基因工程與基因重組課件

基因重組與基因工程基因重組與基因工程1生物工程定義生物工程是生物技術(shù)的總稱(chēng)，是對(duì)生命有機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平、組織水平、個(gè)體水平進(jìn)行不同層次的創(chuàng)造性設(shè)計(jì)和改造，使之能定向組建具有特定性狀的新物種或新品系，從而造福人類(lèi)的現(xiàn)代應(yīng)用技術(shù)學(xué)科。生物工程定義生物工程是生物技術(shù)的總稱(chēng)2生物技術(shù)的四大體系基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程生物技術(shù)的四大體系基因工程3

重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)——同源的或異源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得該DNA分子的大量拷貝。這類(lèi)克隆是在分子水平上操作，故又稱(chēng)分子克隆（molecularcloning）。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克隆重組DNA技術(shù)（recombina4

由于DNA克隆研究對(duì)象常常是特異的基因片段，所以又稱(chēng)作基因克?。╣enecloning）。實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作統(tǒng)稱(chēng)為基因工程（geneticengineering）。由于DNA克隆研究對(duì)象常常是特異的基因片段51997年2月23日英國(guó)Wilmut1997年2月23日6

從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。用合適的酶切割目的基因和載體，產(chǎn)生匹配的末端在體外，將目的基因片段連接到能自我復(fù)制的并且具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱(chēng)宿主細(xì)胞），并與之一起增殖。

篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。從篩選出的陽(yáng)性克隆中提取出擴(kuò)增的目的基因片段，供進(jìn)一步研究使用。基因克隆的基本步驟從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。基因克隆的7基因克隆的基本步驟基因克隆的基本步驟8粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端9酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子10重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!11篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸12大量生長(zhǎng)提取大量質(zhì)粒酶切鑒定大量生長(zhǎng)提取大量質(zhì)粒酶切鑒定13您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步驟！分離目的基因和載體DNA。用合適的酶切割上述兩者，產(chǎn)生匹配的末端。連接酶將目的基因裝入載體。轉(zhuǎn)入細(xì)菌。篩選具有抗藥性克隆。您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步驟！分離目的基因和載體DNA。14（二）重組DNA中的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶連接酶聚合酶多聚核苷酸激酶堿性磷酸酶（二）重組DNA中的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶151.限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）定義：能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)核酸內(nèi)切酶。主要來(lái)源于原核生物，可將侵入宿主細(xì)胞的外源性DNA迅速降解，而對(duì)細(xì)菌自身的DNA，則通過(guò)甲基化酶在該限制酶切位點(diǎn)甲基化修飾而保護(hù)自身的DNA不被降解。限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)。限制性?xún)?nèi)切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。1.限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonu16限制酶的命名

限制酶的命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定。通常有三個(gè)斜體字母的縮寫(xiě)表示。第一個(gè)大寫(xiě)字母取自細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母；第二、三個(gè)小寫(xiě)字母取自微生物種名的頭兩個(gè)字母；第四個(gè)字母代表該微生物同種內(nèi)不同的株系；如果同一株名發(fā)現(xiàn)幾種限制酶，則根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序，用羅馬數(shù)字表示。例如，從大腸桿菌（EscherichiaColi）RY13株中發(fā)現(xiàn)分離的第一種限制酶，稱(chēng)為EcoRI。限制酶的命名17限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)和特點(diǎn)

根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割DNA方式不同，可分為I、II、III型。重組DNA技術(shù)中常用的是II型限制性?xún)?nèi)切酶。II型酶作用特點(diǎn)是有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序，以?xún)?nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5'端為磷酸基，3'端為羥基。識(shí)別順序一般為4~6個(gè)堿基，通常是回文結(jié)構(gòu)（palindrome）。限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)和特點(diǎn)根據(jù)限制酶的組成、輔18回文結(jié)構(gòu)

II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA位點(diǎn)的核苷酸序列呈二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)，通常稱(chēng)這種特殊的結(jié)構(gòu)順序?yàn)榛匚慕Y(jié)構(gòu)。

EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAAG…5'回文結(jié)構(gòu)19II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口：在對(duì)稱(chēng)軸中心同時(shí)切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱(chēng)鈍性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口：5'…GTT▼A20在對(duì)稱(chēng)軸兩側(cè)相對(duì)位點(diǎn)分別切割一條鏈。從5’端切割產(chǎn)生

5'端突出的粘性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'從3'端切割產(chǎn)生3'端突出的粘性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'在對(duì)稱(chēng)軸兩側(cè)相對(duì)位點(diǎn)分別切割一條鏈。從5’端切割產(chǎn)生21表15-2一些常用的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)表15-2一些常用的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)22一些限制酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但能產(chǎn)生相同類(lèi)型的粘性末端，稱(chēng)為同尾酶，所產(chǎn)生的末端稱(chēng)配伍末端（compatibleend），可進(jìn)行相互連接。產(chǎn)生平末端的酶切割DNA后，也可彼此連接。一些限制酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但能產(chǎn)生23連接酶可催化DNA分子中相鄰5'磷酸和3'羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接。常用的有T4（噬菌體）DNA連接酶和E.ColiDNA連接酶。2.DNA連接酶3.聚合酶重組DNA技術(shù)中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA為模板在體外合成DNA或RNA?？煞譃镈NA聚合酶和RNA聚合酶兩大類(lèi)。連接酶可催化DNA分子中相鄰5'磷酸和3'24

名稱(chēng) 功能及應(yīng)用 大腸桿菌DNA聚合酶I以DNA為模板，催化5’→3’核酸鏈的延長(zhǎng)，另有3’→5’的外切酶

大片段（klenow）活性。常用于DNA3’末端的標(biāo)記和填充、cDNA第二鏈的合成、DNA測(cè)序。TaqDNA聚合酶以DNA為模板，催化5’→3’核酸鏈的延長(zhǎng)，另有弱的5’→3’的外切酶活性，耐高溫。常用于PCR及DNA測(cè)序。末端轉(zhuǎn)移酶催化NTP中的NMP通過(guò)其磷酸基與DNA3’-OH連接而使DNA鏈延長(zhǎng)，無(wú)需模板。常用于3'端標(biāo)記或形成DNA共聚尾巴。逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，合成cDNA鏈（5’→3’），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二鏈的合成及反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA。常用于離體條件下，合成單鏈RNA作為雜交探針。名稱(chēng) 25T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）催化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5'末端羥基上。常用于單鏈或雙鏈DNA和RNA探針的5'端標(biāo)記。4.多聚核苷酸激酶5.堿性磷酸酶牛小腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP），催化DNA或RNA的5'磷酸基水解。常用于去除線狀載體DNA兩端的5'磷酸基團(tuán)，防止載體自身連接環(huán)化；也用于用32P標(biāo)記DNA的5'末端之前除去原來(lái)的5'磷酸基。T4多核苷酸激酶（polynucleoti26

應(yīng)用重組DNA技術(shù)有時(shí)是為分離、獲得某一感興趣的基因或DNA片段，或是獲得感興趣的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)。這些感興趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有兩種類(lèi)型，即cDNA和基因組DNA。（三）目的基因（targetgene）應(yīng)用重組DNA技術(shù)有時(shí)是為分離、獲得某一感27（四）基因工程載體基因載體：或稱(chēng)克隆載體（cloningvector）,是在基因工程中為“攜帶”感興趣的外源DNA（目的基因、外源基因）、實(shí)現(xiàn)外源DNA的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子，具有自我復(fù)制和表達(dá)功能。其中，為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而特異設(shè)計(jì)的克隆載體又稱(chēng)表達(dá)載體。（四）基因工程載體基因載體：或稱(chēng)克隆載體（cloning28

能自主復(fù)制并能帶動(dòng)插入的目的基因一起復(fù)制。具有一個(gè)以上的單一限制性酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)，multiplecloningsites），以便目的基因的插入。具有合適的篩選標(biāo)記（如抗藥性基因，酶基因等），以便篩選陽(yáng)性克隆。載體分子量小，以便容納較大目的基因，拷貝數(shù)高。在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，以便確保重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。理想載體應(yīng)具備的基本條件能自主復(fù)制并能帶動(dòng)插入的目的基因一起復(fù)制。理想載體應(yīng)具備的29載體的分類(lèi)

質(zhì)粒（plasmid）

噬菌體（phage）

病毒（virus）

克隆載體（cloningvector）

表達(dá)載體（expressionvector）常用的載體按來(lái)源分為載體按得到的產(chǎn)物分類(lèi)可分為載體的分類(lèi)30質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，能在宿主細(xì)胞獨(dú)立自主地進(jìn)行復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時(shí)保持恒定地傳給子代細(xì)胞。質(zhì)粒帶有某些遺傳信息，會(huì)賦予宿主細(xì)胞新的遺傳性狀。因?yàn)橘|(zhì)粒DNA有自我復(fù)制功能及攜帶遺傳信息等特性，可作為重組DNA操作的載體。染色體質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體31

pBR322質(zhì)粒圖譜氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克隆位點(diǎn)pBR322質(zhì)粒圖譜氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克32噬菌體載體噬菌體是一種細(xì)菌病毒，可作為克隆載體。目前使用的噬菌體載體主要有λ噬菌體衍生物載體、M13噬菌體載體等。除M13噬菌體載體外，這類(lèi)載體的特點(diǎn)是其容量比質(zhì)粒載體大，即可插入較大的外源DNA片段（如20kb以上）?？梢栽隗w外包裝產(chǎn)生感染性很高的噬菌體顆粒。噬菌體載體噬菌體是一種細(xì)菌病毒，可作為克隆載33噬菌體頭部尾部尾絲噬菌體頭部尾部尾絲34

λ噬菌體

λ噬菌體（lambdlabacteriophage）是一種大腸桿菌病毒，為線性雙鏈DNA，它的兩端各有12個(gè)堿基的互補(bǔ)粘性末端，稱(chēng)COS位點(diǎn)。當(dāng)噬菌體侵入宿主細(xì)胞，兩個(gè)粘性末端互補(bǔ)結(jié)合，形成環(huán)狀分子。λDNA在體外可包裝成病毒顆粒，并高效感染大腸桿菌。λ噬菌體35λ噬菌體侵入細(xì)菌后，即可裂解生長(zhǎng)（環(huán)狀DNA在細(xì)菌中多次復(fù)制，合成大量噬菌體基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌），又可以溶源生長(zhǎng)（λ噬菌體DNA整合到細(xì)胞染色體基因組DNA中，與染色體DNA一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解）。λ噬菌體侵入細(xì)菌后，即可裂解生長(zhǎng)（環(huán)狀DNA在細(xì)菌中多次復(fù)36噬菌體感染細(xì)菌示意圖裂解生長(zhǎng)噬菌體感染細(xì)菌示意圖裂解生長(zhǎng)37λ噬菌體基因組中有較大區(qū)域僅與溶源生長(zhǎng)有關(guān)，而對(duì)裂解生長(zhǎng)并非絕對(duì)需要，因此可以缺失或被外源DNA取代。經(jīng)改造的λ噬菌體衍生載體可分兩類(lèi):一類(lèi)是插入型載體，即外源基因插入到載體上單一的限制酶位點(diǎn)，如λgt系列等。另一類(lèi)是置換型，即兩個(gè)限制酶位點(diǎn)之間的DNA片段可被外源DNA取代，如Charon，EMBL系列等。λ噬菌體基因組中有較大區(qū)域僅與溶源生長(zhǎng)有關(guān)，38基因工程與基因重組課件39M13噬菌體載體

M13噬菌體基因組是單鏈環(huán)狀DNA，當(dāng)它侵犯宿主菌后，在細(xì)菌胞內(nèi)酶的作用下，單鏈DNA轉(zhuǎn)變成復(fù)制型雙鏈DNA，可提取出來(lái)做基因重組。經(jīng)改造的M13噬菌體有M13mp系列和pUC系列。M13噬菌體載體M13噬菌體基因組是單鏈環(huán)40M13噬菌體載體—pUC19α互補(bǔ)：?jiǎn)为?dú)存在的α及ω片段都沒(méi)有半乳糖苷酶的活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞內(nèi)才有半乳糖苷酶活性，使特異性作用物（X-gal）變?yōu)樗{(lán)色化合物。突變型lac-E.coli表達(dá)β-半乳糖苷酶的ω片段。如果插入的外源基因是在lacZ’基因內(nèi)，就會(huì)影響lacZ’的表達(dá)，利用lac-E.coli為轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，在含X-gal的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色菌落；若無(wú)外源基因插入，則出現(xiàn)藍(lán)色菌落。多克隆位點(diǎn)編碼β-半乳糖苷酶的α片段M13噬菌體載體—pUC19α互補(bǔ)：?jiǎn)为?dú)存在的α及ω片段41病毒載體是一類(lèi)真核載體，能把基因引入到真核細(xì)胞中，并在其中被表達(dá)。因此是研究真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控的有力工具。如:腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乳頭瘤病毒等。病毒載體42二、重組DNA技術(shù)基本原理

目的基因的獲取克隆載體的選擇和構(gòu)建外源基因與載體的連接

重組DNA導(dǎo)入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達(dá)二、重組DNA技術(shù)基本原理目的基因的獲取43（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法基因組DNAcDNA聚合酶鏈反應(yīng)（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法441.化學(xué)合成法

已知某種基因的核苷酸序列，或根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出編碼該多肽鏈的核苷酸序列，再利用DNA合成儀通過(guò)化學(xué)合成原理合成目的基因。利用該法合成的基因有：人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡肽、干擾素基因等1.化學(xué)合成法已知某種基因的核苷酸序列452.基因組DNA利用限制性核酸內(nèi)切酶將染色體DNA切割成一定基因水平的許多片段，將這些片段與適當(dāng)?shù)目寺≥d體拼接成重組DNA分子，繼而轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，使每個(gè)細(xì)菌內(nèi)都攜帶一種重組DNA分子的多個(gè)拷貝。不同細(xì)菌所包含的重組DNA分子可能為不同的染色體DNA片段，這樣全部轉(zhuǎn)化細(xì)菌所攜帶的各種染色體片段就代表了染色體的整個(gè)基因組。存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合稱(chēng)為基因組DNA文庫(kù)（genomicDNAlibrary）?；蚪MDNA文庫(kù)涵蓋了基因組全部的遺傳信息。2.基因組DNA利用限制性核酸內(nèi)切酶將46

建立基因組文庫(kù)后，需結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多轉(zhuǎn)化子菌落中選出含有某一基因的菌落，再進(jìn)行擴(kuò)增，將重組DNA分離、回收，以獲得目的基因。建立基因組文庫(kù)后，需結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多473.cDNA

把細(xì)胞總mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成總cDNA，再與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，從而得到含有某種生物體全部cDNA集合（稱(chēng)為cDNA文庫(kù)，cDNAlibrary）。然后用適當(dāng)?shù)姆椒◤腸DNA文庫(kù)中篩選出目的cDNA。3.cDNA把細(xì)胞總mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄48

cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)是它只包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列，且不包括內(nèi)含子及調(diào)控序列，所以cDNA文庫(kù)的復(fù)雜性要比基因組文庫(kù)低的多。但由于不同的細(xì)胞類(lèi)型、發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達(dá)所決定的，因此各自的mRNA種類(lèi)就不同，由此產(chǎn)生的cDNA又是獨(dú)特的。與基因組DNA文庫(kù)類(lèi)似，由總mRNA制作的cDNA文庫(kù)包含了細(xì)胞表達(dá)的各種mRNA信息，自然也含有我們感興趣的編碼cDNA。cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)是它只包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRN494.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）參見(jiàn)437頁(yè)4.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainrea50ChainReactionPolymerasechainreactionPCR的產(chǎn)物數(shù)目以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)中子的釋放數(shù)目以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)中子原子核短時(shí)間內(nèi)巨大的能量釋放，原子爆炸DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理論上可達(dá)2n個(gè)拷貝原料（pg）產(chǎn)物(ug)ChainReactionPolymerasechain51PCR的基本原理體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA片段的技術(shù)。其原理類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間等，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增PCR的基本原理體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA52DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：模板DNA（基因組DNA），隨機(jī)小分子RNA引物，dNTPs酶：DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37℃反應(yīng)過(guò)程：模板DNA解旋、引發(fā)體的形成、延長(zhǎng)（三階段）產(chǎn)物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍

原料：模板DNA（基因組DNA，cDNA）一對(duì)特異性寡核苷酸引物，dNTPs酶：TaqDNA聚合酶反應(yīng)條件：合適的緩沖液，三種變化的溫度（94，50-70，72℃），一定的循環(huán)數(shù)（25-35）反應(yīng)過(guò)程：DNA模板變性（解鏈）、模板與引物退火、引物延伸（三階段，多循環(huán)）產(chǎn)物：目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍PCR：DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：模板DNA（基因組DNA），原料：模53DNA模板變性與體內(nèi)DNA解鏈過(guò)程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過(guò)95℃左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA

DNA模板變性與體內(nèi)DNA解鏈過(guò)程不同，PCR中作為模板的雙54模板與引物退火

PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時(shí)的引物（primer）,這兩個(gè)引物分別與待擴(kuò)增模板DNA的目標(biāo)片段兩端的序列互補(bǔ)。在降低溫度的過(guò)程中，通過(guò)控制退火條件，引物就能準(zhǔn)確地與擴(kuò)增區(qū)域的兩端配對(duì)。primers模板與引物退火PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時(shí)55⑴引物短，不易纏繞；⑵設(shè)計(jì)的引物是與模板DNA兩端序列互補(bǔ)；⑶引物的量遠(yuǎn)大于模板分子的量，引物與模板DNA形成雙鏈的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA分子自身的復(fù)性。⑴引物短，不易纏繞；56引物延伸在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按堿基配對(duì)的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補(bǔ)的復(fù)制鏈。Taq酶dNTPS新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。

引物延伸在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中57

熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，即n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。而實(shí)際上，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為（1+X）n，X為擴(kuò)增效率，平均為75%熱變性-復(fù)性-延伸25-35次循環(huán)百萬(wàn)倍擴(kuò)增熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)每一循環(huán)58盡管PCR擴(kuò)增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴(kuò)增并不是一個(gè)無(wú)限制的過(guò)程。在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，就會(huì)出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)

(Plateau)，產(chǎn)物的量不再增加?！捌脚_(tái)效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。盡管PCR擴(kuò)增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴(kuò)增并不59（三）外源基因與載體的連接（二）克隆載體的選擇

粘性末端連接平端連接同聚物加尾連接人工接頭連接（三）外源基因與載體的連接（二）克隆載體的選擇粘性末端601.粘性末端連接外源DNA片段與載體用同一種限制性?xún)?nèi)切酶切割，獲得相同的粘性末端，相互互補(bǔ)配對(duì)，在DNA連接酶作用下，形成重組DNA分子。5’…C▼CGG…3’5’…C▼CGG…3’3’…GGC▲C…5’3’…GGC▲C…5’HpaII1.粘性末端連接外源DNA片段與載體用同一種612.平端連接因載體分子和目的DNA分子之間并不一定都產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，有的限制性?xún)?nèi)切酶只能切成平末端。平末端仍用T4DNA連接酶連接，只是效率低，需要的DNA濃度更高。2.平端連接623.同聚物加尾連接同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如polyG與polyC之間的退火作用完成連接。在末端轉(zhuǎn)移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如將poly（dC）加到雙鏈DNA片段3'羥基上，而將poly（dG）加到質(zhì)粒載體3'羥基上，制造出粘性末端，然后進(jìn)行粘性末端連接。3.同聚物加尾連接同聚物加尾連接是利用634.人工接頭連接接頭（linker）是指人工合成的一段雙鏈寡核苷酸，其中包含一個(gè)（或兩個(gè)）酶切位點(diǎn)。首先將接頭與目的DNA片段進(jìn)行平末端連接，繼而用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶將接頭部位切出粘性末端，最后與載體進(jìn)行粘性末端連接。4.人工接頭連接64（四）重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞

在分子克隆中，將質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化（transformation）。以噬菌體和真核病毒作載體構(gòu)建的重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)染（transfection）。

基因片段（特別是純化的DNA）很難直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，通常將受體細(xì)胞預(yù)先加以處理，使其提高基因?qū)爰?xì)胞的效率。例如用低溫CaCl2（冰?。┨幚泶竽c桿菌，可以大大提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。這種經(jīng)過(guò)預(yù)處理的、容易導(dǎo)入外源核酸分子的受體細(xì)胞被稱(chēng)作“感受態(tài)細(xì)胞”（competentcell）。（四）重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞在分子克隆中，將質(zhì)粒65（五）重組體的篩選

通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等方式，重組體DNA分子被導(dǎo)入受體細(xì)胞，經(jīng)適當(dāng)涂布的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到大量轉(zhuǎn)化子菌落或轉(zhuǎn)染噬菌斑。因?yàn)槊恳恢亟M體只攜帶某一段外源基因，而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)每一受體菌又只能接受一個(gè)重組體分子，所以設(shè)法將眾多的轉(zhuǎn)化菌落或噬菌斑區(qū)分開(kāi)來(lái)，并鑒定哪一菌落或噬菌斑所含的重組DNA分子確實(shí)帶有目的基因，即可得到目的基因的克隆，這一過(guò)程即為篩選（screening）。（五）重組體的篩選通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等方式，重66根據(jù)載體體系、宿主細(xì)胞特性及外源基因在受體細(xì)胞表達(dá)情況不同，可采取不同的篩選方法。1.直接篩選法（1）抗藥性標(biāo)志篩選（2）標(biāo)志補(bǔ)救（3）分子雜交法2.非直接篩選法免疫學(xué)方法根據(jù)載體體系、宿主細(xì)胞特性及外源基因在受體細(xì)67抗藥性標(biāo)志篩選

如果克隆載體攜帶有某種抗藥性標(biāo)志基因，如Ampr或Tetr，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗生素的培養(yǎng)板上生存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。如果重組DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，如插入Tetr內(nèi)，使標(biāo)志基因Tetr失活，陽(yáng)性重組子則不能在含有Tet的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)。用插入失活篩選的重組子載體往往帶有另一個(gè)抗生素抗性基因如Ampr，因此可以通過(guò)雙抗生素對(duì)照篩選，即陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以在含Amp的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)而不能在含Tet的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)?？顾幮詷?biāo)志篩選如果克隆載體攜帶有某種抗藥性68標(biāo)志補(bǔ)救

若克隆的基因能夠在宿主菌內(nèi)表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，則可以利用營(yíng)養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選，這就是標(biāo)志補(bǔ)救（markerrescue）。-互補(bǔ)：通過(guò)藍(lán)白斑篩選可以篩選、鑒定重組體與非重組體載體。標(biāo)志補(bǔ)救若克隆的基因能夠在宿主菌內(nèi)表達(dá)，且表69當(dāng)外源基因插入后，LacZ’基因被破壞，不能合成完整的β-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色β-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入后，LacZ’基因被破壞，不能合成完整的β-半70分子雜交法（molecularhybridization）參見(jiàn)435頁(yè)分子雜交法（molecularhybridization）71核酸分子雜交（molecularhybridization）：指用標(biāo)記的已知DNA或RNA片段（探針）檢測(cè)樣品中未知核酸序列，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)生同源性結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合的核酸序列的位置或大小顯示出來(lái)。探針：帶有可檢測(cè)標(biāo)記的已知序列的DNA或RNA片段。核酸分子雜交的基本原理變性（denaturation）復(fù)性（renaturation）雜交（hybridization）預(yù)雜交（prehybridization）核酸分子雜交（molecularhybridization72變性（denaturation）概念：在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對(duì)的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙股螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，有規(guī)則的結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子。變性的因素：加熱、酸、堿、尿素、甲酰胺等增色效應(yīng)（hyperchroniceffect）：核酸變性時(shí)，紫外吸收值A(chǔ)260隨之升高的現(xiàn)象。變性（denaturation）概念：在某些理化因素的作用下73熱變性

DNA的熔解曲線Tm值（meltingtemperature）:熱變性時(shí)，50%DNA分子變性的溫度。又叫解鏈溫度、熔解溫度。熱變性DNA的熔解曲線74復(fù)性（renaturation）

概念：在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)單鏈重新締合，形成雙鏈的過(guò)程。熱變性后，緩慢降低溫度至比Tm值低20-30℃時(shí)，變性的單鏈DNA可恢復(fù)其雙鏈結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為退火。雜交（hybridization）

來(lái)源不同的兩條單鏈核酸分子通過(guò)堿基互補(bǔ)可形成異源雙螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA雜交分子。復(fù)性（renaturation）概念：在適當(dāng)條件下75預(yù)雜交（prehybridization）概念：為了減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前用封閉物將這些非特異性位點(diǎn)封閉。這一雜交前的處理過(guò)程稱(chēng)為預(yù)雜交。

常用的封閉物：變性的非特異性DNA，如鮭魚(yú)精子DNA、小牛胸腺DNA，又稱(chēng)為覆蓋DNA。預(yù)雜交（prehybridization）概念：為了76變性、復(fù)性、雜交示意圖變性、復(fù)性、雜交示意圖77核酸探針：帶有可檢測(cè)標(biāo)記的已知DNA或RNA片段，用于檢測(cè)待測(cè)樣品中的靶核酸序列。探針?lè)诸?lèi)放射性標(biāo)記核酸探針?lè)欠派湫詷?biāo)記核酸探針核酸探針：帶有可檢測(cè)標(biāo)記的已知DNA或RNA片段，用于檢測(cè)待78印跡雜交

概念：指將待測(cè)核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。探針與待測(cè)核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針?lè)肿语@示的位置及其量的多少可反應(yīng)出待測(cè)的核酸分子是否存在相應(yīng)的基因序列及其大小。

分類(lèi)DNA印跡雜交（Southernblotting）RNA印跡雜交（Northernblotting）印跡雜交概念：指將待測(cè)核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，79提取DNA限制性?xún)?nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜與DNA或RNA探針雜交放射自顯影DNA印跡雜交（Southernblotting）檢測(cè)靶分子為DNA,檢測(cè)靶分子是否含有目的基因提取DNA限制性?xún)?nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜與80將瓊脂糖凝膠上的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上將瓊脂糖凝膠上的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上81

菌落原位雜交（Insituhybridization）含有與探針互補(bǔ)序列的菌落或噬菌斑經(jīng)放射自顯影后，在X光底片上出現(xiàn)雜交點(diǎn)。將轉(zhuǎn)化后得到的菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移到NC膜上，得到一個(gè)與平板菌落或噬菌斑分布完全一致的復(fù)制品。原位裂解細(xì)胞，堿變性，核酸分子被固定于膜上加入標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交根據(jù)陽(yáng)性反應(yīng)位置，可從保留的母板上挑出所需的陽(yáng)性克隆。菌落原位雜交（Insituhybridization）82RNA印跡雜交（Northernblotting）

檢測(cè)靶分子為RNA。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平，或比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。與Southernblotting不同的是在轉(zhuǎn)移前不需進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶切割。

RNA印跡雜交（Northernblotting）83核酸雜交分類(lèi)表雜交方法適用范圍Southern印跡檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分開(kāi)的DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern印跡檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分開(kāi)的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點(diǎn)雜交檢測(cè)未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑雜交檢測(cè)固定在膜上的、經(jīng)裂解后從細(xì)菌或噬菌體中釋放出的DNA分子原位雜交檢測(cè)細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子核酸雜交分類(lèi)表雜交方法適用范圍Southern印跡檢84免疫學(xué)方法

免疫學(xué)篩選是利用特異抗體與目的基因表達(dá)的抗原產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選，特異性和敏感性也較高，尤其適用于篩選不為宿主菌提供任何選擇標(biāo)記的基因，或者是已獲得了該基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多克隆或單克隆抗體，用這些抗體來(lái)檢測(cè)目的基因表達(dá)的產(chǎn)物。免疫學(xué)方法很多，如Westernblot，免疫化學(xué)方法、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）、放射免疫沉淀、免疫熒光抗體技術(shù)等，可對(duì)目的基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行定性，甚至定量檢測(cè)。免疫學(xué)方法免疫學(xué)篩選是利用特異抗體與目的基因85基因工程的最終目的是在一個(gè)合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達(dá)，從而產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。其過(guò)程包括外源基因克隆，外源基因在宿主細(xì)胞中經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工等過(guò)程表達(dá)相應(yīng)蛋白以及蛋白產(chǎn)物的分離純化等過(guò)程。

（六）克隆基因的表達(dá)基因工程的最終目的是在一個(gè)合適的系統(tǒng)中，使外源基86目前世界范圍內(nèi)開(kāi)發(fā)的基因工程多肽藥物、疫苗、抗體有500多種目前世界范圍內(nèi)開(kāi)發(fā)的基因工程多肽藥物、疫苗、抗體有500多種87

E.coli是當(dāng)前采用最多的原核表達(dá)體系，運(yùn)用E.coli表達(dá)有用的蛋白質(zhì)必須使構(gòu)建的表達(dá)載體符合下列標(biāo)準(zhǔn)：①含大腸桿菌適宜的選擇標(biāo)志②具有能調(diào)控轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生大量mRNA的強(qiáng)啟動(dòng)子③含適當(dāng)?shù)姆g控制序列④含有合理設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)，以確保目的基因按一定方向與載體正確連接。外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)

E.coli是當(dāng)前采用最多的原核表達(dá)體系，88E.coli表達(dá)體系在實(shí)際應(yīng)用中不足之處：①缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，E.coli表達(dá)體系只能表達(dá)克隆的cDNA，不宜表達(dá)真核基因組DNA②缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機(jī)制，E.coli表達(dá)體系的真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或進(jìn)行糖基化修飾③表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體④很難在E.coli表達(dá)體系中表達(dá)大量的可溶性蛋白質(zhì)E.coli表達(dá)體系在實(shí)際應(yīng)用中不足之處：89外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)

目前常用的真核表達(dá)體系有酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系。利用真核細(xì)胞作為基因的表達(dá)體系已被證明具有許多原核表達(dá)體系所不具備的優(yōu)勢(shì)①不僅可以表達(dá)克隆的cDNA,也可表達(dá)真核基因組DNA

②識(shí)別和去除內(nèi)含子,經(jīng)剪接加工形成成熟的mRNA③對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后加工,最大限度地保證蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性

外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)目前常用的真核表達(dá)體系有酵90三、DNA重組技術(shù)對(duì)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn)對(duì)人類(lèi)遺傳信息的認(rèn)識(shí)基因工程藥物與疫苗轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物基因診斷與基因治療三、DNA重組技術(shù)對(duì)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn)對(duì)人類(lèi)遺傳信91鐮刀型紅細(xì)胞貧血鐮刀型紅細(xì)胞貧血92Chehab等設(shè)計(jì)一對(duì)引物把含有突變的DNA片段（共294bp）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶OxaNI消化，瓊脂糖凝膠電泳后染色觀察：正常人有2個(gè)片段，191和103bp，鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的

純合子，僅有一個(gè)片段294bp

雜合子有191、103和294bp3個(gè)片段Chehab等設(shè)計(jì)一對(duì)引物把含有突變的DNA片段（共93

思考題一、基本概念DNA重組技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶回文結(jié)構(gòu)目的基因基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)

α-互補(bǔ)

94二、簡(jiǎn)述題1.何謂基因重組技術(shù)，簡(jiǎn)述其基本過(guò)程。2.何謂目的基因，有哪些來(lái)源？3.解釋基因載體，哪些DNA可作為基因載體？4.E.coli表達(dá)體系和真核表達(dá)體系各自的優(yōu)、缺點(diǎn)。

二、簡(jiǎn)述題95演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！96基因重組與基因工程基因重組與基因工程97生物工程定義生物工程是生物技術(shù)的總稱(chēng)，是對(duì)生命有機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平、組織水平、個(gè)體水平進(jìn)行不同層次的創(chuàng)造性設(shè)計(jì)和改造，使之能定向組建具有特定性狀的新物種或新品系，從而造福人類(lèi)的現(xiàn)代應(yīng)用技術(shù)學(xué)科。生物工程定義生物工程是生物技術(shù)的總稱(chēng)98生物技術(shù)的四大體系基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程生物技術(shù)的四大體系基因工程99

重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)——同源的或異源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得該DNA分子的大量拷貝。這類(lèi)克隆是在分子水平上操作，故又稱(chēng)分子克隆（molecularcloning）。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克隆重組DNA技術(shù)（recombina100

由于DNA克隆研究對(duì)象常常是特異的基因片段，所以又稱(chēng)作基因克?。╣enecloning）。實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作統(tǒng)稱(chēng)為基因工程（geneticengineering）。由于DNA克隆研究對(duì)象常常是特異的基因片段1011997年2月23日英國(guó)Wilmut1997年2月23日102

從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。用合適的酶切割目的基因和載體，產(chǎn)生匹配的末端在體外，將目的基因片段連接到能自我復(fù)制的并且具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱(chēng)宿主細(xì)胞），并與之一起增殖。

篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。從篩選出的陽(yáng)性克隆中提取出擴(kuò)增的目的基因片段，供進(jìn)一步研究使用。基因克隆的基本步驟從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。基因克隆的103基因克隆的基本步驟基因克隆的基本步驟104粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端105酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子106重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!107篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸108大量生長(zhǎng)提取大量質(zhì)粒酶切鑒定大量生長(zhǎng)提取大量質(zhì)粒酶切鑒定109您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步驟！分離目的基因和載體DNA。用合適的酶切割上述兩者，產(chǎn)生匹配的末端。連接酶將目的基因裝入載體。轉(zhuǎn)入細(xì)菌。篩選具有抗藥性克隆。您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步驟！分離目的基因和載體DNA。110（二）重組DNA中的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶連接酶聚合酶多聚核苷酸激酶堿性磷酸酶（二）重組DNA中的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶1111.限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）定義：能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)核酸內(nèi)切酶。主要來(lái)源于原核生物，可將侵入宿主細(xì)胞的外源性DNA迅速降解，而對(duì)細(xì)菌自身的DNA，則通過(guò)甲基化酶在該限制酶切位點(diǎn)甲基化修飾而保護(hù)自身的DNA不被降解。限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)。限制性?xún)?nèi)切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。1.限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonu112限制酶的命名

限制酶的命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定。通常有三個(gè)斜體字母的縮寫(xiě)表示。第一個(gè)大寫(xiě)字母取自細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母；第二、三個(gè)小寫(xiě)字母取自微生物種名的頭兩個(gè)字母；第四個(gè)字母代表該微生物同種內(nèi)不同的株系；如果同一株名發(fā)現(xiàn)幾種限制酶，則根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序，用羅馬數(shù)字表示。例如，從大腸桿菌（EscherichiaColi）RY13株中發(fā)現(xiàn)分離的第一種限制酶，稱(chēng)為EcoRI。限制酶的命名113限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)和特點(diǎn)

根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割DNA方式不同，可分為I、II、III型。重組DNA技術(shù)中常用的是II型限制性?xún)?nèi)切酶。II型酶作用特點(diǎn)是有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序，以?xún)?nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5'端為磷酸基，3'端為羥基。識(shí)別順序一般為4~6個(gè)堿基，通常是回文結(jié)構(gòu)（palindrome）。限制性?xún)?nèi)切酶的分類(lèi)和特點(diǎn)根據(jù)限制酶的組成、輔114回文結(jié)構(gòu)

II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA位點(diǎn)的核苷酸序列呈二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)，通常稱(chēng)這種特殊的結(jié)構(gòu)順序?yàn)榛匚慕Y(jié)構(gòu)。

EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAAG…5'回文結(jié)構(gòu)115II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口：在對(duì)稱(chēng)軸中心同時(shí)切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱(chēng)鈍性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口：5'…GTT▼A116在對(duì)稱(chēng)軸兩側(cè)相對(duì)位點(diǎn)分別切割一條鏈。從5’端切割產(chǎn)生

5'端突出的粘性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'從3'端切割產(chǎn)生3'端突出的粘性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'在對(duì)稱(chēng)軸兩側(cè)相對(duì)位點(diǎn)分別切割一條鏈。從5’端切割產(chǎn)生117表15-2一些常用的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)表15-2一些常用的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)118一些限制酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但能產(chǎn)生相同類(lèi)型的粘性末端，稱(chēng)為同尾酶，所產(chǎn)生的末端稱(chēng)配伍末端（compatibleend），可進(jìn)行相互連接。產(chǎn)生平末端的酶切割DNA后，也可彼此連接。一些限制酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但能產(chǎn)生119連接酶可催化DNA分子中相鄰5'磷酸和3'羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接。常用的有T4（噬菌體）DNA連接酶和E.ColiDNA連接酶。2.DNA連接酶3.聚合酶重組DNA技術(shù)中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA為模板在體外合成DNA或RNA?？煞譃镈NA聚合酶和RNA聚合酶兩大類(lèi)。連接酶可催化DNA分子中相鄰5'磷酸和3'120

名稱(chēng) 功能及應(yīng)用 大腸桿菌DNA聚合酶I以DNA為模板，催化5’→3’核酸鏈的延長(zhǎng)，另有3’→5’的外切酶

大片段（klenow）活性。常用于DNA3’末端的標(biāo)記和填充、cDNA第二鏈的合成、DNA測(cè)序。TaqDNA聚合酶以DNA為模板，催化5’→3’核酸鏈的延長(zhǎng)，另有弱的5’→3’的外切酶活性，耐高溫。常用于PCR及DNA測(cè)序。末端轉(zhuǎn)移酶催化NTP中的NMP通過(guò)其磷酸基與DNA3’-OH連接而使DNA鏈延長(zhǎng)，無(wú)需模板。常用于3'端標(biāo)記或形成DNA共聚尾巴。逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，合成cDNA鏈（5’→3’），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二鏈的合成及反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA。常用于離體條件下，合成單鏈RNA作為雜交探針。名稱(chēng) 121T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）催化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5'末端羥基上。常用于單鏈或雙鏈DNA和RNA探針的5'端標(biāo)記。4.多聚核苷酸激酶5.堿性磷酸酶牛小腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP），催化DNA或RNA的5'磷酸基水解。常用于去除線狀載體DNA兩端的5'磷酸基團(tuán)，防止載體自身連接環(huán)化；也用于用32P標(biāo)記DNA的5'末端之前除去原來(lái)的5'磷酸基。T4多核苷酸激酶（polynucleoti122

應(yīng)用重組DNA技術(shù)有時(shí)是為分離、獲得某一感興趣的基因或DNA片段，或是獲得感興趣的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)。這些感興趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有兩種類(lèi)型，即cDNA和基因組DNA。（三）目的基因（targetgene）應(yīng)用重組DNA技術(shù)有時(shí)是為分離、獲得某一感123（四）基因工程載體基因載體：或稱(chēng)克隆載體（cloningvector）,是在基因工程中為“攜帶”感興趣的外源DNA（目的基因、外源基因）、實(shí)現(xiàn)外源DNA的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子，具有自我復(fù)制和表達(dá)功能。其中，為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而特異設(shè)計(jì)的克隆載體又稱(chēng)表達(dá)載體。（四）基因工程載體基因載體：或稱(chēng)克隆載體（cloning124

能自主復(fù)制并能帶動(dòng)插入的目的基因一起復(fù)制。具有一個(gè)以上的單一限制性酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)，multiplecloningsites），以便目的基因的插入。具有合適的篩選標(biāo)記（如抗藥性基因，酶基因等），以便篩選陽(yáng)性克隆。載體分子量小，以便容納較大目的基因，拷貝數(shù)高。在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，以便確保重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。理想載體應(yīng)具備的基本條件能自主復(fù)制并能帶動(dòng)插入的目的基因一起復(fù)制。理想載體應(yīng)具備的125載體的分類(lèi)

質(zhì)粒（plasmid）

噬菌體（phage）

病毒（virus）

克隆載體（cloningvector）

表達(dá)載體（expressionvector）常用的載體按來(lái)源分為載體按得到的產(chǎn)物分類(lèi)可分為載體的分類(lèi)126質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，能在宿主細(xì)胞獨(dú)立自主地進(jìn)行復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時(shí)保持恒定地傳給子代細(xì)胞。質(zhì)粒帶有某些遺傳信息，會(huì)賦予宿主細(xì)胞新的遺傳性狀。因?yàn)橘|(zhì)粒DNA有自我復(fù)制功能及攜帶遺傳信息等特性，可作為重組DNA操作的載體。染色體質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體127

pBR322質(zhì)粒圖譜氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克隆位點(diǎn)pBR322質(zhì)粒圖譜氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克128噬菌體載體噬菌體是一種細(xì)菌病毒，可作為克隆載體。目前使用的噬菌體載體主要有λ噬菌體衍生物載體、M13噬菌體載體等。除M13噬菌體載體外，這類(lèi)載體的特點(diǎn)是其容量比質(zhì)粒載體大，即可插入較大的外源DNA片段（如20kb以上）?？梢栽隗w外包裝產(chǎn)生感染性很高的噬菌體顆粒。噬菌體載體噬菌體是一種細(xì)菌病毒，可作為克隆載129噬菌體頭部尾部尾絲噬菌體頭部尾部尾絲130

λ噬菌體

λ噬菌體（lambdlabacteriophage）是一種大腸桿菌病毒，為線性雙鏈DNA，它的兩端各有12個(gè)堿基的互補(bǔ)粘性末端，稱(chēng)COS位點(diǎn)。當(dāng)噬菌體侵入宿主細(xì)胞，兩個(gè)粘性末端互補(bǔ)結(jié)合，形成環(huán)狀分子。λDNA在體外可包裝成病毒顆粒，并高效感染大腸桿菌。λ噬菌體131λ噬菌體侵入細(xì)菌后，即可裂解生長(zhǎng)（環(huán)狀DNA在細(xì)菌中多次復(fù)制，合成大量噬菌體基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌），又可以溶源生長(zhǎng)（λ噬菌體DNA整合到細(xì)胞染色體基因組DNA中，與染色體DNA一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解）。λ噬菌體侵入細(xì)菌后，即可裂解生長(zhǎng)（環(huán)狀DNA在細(xì)菌中多次復(fù)132噬菌體感染細(xì)菌示意圖裂解生長(zhǎng)噬菌體感染細(xì)菌示意圖裂解生長(zhǎng)133λ噬菌體基因組中有較大區(qū)域僅與溶源生長(zhǎng)有關(guān)，而對(duì)裂解生長(zhǎng)并非絕對(duì)需要，因此可以缺失或被外源DNA取代。經(jīng)改造的λ噬菌體衍生載體可分兩類(lèi):一類(lèi)是插入型載體，即外源基因插入到載體上單一的限制酶位點(diǎn)，如λgt系列等。另一類(lèi)是置換型，即兩個(gè)限制酶位點(diǎn)之間的DNA片段可被外源DNA取代，如Charon，EMBL系列等。λ噬菌體基因組中有較大區(qū)域僅與溶源生長(zhǎng)有關(guān)，134基因工程與基因重組課件135M13噬菌體載體

M13噬菌體基因組是單鏈環(huán)狀DNA，當(dāng)它侵犯宿主菌后，在細(xì)菌胞內(nèi)酶的作用下，單鏈DNA轉(zhuǎn)變成復(fù)制型雙鏈DNA，可提取出來(lái)做基因重組。經(jīng)改造的M13噬菌體有M13mp系列和pUC系列。M13噬菌體載體M13噬菌體基因組是單鏈環(huán)136M13噬菌體載體—pUC19α互補(bǔ)：?jiǎn)为?dú)存在的α及ω片段都沒(méi)有半乳糖苷酶的活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞內(nèi)才有半乳糖苷酶活性，使特異性作用物（X-gal）變?yōu)樗{(lán)色化合物。突變型lac-E.coli表達(dá)β-半乳糖苷酶的ω片段。如果插入的外源基因是在lacZ’基因內(nèi)，就會(huì)影響lacZ’的表達(dá)，利用lac-E.coli為轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，在含X-gal的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色菌落；若無(wú)外源基因插入，則出現(xiàn)藍(lán)色菌落。多克隆位點(diǎn)編碼β-半乳糖苷酶的α片段M13噬菌體載體—pUC19α互補(bǔ)：?jiǎn)为?dú)存在的α及ω片段137病毒載體是一類(lèi)真核載體，能把基因引入到真核細(xì)胞中，并在其中被表達(dá)。因此是研究真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控的有力工具。如:腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乳頭瘤病毒等。病毒載體138二、重組DNA技術(shù)基本原理

目的基因的獲取克隆載體的選擇和構(gòu)建外源基因與載體的連接

重組DNA導(dǎo)入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達(dá)二、重組DNA技術(shù)基本原理目的基因的獲取139（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法基因組DNAcDNA聚合酶鏈反應(yīng)（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法1401.化學(xué)合成法

已知某種基因的核苷酸序列，或根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出編碼該多肽鏈的核苷酸序列，再利用DNA合成儀通過(guò)化學(xué)合成原理合成目的基因。利用該法合成的基因有：人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡肽、干擾素基因等1.化學(xué)合成法已知某種基因的核苷酸序列1412.基因組DNA利用限制性核酸內(nèi)切酶將染色體DNA切割成一定基因水平的許多片段，將這些片段與適當(dāng)?shù)目寺≥d體拼接成重組DNA分子，繼而轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，使每個(gè)細(xì)菌內(nèi)都攜帶一種重組DNA分子的多個(gè)拷貝。不同細(xì)菌所包含的重組DNA分子可能為不同的染色體DNA片段，這樣全部轉(zhuǎn)化細(xì)菌所攜帶的各種染色體片段就代表了染色體的整個(gè)基因組。存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合稱(chēng)為基因組DNA文庫(kù)（genomicDNAlibrary）?；蚪MDNA文庫(kù)涵蓋了基因組全部的遺傳信息。2.基因組DNA利用限制性核酸內(nèi)切酶將142

建立基因組文庫(kù)后，需結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多轉(zhuǎn)化子菌落中選出含有某一基因的菌落，再進(jìn)行擴(kuò)增，將重組DNA分離、回收，以獲得目的基因。建立基因組文庫(kù)后，需結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多1433.cDNA

把細(xì)胞總mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成總cDNA，再與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，從而得到含有某種生物體全部cDNA集合（稱(chēng)為cDNA文庫(kù)，cDNAlibrary）。然后用適當(dāng)?shù)姆椒◤腸DNA文庫(kù)中篩選出目的cDNA。3.cDNA把細(xì)胞總mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄144

cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)是它只包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列，且不包括內(nèi)含子及調(diào)控序列，所以cDNA文庫(kù)的復(fù)雜性要比基因組文庫(kù)低的多。但由于不同的細(xì)胞類(lèi)型、發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達(dá)所決定的，因此各自的mRNA種類(lèi)就不同，由此產(chǎn)生的cDNA又是獨(dú)特的。與基因組DNA文庫(kù)類(lèi)似，由總mRNA制作的cDNA文庫(kù)包含了細(xì)胞表達(dá)的各種mRNA信息，自然也含有我們感興趣的編碼cDNA。cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)是它只包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRN1454.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）參見(jiàn)437頁(yè)4.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainrea146ChainReactionPolymerasechainreactionPCR的產(chǎn)物數(shù)目以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)中子的釋放數(shù)目以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)中子原子核短時(shí)間內(nèi)巨大的能量釋放，原子爆炸DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理論上可達(dá)2n個(gè)拷貝原料（pg）產(chǎn)物(ug)ChainReactionPolymerasechain147PCR的基本原理體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA片段的技術(shù)。其原理類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間等，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增PCR的基本原理體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA148DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：模板DNA（基因組DNA），隨機(jī)小分子RNA引物，dNTPs酶：DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37℃反應(yīng)過(guò)程：模板DNA解旋、引發(fā)體的形成、延長(zhǎng)（三階段）產(chǎn)物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍

原料：模板DNA（基因組DNA，cDNA）一對(duì)特異性寡核苷酸引物，dNTPs酶：TaqDNA聚合酶反應(yīng)條件：合適的緩沖液，三種變化的溫度（94，50-70，72℃），一定的循環(huán)數(shù)（25-35）反應(yīng)過(guò)程：DNA模板變性（解鏈）、模板與引物退火、引物延伸（三階段，多循環(huán)）產(chǎn)物：目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍PCR：DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：模板DNA（基因組DNA），原料：模149DNA模板變性與體內(nèi)DNA解鏈過(guò)程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過(guò)95℃左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA

DNA模板變性與體內(nèi)DNA解鏈過(guò)程不同，PCR中作為模板的雙150模板與引物退火

PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時(shí)的引物（primer）,這兩個(gè)引物分別與待擴(kuò)增模板DNA的目標(biāo)片段兩端的序列互補(bǔ)。在降低溫度的過(guò)程中，通過(guò)控制退火條件，引物就能準(zhǔn)確地與擴(kuò)增區(qū)域的兩端配對(duì)。primers模板與引物退火PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時(shí)151⑴引物短，不易纏繞；⑵設(shè)計(jì)的引物是與模板DNA兩端序列互補(bǔ)；⑶引物的量遠(yuǎn)大于模板分子的量，引物與模板DNA形成雙鏈的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA分子自身的復(fù)性。⑴引物短，不易纏繞；152引物延伸在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按堿基配對(duì)的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補(bǔ)的復(fù)制鏈。Taq酶dNTPS新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。

引物延伸在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中153

熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，即n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。而實(shí)際上，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為（1+X）n，X為擴(kuò)增效率，平均為75%熱變性-復(fù)性-延伸25-35次循環(huán)百萬(wàn)倍擴(kuò)增熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)