實驗二、葉綠素a和同化系數Q的測定課件

實驗二、葉綠素a和同化系數Q的測定1謝謝觀賞2019-8-29實驗二、葉綠素a和同化系數Q的測定1謝謝觀賞2019-8-2一、目的要求1、測定水體中的葉綠素a含量和同化系數；2、掌握初級生產力的測定和計算方法。2謝謝觀賞2019-8-29一、目的要求1、測定水體中的葉綠素a含量和同化系數；2謝謝觀二、方法概述1、分光光度法測葉綠素

浮游植物是海洋最主要的初級生產者，它們所生產的有機物和貯存的能量是海洋食物鏈的基礎。因而海洋初級生產力的測定對海洋有機生產能力以及漁業(yè)資源開發(fā)利用潛力的估算有著十分重要的意義。海洋初級生產力的測定有C14示蹤法和葉綠素法。本實驗主要介紹葉綠素法，該方法是根據一定條件下，植物細胞內葉綠素含量和光合作用產量之間存在一定的相關性，從而根據葉綠素含量和同化系數（coefficientofassimilation）或稱同化指數（assimilationindex）來計算初級生產力。3謝謝觀賞2019-8-29二、方法概述1、分光光度法測葉綠素3謝謝觀賞2019-8-

葉綠素的測定最常應用的方法是用分光光度計測定葉綠素在丙酮溶液中的光密度，其計算公式如下：

chl-a=11.85E664－1.54E647－0.08E630＝Cchl-a(1)chl-b=21.03E647－5.43E664－2.66E630＝Cchl-b(2)chl-c=24.52E630－1.67E664－7.60E647

＝Cchl-c(3)

式中，各波長的E值為用1cm光程比色皿、經750nm波長校正后的吸光值，即上述E值應扣除E750的數值。4謝謝觀賞2019-8-29葉綠素的測定最常應用的方法是用分光光度計測定葉

由于葉綠素a是浮游植物任一種群都具有的特征，而葉綠素b或c不是任一種群都有，因此，通常用葉綠素a（Chl-a）表示初級生產力水平。故

Chl-a（mg/m3）=（4）式中，Cchl-a

為（1）式的計算結果，V丙酮為丙酮的體積（mL），V水樣為過濾水樣體積（L）。5謝謝觀賞2019-8-29由于葉綠素a是浮游植物任一種群都具有的特征，2、熒光光度法測葉綠素近年來，海水葉綠素a含量測定的分光光度法已逐漸被較簡便且靈敏度高的萃取熒光法代替。其原理是葉綠素a的丙酮萃取液受藍光激發(fā)后產生紅色熒光，用熒光計在波長670nm測定提取液酸化前后的熒光值，按下式計算海水葉綠素a的含量：

(5)

式中，Rb—酸化前熒光值；

Ra—酸化后熒光值；

R—純葉綠素a的酸化因子(隨儀器而異）。6謝謝觀賞2019-8-292、熒光光度法測葉綠素6謝謝觀賞2019-8-29

因，故（5）式成為：（6）式中，Fd—測定時熒光計所用量程的換算因子(mg/m3)，其值的確定有幾種方法，具體為：

7謝謝觀賞2019-8-29因，故（5）式成為：7謝謝觀賞2⑴標準葉綠素a校正法：用純葉綠素a配成母液，把母液稀釋成一系列不同濃度的溶液并分別測定熒光讀數，最后用直線回歸法算出標定線的斜率，即Fd。⑵分光光度計校正法：取一定體積處于指數生長期的單細胞藻類，按分光光度法測定葉綠素a的方法，測其吸光值E，按（1）式計算該提取液的Cchl-a。然后將它在熒光計上測定熒光值Rb，按（7）式求得Fd。本實驗采用分光光度計校正法。

(7)8謝謝觀賞2019-8-29⑴標準葉綠素a校正法：用純葉綠素a配成母液，把母液稀釋成一系3、同化系數的測定

把葉綠素a含量換算成調查海區(qū)的初級生產力，必須乘以一個比例系數，稱為同化系數，用Q表示。一般在光飽和條件下，同化系數的值最大。但應當指出，不同類型的藻類種群或同一種群在不同的環(huán)境中，同化系數是不一樣的。因此，最好先用C14示蹤法現場測定同化系數。在無C14示蹤法測定Ｑ的條件下可根據浮游植物光合過程中釋放出氧的量換算成有機碳的固定量，以此固定值除以葉綠素a和培養(yǎng)時間即為同化系數Q。9謝謝觀賞2019-8-293、同化系數的測定9謝謝觀賞2019-8-29

若假設符合光合作用的理想方程為CO2＋H2O

→CH2O＋O2，將所產生的氧的單位轉換成固定碳的單位，則有：（8）式中Q—同化系數，單位為mgC(mgChl-a)-1h-1；h—光照時間（h）；

Chl-a—光照水樣的葉綠素a含量（mg/m3）；

Ol、Od—分別為“白”瓶和“黑”瓶中的溶解氧含量（mgO2/L）。10謝謝觀賞2019-8-29若假設符合光合作用的理想方程為10謝謝觀賞2014、初級生產力的估算

PP=Chl-a×Q×(9)

式中，PP—每日生產力（mgC/m3d）；

Chl-a－海洋水樣的葉綠素a值（用熒光法測定的數值，單位mg/m3）；

D—每日的光照時間，冬天取12h，夏天取13h。11謝謝觀賞2019-8-294、初級生產力的估算11謝謝觀賞2019-8-29三、儀器與試劑1、儀器和玻璃器皿

752紫外光柵分光光度計1臺GFY－160熒光光度計1臺LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱960MR熒光光度計1臺離心機1臺過濾器1個醫(yī)用真空吸引器一臺0.45μm微孔醋酸纖維濾膜若干張250mLBOD瓶2個（黑白各1個）黑布若干塊碘量瓶2個具塞刻度試管4支100mL量筒1個水樣桶2個堿式滴定管1根10mL移液管1支2mL移液管3支1mL移液管1支10mL移液管1支12謝謝觀賞2019-8-29三、儀器與試劑1、儀器和玻璃器皿12謝謝觀賞2019-8-2、試劑

（1）90%丙酮：100mL蒸餾水加上900mL丙酮貯于棕色瓶中。（2）1%MgCO3：取1gMgCO3溶于100mL蒸餾水中，使其過飽和，盛入100mL點滴瓶中，使用前搖勻。

(3)0.01mol/LNa2S2O3溶液。（4）0.0100mol/LKIO3標準溶液。13謝謝觀賞2019-8-292、試劑13謝謝觀賞2019-8-29（5）MnCl2溶液：210gMnCl2·4H2O溶于水并稀釋至500mL。（6）堿性KI溶液：250gNaOH在攪拌下溶于250mL水中，冷卻后加75gKI稀釋至500mL盛于具橡皮塞的棕色試劑瓶中。（7）1+1H2SO4

（8）1＋3H2SO4

（9）0.5％淀粉指示劑（10）固體KI14謝謝觀賞2019-8-29（5）MnCl2溶液：210gMnCl2·4H2O溶于水并四、實驗內容

1、換算因子Fd的確定

用量筒平行移取二份某海區(qū)水樣（記為A樣）約100－500mL（視浮游植物含量而定，移取水樣前應將水樣混勻），加入1mL1%MgCO3溶液混勻后，用微孔濾膜（=45mm，0.45M）真空抽濾（真空度小于0.5atm）。將濾膜轉移至10mL具塞的試管中，加入10mL90%的丙酮溶液，混勻，置冰箱冷凍16-24小時（本實驗由于時間關系，應置冰箱一周）后取出，用玻棒攪勻，待溫度達室溫時離心10min（離心速度=3000－4000r/min），取上清液于1cm比色皿中。15謝謝觀賞2019-8-29四、實驗內容1、換算因子Fd的確定15謝謝觀賞2019-

先用752紫外可見光光度計于750，664，647，630nm波長測其消光值，按（1）和（4）式計算Cchl-a和Chl-a濃度。測定時用90％的丙酮溶液調零。接著將此提取液用熒光計測其熒光值（Rb），按（7）式計算Fd。測定時熒光計若用GFY-160，則激發(fā)波長為360nm、發(fā)射波長670nm、負高壓500mV、狹縫0.1、靈敏度檔×3。若用960MC，則參考本實驗附錄（四）。16謝謝觀賞2019-8-29先用752紫外可見光光度計于750，6642、同化指數的測定取二只250mLBOD瓶，其中一只用黑布包裹使之不透光，記作“黑”瓶，另一只則為“白”瓶。取水樣A，在現場注滿上述二瓶，分別置于與取水樣相同的水深位置，使陽光能充分照射（本實驗由于條件所限，置于LRH-250-G型生化培養(yǎng)箱，溫度30℃，４×30Ｗ熒光燈對稱照明，其使用方法詳見本實驗附錄五），光照2～3小時后，取出瓶子，逐一測量溶解氧含量，分別將“白”和“黑”瓶的數值記為Ol和Od，將結果記錄于表2。按（8）式計算同化系數Q，式中的Chl-a即為表1中的Chl-a數值。17謝謝觀賞2019-8-292、同化指數的測定17謝謝觀賞2019-8-293、水樣葉綠素a熒光法的測定

取上述實驗不同站位的水樣（記為水樣B）100~500mL（視浮游植物含量而定），過濾，按實驗步驟1提取后，分別用GFY－160和960MC熒光分光光度計測定提取液的熒光值Rb，數據記錄于表3，按(6)式計算水樣熒光法測定的葉綠素a濃度。18謝謝觀賞2019-8-293、水樣葉綠素a熒光法的測定18謝謝觀賞2019-8-294、初級生產力的估算

根據表2的數據和實驗步驟3的結果，按（9）式計算該樣水域的初級生產力水平PP。水樣AOl(mg/L)Od(mg/L)Ol－Od(mg/L)

光照時間(h)Chl-a(mg/m3)

Q(mgC/mgChl-ah)

19謝謝觀賞2019-8-294、初級生產力的估算水樣AOlOdOl－Od光照時間Chl-

表1Fd值測定數據記錄表

項目樣號E750

E664

E647E630

Ｖ(L)CChl-a

Chl-a(mg/m3)

GY-160Rb1Fd1960MCRb2Fd2水樣A12平均20謝謝觀賞2019-8-29項目樣號E750E664E647E630Ｖ(L)

表3調查水域葉綠素ａ含量和初級生產力項目樣號水樣體積(L)

GFY-160測定的Rb1Chl-a(mg/m3)

PP(mgC/m3d)960MC測定的Rb2

Chl-a(mg/m3)

PP(mgC/m3d)水樣B12平均21謝謝觀賞2019-8-29項目樣號水樣體積(L)GFY-160Chl-aPP96五、討論1、測溶解氧時要注意哪些事項？2、本實驗有哪些主要誤差來源？3、試分別計算水樣A、水樣Ｂ兩平行樣葉綠素ａ含量的相對偏差和水樣Ｂ分別用兩種熒光計測定計算的葉綠素ａ含量的相對偏差，并分析引起誤差的可能的主要原因。22謝謝觀賞2019-8-29五、討論1、測溶解氧時要注意哪些事項？22謝謝觀賞2019-六、注意事項１、水樣采樣：地點在芙蓉湖，A樣和Ｂ樣在芙蓉湖內不同站位２、水樣A和B均應作平行樣。23謝謝觀賞2019-8-29六、注意事項１、水樣采樣：地點在芙蓉湖，A樣和Ｂ樣在芙蓉湖24謝謝觀賞2019-8-2924謝謝觀賞2019-8-29實驗二、葉綠素a和同化系數Q的測定25謝謝觀賞2019-8-29實驗二、葉綠素a和同化系數Q的測定1謝謝觀賞2019-8-2一、目的要求1、測定水體中的葉綠素a含量和同化系數；2、掌握初級生產力的測定和計算方法。26謝謝觀賞2019-8-29一、目的要求1、測定水體中的葉綠素a含量和同化系數；2謝謝觀二、方法概述1、分光光度法測葉綠素

浮游植物是海洋最主要的初級生產者，它們所生產的有機物和貯存的能量是海洋食物鏈的基礎。因而海洋初級生產力的測定對海洋有機生產能力以及漁業(yè)資源開發(fā)利用潛力的估算有著十分重要的意義。海洋初級生產力的測定有C14示蹤法和葉綠素法。本實驗主要介紹葉綠素法，該方法是根據一定條件下，植物細胞內葉綠素含量和光合作用產量之間存在一定的相關性，從而根據葉綠素含量和同化系數（coefficientofassimilation）或稱同化指數（assimilationindex）來計算初級生產力。27謝謝觀賞2019-8-29二、方法概述1、分光光度法測葉綠素3謝謝觀賞2019-8-

葉綠素的測定最常應用的方法是用分光光度計測定葉綠素在丙酮溶液中的光密度，其計算公式如下：

chl-a=11.85E664－1.54E647－0.08E630＝Cchl-a(1)chl-b=21.03E647－5.43E664－2.66E630＝Cchl-b(2)chl-c=24.52E630－1.67E664－7.60E647

＝Cchl-c(3)

式中，各波長的E值為用1cm光程比色皿、經750nm波長校正后的吸光值，即上述E值應扣除E750的數值。28謝謝觀賞2019-8-29葉綠素的測定最常應用的方法是用分光光度計測定葉

由于葉綠素a是浮游植物任一種群都具有的特征，而葉綠素b或c不是任一種群都有，因此，通常用葉綠素a（Chl-a）表示初級生產力水平。故

Chl-a（mg/m3）=（4）式中，Cchl-a

為（1）式的計算結果，V丙酮為丙酮的體積（mL），V水樣為過濾水樣體積（L）。29謝謝觀賞2019-8-29由于葉綠素a是浮游植物任一種群都具有的特征，2、熒光光度法測葉綠素近年來，海水葉綠素a含量測定的分光光度法已逐漸被較簡便且靈敏度高的萃取熒光法代替。其原理是葉綠素a的丙酮萃取液受藍光激發(fā)后產生紅色熒光，用熒光計在波長670nm測定提取液酸化前后的熒光值，按下式計算海水葉綠素a的含量：

(5)

式中，Rb—酸化前熒光值；

Ra—酸化后熒光值；

R—純葉綠素a的酸化因子(隨儀器而異）。30謝謝觀賞2019-8-292、熒光光度法測葉綠素6謝謝觀賞2019-8-29

因，故（5）式成為：（6）式中，Fd—測定時熒光計所用量程的換算因子(mg/m3)，其值的確定有幾種方法，具體為：

31謝謝觀賞2019-8-29因，故（5）式成為：7謝謝觀賞2⑴標準葉綠素a校正法：用純葉綠素a配成母液，把母液稀釋成一系列不同濃度的溶液并分別測定熒光讀數，最后用直線回歸法算出標定線的斜率，即Fd。⑵分光光度計校正法：取一定體積處于指數生長期的單細胞藻類，按分光光度法測定葉綠素a的方法，測其吸光值E，按（1）式計算該提取液的Cchl-a。然后將它在熒光計上測定熒光值Rb，按（7）式求得Fd。本實驗采用分光光度計校正法。

(7)32謝謝觀賞2019-8-29⑴標準葉綠素a校正法：用純葉綠素a配成母液，把母液稀釋成一系3、同化系數的測定

把葉綠素a含量換算成調查海區(qū)的初級生產力，必須乘以一個比例系數，稱為同化系數，用Q表示。一般在光飽和條件下，同化系數的值最大。但應當指出，不同類型的藻類種群或同一種群在不同的環(huán)境中，同化系數是不一樣的。因此，最好先用C14示蹤法現場測定同化系數。在無C14示蹤法測定Ｑ的條件下可根據浮游植物光合過程中釋放出氧的量換算成有機碳的固定量，以此固定值除以葉綠素a和培養(yǎng)時間即為同化系數Q。33謝謝觀賞2019-8-293、同化系數的測定9謝謝觀賞2019-8-29

若假設符合光合作用的理想方程為CO2＋H2O

→CH2O＋O2，將所產生的氧的單位轉換成固定碳的單位，則有：（8）式中Q—同化系數，單位為mgC(mgChl-a)-1h-1；h—光照時間（h）；

Chl-a—光照水樣的葉綠素a含量（mg/m3）；

Ol、Od—分別為“白”瓶和“黑”瓶中的溶解氧含量（mgO2/L）。34謝謝觀賞2019-8-29若假設符合光合作用的理想方程為10謝謝觀賞2014、初級生產力的估算

PP=Chl-a×Q×(9)

式中，PP—每日生產力（mgC/m3d）；

Chl-a－海洋水樣的葉綠素a值（用熒光法測定的數值，單位mg/m3）；

D—每日的光照時間，冬天取12h，夏天取13h。35謝謝觀賞2019-8-294、初級生產力的估算11謝謝觀賞2019-8-29三、儀器與試劑1、儀器和玻璃器皿

752紫外光柵分光光度計1臺GFY－160熒光光度計1臺LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱960MR熒光光度計1臺離心機1臺過濾器1個醫(yī)用真空吸引器一臺0.45μm微孔醋酸纖維濾膜若干張250mLBOD瓶2個（黑白各1個）黑布若干塊碘量瓶2個具塞刻度試管4支100mL量筒1個水樣桶2個堿式滴定管1根10mL移液管1支2mL移液管3支1mL移液管1支10mL移液管1支36謝謝觀賞2019-8-29三、儀器與試劑1、儀器和玻璃器皿12謝謝觀賞2019-8-2、試劑

（1）90%丙酮：100mL蒸餾水加上900mL丙酮貯于棕色瓶中。（2）1%MgCO3：取1gMgCO3溶于100mL蒸餾水中，使其過飽和，盛入100mL點滴瓶中，使用前搖勻。

(3)0.01mol/LNa2S2O3溶液。（4）0.0100mol/LKIO3標準溶液。37謝謝觀賞2019-8-292、試劑13謝謝觀賞2019-8-29（5）MnCl2溶液：210gMnCl2·4H2O溶于水并稀釋至500mL。（6）堿性KI溶液：250gNaOH在攪拌下溶于250mL水中，冷卻后加75gKI稀釋至500mL盛于具橡皮塞的棕色試劑瓶中。（7）1+1H2SO4

（8）1＋3H2SO4

（9）0.5％淀粉指示劑（10）固體KI38謝謝觀賞2019-8-29（5）MnCl2溶液：210gMnCl2·4H2O溶于水并四、實驗內容

1、換算因子Fd的確定

用量筒平行移取二份某海區(qū)水樣（記為A樣）約100－500mL（視浮游植物含量而定，移取水樣前應將水樣混勻），加入1mL1%MgCO3溶液混勻后，用微孔濾膜（=45mm，0.45M）真空抽濾（真空度小于0.5atm）。將濾膜轉移至10mL具塞的試管中，加入10mL90%的丙酮溶液，混勻，置冰箱冷凍16-24小時（本實驗由于時間關系，應置冰箱一周）后取出，用玻棒攪勻，待溫度達室溫時離心10min（離心速度=3000－4000r/min），取上清液于1cm比色皿中。39謝謝觀賞2019-8-29四、實驗內容1、換算因子Fd的確定15謝謝觀賞2019-

先用752紫外可見光光度計于750，664，647，630nm波長測其消光值，按（1）和（4）式計算Cchl-a和Chl-a濃度。測定時用90％的丙酮溶液調零。接著將此提取液用熒光計測其熒光值（Rb），按（7）式計算Fd。測定時熒光計若用GFY-160，則激發(fā)波長為360nm、發(fā)射波長670nm、負高壓500mV、狹縫0.1、靈敏度檔×3。若用960MC，則參考本實驗附錄（四）。40謝謝觀賞2019-8-29先用752紫外可見光光度計于750，6642、同化指數的測定取二只250mLBOD瓶，其中一只用黑布包裹使之不透光，記作“黑”瓶，另一只則為“白”瓶。取水樣A，在現場注滿上述二瓶，分別置于與取水樣相同的水深位置，使陽光能充分照射（本實驗由于條件所限，置于LRH-250-G型生化培養(yǎng)箱，溫度30℃，４×30Ｗ熒光燈對稱照明，其使用方法詳見本實驗附錄五），光照2～3小時后，取出瓶子，逐一測量溶解氧含量，分別將“白”和“黑”瓶的數值記為Ol和Od，將結果記錄于表2。按（8）式計算同化系數Q，式中的