(guān)，而有些沒(méi)有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無(wú)影響，如牛生長(zhǎng)激素包涵體的增溶。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。另外，對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈89三.包含體蛋白復(fù)性方法1包涵體蛋白復(fù)性方法1.1稀釋復(fù)性和透析復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過(guò)夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過(guò)逐漸降低外透液濃度來(lái)控制變性劑去除速度，有人稱易形成無(wú)活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操作，無(wú)法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。三.包含體蛋白復(fù)性方法1包涵體蛋白復(fù)性方法901.2含二硫鍵的蛋白的復(fù)性1.3封閉蛋白的疏水蔟促進(jìn)復(fù)性1.4凝膠過(guò)濾層析復(fù)性1.5小分子添加劑促進(jìn)的復(fù)性1.6分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性1.7人工分子伴侶的復(fù)性1.2含二硫鍵的蛋白的復(fù)性912包涵體蛋白復(fù)性效率復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過(guò)程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾，如在純化IL-2時(shí)以十二烷基硫酸鈉溶液中加入銅離子（0.05%SDS，7.5-30umol/lCuCl2）的方法，25-37°C下反應(yīng)3小時(shí)，再EDTA至1mmol/l終止反應(yīng)，復(fù)性后的二聚體低于1%。一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。2包涵體蛋白復(fù)性效率922.1影響復(fù)性效率的因素：2.1.1蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度：正確折疊的蛋白質(zhì)的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質(zhì)的濃度是使蛋白質(zhì)聚集的主要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復(fù)性液中過(guò)快，容易形成絮狀沉淀，可能是蛋白重新凝聚的緣故。所以我們采用再水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白，使變性蛋白在復(fù)性液中始終處于低濃度狀態(tài)。2.1.2pH和溫度：復(fù)性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響正確配對(duì)的二硫鍵的形成，過(guò)高或過(guò)低會(huì)降低復(fù)性效率，最適宜的復(fù)性pH值一般是8.0-9.0。[12]此外，影響復(fù)性效率的因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。2.1影響復(fù)性效率的因素：932.3復(fù)性效果的檢測(cè)：根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè)。2.3.1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。2.3.2、光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過(guò)程檢測(cè)。2.3.3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。2.3復(fù)性效果的檢測(cè)：942.3.4、生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。2.3.5、黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見(jiàn)的沉淀析出。2.3.6、免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。2.3.4、生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)95第十二節(jié)基因工程藥物的

質(zhì)量控制是利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成嚴(yán)重危害。第十二節(jié)基因工程藥物的

質(zhì)量控制是利用活細(xì)胞作為表96宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過(guò)程中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過(guò)程都必須嚴(yán)格控制條件和鑒定質(zhì)量。宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過(guò)程中97一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點(diǎn)1.產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)2.產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)3.嚴(yán)格控制條件一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點(diǎn)98二、生物材料的質(zhì)量控制

原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。二、生物材料的質(zhì)量控制99根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性：⒈明確目的基因的來(lái)源、克隆經(jīng)過(guò)，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下100⒉應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)制子、啟動(dòng)子）的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物；⒊應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；⒉應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)101三、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過(guò)程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無(wú)突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。三、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制在工程菌的貯存中，要求種子克102生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無(wú)細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)。生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含103原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)104對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)品生成的方法和材105在培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)后的基因型特征；依宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。在培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)106培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。

培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，如107四、純化過(guò)程的質(zhì)量控制

產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。四、純化過(guò)程的質(zhì)量控制產(chǎn)品要有足夠的生理108在精制過(guò)程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測(cè)方法。在精制過(guò)程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒109四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項(xiàng)要求:產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包110五、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制基因工程藥物質(zhì)量控制主要包括：產(chǎn)品的鑒別，純度，活性，安全性，穩(wěn)定性和一致性五、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制1111.生物活性測(cè)定需通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)和通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外效價(jià)測(cè)定。1.生物活性測(cè)定1122.理化性質(zhì)鑒定1）非特異性鑒別2）特異性鑒別3）相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定凝膠過(guò)濾法、SD-SPAGE法2.理化性質(zhì)鑒定1134）等電點(diǎn)測(cè)定5）肽圖分析肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì),對(duì)生成的肽段進(jìn)行分離分析。它是檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)最有效的方法，該技術(shù)靈敏高效是對(duì)基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的首選方法。常用HPLC、毛細(xì)管電泳。4）等電點(diǎn)測(cè)定1146）氨基酸組成分析50個(gè)氨基酸較理想7）部分氨基酸序列分析N端15個(gè)氨基酸可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標(biāo)。8）蛋白質(zhì)二硫鍵分析測(cè)定方法有:對(duì)氯汞苯甲酸法等5，5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法6）氨基酸組成分析1153.重組蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和相對(duì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法有:福林-酚法、雙縮脲法3.重組蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和相對(duì)分子量的測(cè)定1164.純度分析蛋白質(zhì)含量測(cè)定SDS、等電聚焦、各種HPLC、毛細(xì)管電泳5.雜質(zhì)檢測(cè)①蛋白類雜質(zhì)殘留宿主細(xì)胞蛋白采用免疫分析的方法②非蛋白類雜質(zhì)4.純度分析117②非蛋白類雜質(zhì)非蛋白類雜質(zhì)主要有:病毒、細(xì)菌等微生物、熱原、內(nèi)毒素、致敏源及DNA。②非蛋白類雜質(zhì)118常用檢測(cè)方法：雜質(zhì)和污染物檢測(cè)方法內(nèi)毒素鱟試劑、家兔熱原法宿主細(xì)胞蛋白免疫分析、SDS、CE其它蛋白雜質(zhì)免疫分析、SDS、HPLC、CE殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE甲酰蛋氨酸肽譜、HPLC、IEF、CE蛋氨酸氧化肽譜、HPLC、質(zhì)譜、氨基酸分析產(chǎn)物變性或聚和脫氨基SDS、IEF、HPLC、CE、質(zhì)譜、凝膠過(guò)濾常用檢測(cè)方法：119雜質(zhì)和污染物檢測(cè)方法單克隆抗體SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、質(zhì)譜、CE微生物微生物學(xué)檢查支原體微生物學(xué)檢查病毒微生物學(xué)檢查雜質(zhì)和污染物檢測(cè)方1206.穩(wěn)定性考查是藥品有效性安全性的重要指標(biāo)，是藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。7.產(chǎn)品一致性的保證基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)課件121六、產(chǎn)品的保存⒈液態(tài)保存⑴低溫保存⑵在穩(wěn)定的下保存⑶高濃度保存⑷加保護(hù)劑保存⒉固態(tài)保存六、產(chǎn)品的保存122第十三節(jié)基因工程藥物制造實(shí)例干擾素（interferon，IFN）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個(gè)類型。α型干擾素在分為α1bα2aα2b等亞型。第十三節(jié)基因工程藥物制造實(shí)例干擾素（interfero123一、基因工程菌的組建誘生的白細(xì)胞提取全RNA通過(guò)寡dT-纖維素柱蔗糖密度梯度獲得寡A的mRNA離心提取12s的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA雙鏈cDNA接上dT或dG尾pBR322質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒加上dA或dC一、基因工程菌的組建124

退火獲的雜交質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增雜交質(zhì)粒篩選抗青霉素但對(duì)氨芐用雜交翻譯法挑選青霉素敏感細(xì)菌克隆含干擾素cDNA克隆將干擾素cDNA克隆入表達(dá)載體在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)課件125二、基因工程干擾素的制備啟開(kāi)種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提精提半成品制備半成品檢定分裝凍干成品檢定成品包裝二、基因工程干擾素的制備126α2b干擾素生產(chǎn)過(guò)程1.發(fā)酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，質(zhì)粒用啟動(dòng)子，含氨芐青霉素抗性基因。培養(yǎng)基含1%蛋白凍0.5%酵母提取物0.5%NACl。搖床培養(yǎng)30C，10h，發(fā)酵種子。15L發(fā)酵罐培養(yǎng)，30C，8h。然后42C，3h。離心去上清。oooα2b干擾素生產(chǎn)過(guò)程ooo1272.產(chǎn)品的提取與純化濕菌超聲破碎，離心，上清超濾濃縮，SephadexG50分離。經(jīng)SDS檢查。在經(jīng)DE-52柱純化。2.產(chǎn)品的提取與純化128三、質(zhì)量控制標(biāo)和要求⒈半成品檢定⑴干擾素效價(jià)測(cè)定⑵蛋白質(zhì)含量測(cè)定⑶比活性⑷純度測(cè)定⑸相對(duì)分子量測(cè)定三、質(zhì)量控制標(biāo)和要求⒈半成品檢定129⑹殘余外源性DNA含量測(cè)定⑺殘余血清igG含量測(cè)定⑻殘余抗生素活性測(cè)定⑼紫外光譜掃描⑽肽圖測(cè)定⑾等電點(diǎn)測(cè)定⑿除菌半成品干擾素效價(jià)測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)。⑹殘余外源性DNA含量測(cè)定130⒉成品檢定⑴物理性狀⑵鑒別試驗(yàn)⑶水分測(cè)定⑷無(wú)菌試驗(yàn)⑸熱原試驗(yàn)⑹干擾素效價(jià)測(cè)定⑺安全試驗(yàn)⒉成品檢定⑴物理性狀131二.人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子二.人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子132三.人白細(xì)胞介素-2三.人白細(xì)胞介素-2133第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)

菌體的生長(zhǎng)通常用比生長(zhǎng)速率來(lái)表示。工程菌培養(yǎng)可通過(guò)選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)。控制菌體的生長(zhǎng)對(duì)提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)菌體的生長(zhǎng)通常用比134一、菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長(zhǎng)。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用一、菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的135分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長(zhǎng)，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率136大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長(zhǎng)速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗藿M主細(xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高137二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長(zhǎng)率提高，蛋白合成增加。基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長(zhǎng)速率降低。二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨138質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長(zhǎng)速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)。質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝139“嚴(yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí),核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點(diǎn)的ppGpp的結(jié)果。ppGpp是一個(gè)重要的調(diào)控分子。它通過(guò)影響RNA鏈的延深過(guò)程減少轉(zhuǎn)錄?！皣?yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí),核糖體在密碼子140它的濃度增加會(huì)導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時(shí)RNA聚合酶在模板上的移動(dòng)產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長(zhǎng)速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴(yán)緊控制的啟動(dòng)子如rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。也可能ppGpp是通過(guò)干擾RNA聚合酶與PL啟動(dòng)子專一識(shí)別反應(yīng)。它的濃度增加會(huì)導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時(shí)RN141第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性

基因工程菌在傳代過(guò)程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為：分裂不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過(guò)程中常出現(xiàn)質(zhì)142分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的143一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因

常見(jiàn)分裂不穩(wěn)定的兩個(gè)因素：⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；⑵這兩種菌比數(shù)率差異的大小。一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因144對(duì)同一工程菌控制不同的比生長(zhǎng)數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低但對(duì)穩(wěn)定性不利。對(duì)同一工程菌控制不同的比生長(zhǎng)數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：145質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗生素

平板培養(yǎng)基10-12h100個(gè)菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基

10-12h統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)菌落數(shù)重復(fù)三次,計(jì)算比值(穩(wěn)定性stability)質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗生素10-12h100146二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：⑴先使菌體生長(zhǎng)至一定密度；⑵再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程147由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟148有些含質(zhì)粒菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長(zhǎng)速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過(guò)間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。有些含質(zhì)粒菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，149大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長(zhǎng)速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會(huì)改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長(zhǎng)。大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體150第七節(jié)基因工程菌中試基因工程菌中試應(yīng)考慮的問(wèn)題：適宜商品化生產(chǎn)的工程菌，設(shè)計(jì)發(fā)酵反應(yīng)器，選擇反應(yīng)過(guò)程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分，維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法，工藝監(jiān)測(cè)方法，工藝控制方法，工藝自動(dòng)化使用方法，生物催化劑使用，產(chǎn)品提取方法的選擇，分離精制技術(shù)的選擇。第七節(jié)基因工程菌中試基因工程菌中試應(yīng)考慮的問(wèn)題：適宜商品化151一工程菌選擇

用于中試的工程菌需具備的條件試能用一般基因重組技術(shù)獲得，有高產(chǎn)潛力，能有工業(yè)原料薇培養(yǎng)基，生產(chǎn)工期能采用一般工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，能產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)，不致病，無(wú)毒性，能安全生產(chǎn)，符合國(guó)家衛(wèi)生部門有關(guān)規(guī)定，產(chǎn)品有特異性，發(fā)酵液粘度小。一工程菌選擇152二反應(yīng)器設(shè)計(jì)三發(fā)酵培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成及作用：提供化學(xué)元素提供特殊營(yíng)養(yǎng)源提供能源控制代謝二反應(yīng)器設(shè)計(jì)153四工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測(cè)控制1.工藝最佳化是指最快周期，最高產(chǎn)量，最好質(zhì)量，最低消耗，最大安全性，最周全的服務(wù)處理效果，最佳化速度與最低失敗率等的綜合指標(biāo)2.參數(shù)監(jiān)測(cè)控制需監(jiān)測(cè)與控制的4種參數(shù)：A，主要參數(shù)：pH,溫度，溶氧。B，生物量：渾濁度，細(xì)胞組分，總氮量及菌絲干重。C，碳源：糖，有機(jī)酸，淀粉。D，產(chǎn)品。四工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測(cè)控制154五計(jì)算機(jī)的應(yīng)用五計(jì)算機(jī)的應(yīng)用155第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程包括:⑴通過(guò)搖瓶操作基因工程菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體細(xì)胞的影響;⑵通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程包括:156菌種一級(jí)種子搖瓶二級(jí)種子罐培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)

原料發(fā)酵培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離基配制

微生物工業(yè)發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)圖菌種一級(jí)種子搖瓶二157一基因工程菌的培養(yǎng)方式1.分批培養(yǎng)2.補(bǔ)料分批培養(yǎng)3.連續(xù)培養(yǎng)4.透析培養(yǎng)5.固定化培養(yǎng)一基因工程菌的培養(yǎng)方式1582.補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的方法。2.補(bǔ)料分批培養(yǎng)159二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝

基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微160工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化。對(duì)發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素有：1.培養(yǎng)基的影響2.接種量的影響3.溫度的影響4.溶氧量的影響5.誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響6.誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響7.pH的影響工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化。對(duì)161⒈培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長(zhǎng)速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無(wú)機(jī)鹽、維生素等。⒈培養(yǎng)基的影響162不同的碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和外源基因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對(duì)lac啟動(dòng)子有阻遏作用。乳糖對(duì)lac啟動(dòng)子有利。不同的碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和外源基因表達(dá)有較大的影響。163在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對(duì)trp啟動(dòng)子控制的基因有影響。無(wú)機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響菌體生長(zhǎng)。在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨164⒉接種量的影響接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量小，菌體延遲期較長(zhǎng)，使菌齡老化，不利于外源基因表達(dá)。⒉接種量的影響165接種量大，可縮短生長(zhǎng)延遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適于表達(dá)外源基因。接種量過(guò)高，使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，代謝物積累過(guò)多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長(zhǎng)。接種量大，可縮短生長(zhǎng)延遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生166⒊溫度的影響

溫毒對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平上。溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應(yīng)速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向，影響代謝調(diào)控機(jī)制。⒊溫度的影響溫毒對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制167

適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長(zhǎng)，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會(huì)使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長(zhǎng)，又適合代謝產(chǎn)物168⒋溶解氧的影響對(duì)于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。⒋溶解氧的影響對(duì)于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參169發(fā)酵時(shí)，隨DO2濃度的下降，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，ST值下降，發(fā)酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對(duì)氧的需求。維持較高的DO2值，才能提高工程菌的生長(zhǎng)，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法,可改變培養(yǎng)過(guò)程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。發(fā)酵時(shí)，隨DO2濃度的下降，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，ST值170⒌誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響

對(duì)于λP啟動(dòng)子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的溫度敏感型突變株（clts857），在28～300C下培養(yǎng)時(shí)，該突變體能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)溫度升高420C時(shí)，該阻遏蛋白失活，使啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，提高目的基因的表達(dá)效率。一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。⒌誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響對(duì)于λP啟動(dòng)子型的工程菌，使用171在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109/個(gè)為止，這時(shí)菌體數(shù)目倍增，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧需求量急增，營(yíng)養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109/個(gè)為1727pH的影響pH對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長(zhǎng)和代謝情況，對(duì)pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。7pH的影響pH對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都173如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長(zhǎng)條件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培養(yǎng)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,其最佳pH為6.0～6.5。如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長(zhǎng)條件，174總之,最佳化的工藝是獲得:最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度和最低失敗率等?？傊?最佳化的工藝是獲得:175三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。它不同于微生物發(fā)酵，微生物發(fā)酵目的是為了獲得初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長(zhǎng)并非主要目標(biāo)，而基因工程發(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌176發(fā)酵罐的組成有：發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無(wú)菌過(guò)濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng)、培養(yǎng)液配制和連續(xù)操作系統(tǒng)。發(fā)酵罐的組成有：177對(duì)發(fā)酵罐要求：提供菌體生長(zhǎng)最適生長(zhǎng)條件，培養(yǎng)過(guò)程不得污染，保證純菌培養(yǎng)，培養(yǎng)及消毒過(guò)程不得游離異物，不能干擾細(xì)菌代謝活動(dòng)等。對(duì)發(fā)酵罐要求：178基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)課件179第九節(jié)高密度發(fā)酵利用大腸桿菌表達(dá)重組基因產(chǎn)物與傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)不同，重組菌培養(yǎng)有自身的特點(diǎn)，即目的基因克隆自啊質(zhì)粒上，存在分裂不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性；隨著培養(yǎng)環(huán)境的改變，質(zhì)?？截悢?shù)會(huì)有增有減，基因劑量也會(huì)相應(yīng)變化；大多數(shù)克隆基因的表達(dá)是已知啟動(dòng)子控制的，因而易通過(guò)改變環(huán)境條件來(lái)調(diào)節(jié)。第九節(jié)高密度發(fā)酵利用大腸桿菌表達(dá)重組基因產(chǎn)物與傳統(tǒng)發(fā)酵培180高密度發(fā)酵是一個(gè)相對(duì)概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達(dá)200gDCW/L高密度發(fā)酵是一個(gè)相對(duì)概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在5181一影響高密度發(fā)酵的因素1.培養(yǎng)基2.溶氧濃度3.pH4.溫度5.代謝副產(chǎn)物一影響高密度發(fā)酵的因素1.培養(yǎng)基182二實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法1.發(fā)酵條件的改進(jìn)（1）培養(yǎng)基的選擇（2）建立流加式培養(yǎng)的方式（3）提高供氧能力2.構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑（2）對(duì)碳代謝流進(jìn)行分流（3）限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流（4）引入血紅蛋白基因3.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌二實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法1.發(fā)酵條件的改進(jìn)183第十節(jié)基因工程藥物的分離純化基因工程藥物的分離、純化非常重要。表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì)。它的制得具有以下特點(diǎn)：①表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；第十節(jié)基因工程藥物的分離純化基因工程藥物的分離184②含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；③表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；④表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；⑤對(duì)其質(zhì)量要求純度高、無(wú)菌、無(wú)熱原。②含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；185一、建立分離純化工藝的根據(jù)⒈含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn)基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過(guò)程的各種因素對(duì)分離、純化工藝有影響。包括：①菌種的類型及其代謝特性。②原材料培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量。③生產(chǎn)工藝及條件。一、建立分離純化工藝的根據(jù)⒈含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn)186⒉物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。⒊目的產(chǎn)物特性。⒋產(chǎn)品質(zhì)量的要求⒉物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。187二、分離純化的基本過(guò)程

發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離濃縮初步分離高度純化制劑產(chǎn)品包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性二、分離純化的基本過(guò)程發(fā)酵液188三、分離純化的技術(shù)分離純化的技術(shù)要求：①技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。②選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達(dá)到較高的純化倍數(shù)。

三、分離純化的技術(shù)分離純化的技術(shù)要求：189③收率要高。④兩個(gè)技數(shù)間能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理。⑤純化過(guò)程要快，滿足高生產(chǎn)率的要求。③收率要高。190⒈細(xì)胞破碎與固液分離

⑴細(xì)胞收集：離心法、膜分離法。⑵細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法。⑶固液分離⒈細(xì)胞破碎與固液分離191⒉目的產(chǎn)物的分離純化

目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)決定。產(chǎn)物特性作用

等電點(diǎn)決定離子交換種類及條件相對(duì)分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時(shí)間⒉目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行192⒉目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)決定。⒉目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純193產(chǎn)物特性作用等電點(diǎn)決定離子交換種類及條件相對(duì)分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時(shí)間產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用產(chǎn)物特性作194分離純化的方法依賴色譜分離方法

⑴離子交換層析（ionexchangechromatographyIEC）離子交換層析的基本原理是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可