微生物基因工程培訓(xùn)講義整理課件

微生物基因工程李剛副教授微生物基因工程1教學內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；

二、基因組文庫的建立與篩選；

三、定向進化技術(shù)在微生物酶制劑研究中的應(yīng)用；

四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略；五、真核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略。教學內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；

二、基因組文庫2四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略

原核生物表達系統(tǒng)主要包括：

大腸桿菌表達系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)、鏈霉菌表達系統(tǒng)等,其中應(yīng)用最廣泛的是大腸桿菌表達系統(tǒng)。四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略原核生物表達系統(tǒng)3原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點1、細菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格低廉；2、外源基因表達產(chǎn)物的水平高(如大腸桿菌中目的蛋白的表達量可超過細菌總蛋白量的80%)；3、基因背景和表達特性清楚。原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點1、細菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格4大腸桿菌表達系統(tǒng)自20世紀70年代以來,大腸桿菌一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達系統(tǒng)。尤其是進入后基因組時代以來,有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及功能研究的開展,對基因表達的要求更高,這時大腸桿菌往往是表達的第一選擇。大腸桿菌表達系統(tǒng)自20世紀70年代以來,大腸桿菌一直是5大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡單、生長繁殖快、安全性好、可以高效表達不同外源基因產(chǎn)物等特點,是許多外源基因表達系統(tǒng)中最好的一種,是目前研究最深入、發(fā)展也最完善的表達系統(tǒng),大量的有價值的多肽和蛋白質(zhì)已在大腸桿菌中獲得了超量表達。缺點：大腸桿菌表達體系與其他表達體系相比,也具有一些缺點:①高效表達易形成包涵體。②不能進行翻譯后的加工修飾,如糖基化、磷酸化及酰基化等。大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：6大腸桿菌表達系統(tǒng)的操作流程

大腸桿菌表達系統(tǒng)操作的一般程序如下：

獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉(zhuǎn)化表達宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測。大腸桿菌表達系統(tǒng)的操作流程

大腸桿菌表達系統(tǒng)操作的一般程序7大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念首先講述一些大腸桿菌表達的基本概念：一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株，如果是特殊的誘導(dǎo)表達還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達載體的選擇上。表達載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動子，多克隆位點，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復(fù)制子，篩選標記/報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實驗室之間交換得到免費的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個MCS？是我們要特別注意的。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念首先講述一些大腸桿菌表達的基本概念8大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念復(fù)制子：通常表達載體都會選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴謹方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達量是非線性的正相關(guān)，當然也不是越多越好，超過細胞的承受范圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。

篩選標記和報告基因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標記，卡那霉素或者是新霉素次之，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微?？剐曰虻倪x擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達篩選中要注意的問題應(yīng)該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。今天耐青霉素的超級細菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在100多萬個單位，青霉素劑量似乎越來越大了。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念復(fù)制子：通常表達載體都會選用高拷貝9大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念對于做表達來說，如果不是要研究啟動子的強弱，通常比較少關(guān)心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了（注意選擇適用原核表達版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶，熒光素酶等等。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。

啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點：

啟動子：啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達和誘導(dǎo)調(diào)控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子。

轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用——控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，分別是Rho因子作用下使mRNA轉(zhuǎn)錄終止的終止子和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA轉(zhuǎn)錄的終止子。常見的是rrnB

、rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念對于做表達來說，如果不是要研究啟動10大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念

核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3'端互補的SD序列對形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達，要留意。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念

核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄11大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。

誘導(dǎo)調(diào)控型表達：表達載體采用誘導(dǎo)型啟動子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達的，也屬于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式組成型表達：表達載體的啟動子為12大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（Tag），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。

分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包涵體，而且表達產(chǎn)物通常是可溶的活性狀態(tài)，不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間。

可溶性表達：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包涵體顆粒，包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式融合表達：表達載體的多克隆位點13提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：（1）在細胞中表達分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合（例如Takara的ChaperoneplasmidSet）；（2）共表達折疊酶，催化共價鍵形成；（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚合傾向的中間體的濃度；（4）選擇中等強度或低強度的啟動子代替強啟動子，降低重組蛋白的合成速度；（5）選擇適合的宿主菌株；（6）表達含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性；（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）誘導(dǎo)過程中加入化學物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：14大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子最早應(yīng)用于大腸桿菌表達系統(tǒng)的是Lac乳糖操縱子，由啟動子Plac、操縱基因lacO和結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負調(diào)控。lacUV5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO

上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子最早應(yīng)用于大腸桿菌表達系統(tǒng)15大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子tac啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動子是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強啟動子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達量不高，僅能滿足細胞自身的lac操縱子，無法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達，為了讓表達系統(tǒng)嚴謹調(diào)控產(chǎn)物表達，能過量表達lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為Lac/Tac/trc表達系統(tǒng)的表達菌株。大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子tac啟動子是trp啟動子16大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq基因，以表達更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴謹?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開啟轉(zhuǎn)錄。熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。

大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子現(xiàn)在的Lac/Tac/tr17大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子以λ噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個強啟動子受控于λ噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，PL、PR

表達載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴謹調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的PL表達系統(tǒng)，就是將受trp啟動子嚴謹調(diào)控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導(dǎo)抑制trp啟動子，抑制cI基因的表達，從而解除強大的PL啟動子的抑制。

大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子以λ噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動子P18大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子T7啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流，這個功能強大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設(shè)計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強大的T7啟動子完全專一受控于T7

RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍——當二者同時存在時，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7表達系統(tǒng)，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導(dǎo)表達后僅幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。由于大腸桿菌本身不含T7

RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA

聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式——非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對宿主細胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導(dǎo)條件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。

大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子T7啟動子是當今大腸桿菌表19常用的幾種大腸桿菌表達系統(tǒng)1、GE（原安瑪西亞）-pGEX系列，特點：使用該系列載體可以很方便進行下一步重組蛋白的純化。

常用的幾種大腸桿菌表達系統(tǒng)1、GE（原安瑪西亞）-pGEX系20GE（原安瑪西亞）-pGEX系列GE（原安瑪西亞）-pGEX系列21Invitrogen-Champion?pETExpressionSystem等四個系列比起其它公司的原核表達系列來說Invitrogen有個非常突出的地方就是它的重組克隆技術(shù)。像之前Novagen大部分載體都是用傳統(tǒng)的酶切、鏈接方式做重組質(zhì)粒，但是Invitrogen的表達系統(tǒng)大量運用了它的TOPO技術(shù)和Gateway技術(shù)。Invitrogen公司總共有四個原核表達系統(tǒng)它們分別是：Champion?pETExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystem、pLSystem和T7-basedSystems。這四個系列的載體可謂把原核表達的發(fā)展史中出現(xiàn)過的幾種啟動子都囊括進去了，包括T7、pL、pBAD和trc啟動子，同時幾種經(jīng)典的調(diào)控方式也都出現(xiàn)了，包括有乳糖操縱子、色氨酸操縱子和阿拉伯糖操縱子。Champion?pETExpressionSystem之所以取了個冠軍系統(tǒng)的稱號是因為它結(jié)合了經(jīng)典的T7表達系統(tǒng)和Invitrogen的王牌定向TOPO技術(shù)及Gateway技術(shù)，這可謂是強強聯(lián)手。

Invitrogen-Champion?pETExpr22微生物基因工程培訓(xùn)講義整理課件23微生物基因工程培訓(xùn)講義整理課件24InvitrogenpET100/D-TOPO載體圖譜InvitrogenpET100/D-TOPO載體圖譜25Novagen公司-pET表達載體序列Novagen公司（Merck的子公司）出品了多種原核表達載體系列，其中的pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達系統(tǒng)，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達了各種各樣的異源蛋白。pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進行表達的載體。Novagen公司-pET表達載體序列Novagen公司（M26Novagen公司的pET表達載體系列pETVectorswithuniquefeaturesinclude:pET-31b(+)forhighyieldbioproductionofpeptidesandsmallproteinspET-32a-cforproductionofsoluble,activetargetproteinsinE.coli

pET-33bforproductionoftargetproteinssuitableforsite-specific32P-labelingpET-39band40busingDsbtagsforexportandperiplasmicfoldingoftargetproteinspET-41a-cand42a-cwithpopularGSTfusiontagsforenhancedproductionandsolubilitypET-43.1a-cdesignedforcloningandhigh-levelexpressionofpolypeptidesequencesfusedwiththe495aaNusA(Nus?Tag?)proteinpET-44a-cwithNus?Tag?sequenceplusN-andC-terminalHis?TagsequencespET-45b(+)withamino-terminalHis?Tag?sequenceandminimalextraneoussequencespET-46Ek/LICpreparedvectorforligation-independentcloning,withamino-terminalHis?Tag?sequencepET-47b(+)throughpET-50b(+)withHRV3CProteasecleavagesiteforefficientfusiontagremovalAdditionalvectorsinthistableinclude:pLacIpLysEandpLysSNovagen公司的pET表達載體系列pETVectors27Novagen公司的PET32a表達載體圖譜Novagen公司的PET32a表達載體圖譜28Novagen公司的pET表達載體選擇從開始涉及表達的時候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼子進行選擇，Novagen公司僅提供三個載體：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。根據(jù)是否要可溶性表達，選擇加有不同標記的載體。一般說來在大腸桿菌中不加標記外源蛋白都會以不溶的包涵體形式表達。為了讓外源蛋白融合表達一般說來有三個策略：1.與一個高度可溶的多肽聯(lián)合一起表達，比如：谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneStransferase,GST）、硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）和N利用底物A蛋白（NutilizationsubstanceA,NusA）。2.轉(zhuǎn)入一個酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白，DsbA，DsbC。3.插入一個定位到周質(zhì)空間的信號肽序列。以上載體都是采用抗生素抗性篩選，如果你希望用藍白斑篩選可以使用pETBlue系列載體。在重組技術(shù)上，Novagen除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式：Ligation-Independentcloning，簡稱LIC。采用LIC方法的pET載體是線性化的，在末端有12-15個突出的堿基以在退火時和目的片斷互補。在設(shè)計PCR擴增引物時加入與LIC載體互補的序列，PCR產(chǎn)物用3’→5’的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補的序列。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入LIC載體上。Novagen公司的pET表達載體選擇從開始涉及表達的時候可29Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇Novagen提供多種表達使用的菌株，為了提高表達量做出了各種改造，它們大致分為以下幾個種類：1.蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，這包括有B834,BL21,BLR,Origami?B,Rosetta?和Tuner?。因此在純化時可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。BL21(DE3)是應(yīng)用最多的表達的表達菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大腸桿菌中介導(dǎo)同源重組的重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。2.保證所有細胞以同樣量進行表達Tuner?株及它的衍生株（Origami?B和Rosetta?）是BL21菌株的lacY1缺失突變型，在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細胞中表達。Lac滲透酶的突變使進入每個細胞的IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達濃度可以隨著IPTG濃度而改變。通過對IPTG濃度的控制可以使細胞微量表達或者大量表達。一般說來，低濃度表達有利于蛋白的可溶性和活性。Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇Novagen提供多種表30Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇3.二硫鍵形成與溶解性增強二硫鍵的形成對某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也專門設(shè)計了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（gor）和/或硫氧還蛋白還原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami?。在這些菌株中表達蛋白，可以更大程度促進二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。4.稀有密碼子的補給不同物種有不同的密碼子偏愛性，如果外源蛋白中含大量大腸桿菌的稀有密碼子，特別當這些稀有密碼子呈連續(xù)分布的時候，就會造成蛋白表達量極低，或者翻譯提前終止。Rosetta?是為了表達真核蛋白而特別設(shè)計的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。Rosetta系列是來自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。5.硒蛋氨酸標記B834是來源于BL21的蛋氨酸（met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性35S-met標記和晶體成像蛋氨酸標記中非常有用。Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇3.二硫鍵形成與溶解性31原核表達需要考慮的問題在原核蛋白表達過程中，選擇構(gòu)建一個合適原核表達體系需要綜合考慮3大因素：表達載體、宿主菌株、表達誘導(dǎo)條件,以獲得最滿意的表達效果。原核表達需要考慮的問題在原核蛋白表達過程中，選擇構(gòu)建一個合適32大腸桿菌表達系統(tǒng)的高效表達策略1、采用高強度啟動子-如T7啟動子；2、將目的基因所有密碼子都換成大腸桿菌偏好的密碼子（需要重新合成基因），或采用含有大腸桿菌稀有密碼子tRNA

的Rosetta系列菌株。3、采用豐富培養(yǎng)基（如TB）代替普通的LB培養(yǎng)基；4、優(yōu)化大腸桿菌的生長條件和目的基因的誘導(dǎo)表達條件。大腸桿菌表達系統(tǒng)的高效表達策略1、采用高強度啟動子-如T7啟33使用pET表達系統(tǒng)的常見問題分析

幾個常見問題如下表：使用pET表達系統(tǒng)的常見問題分析幾個常見問題如下表：34原核表達常見的幾個問題及回答（1）1、目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)。解決辦法：采用以下八種策略提高目的蛋白的可溶性。原核表達常見的幾個問題及回答（1）1、目的蛋白總是以不可溶的35提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：（1）在細胞中表達分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合；（2）共表達折疊酶，催化共價鍵形成；（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚合傾向的中間體的濃度；（4）選擇中等強度或低強度的啟動子代替強啟動子，降低重組蛋白的合成速度；（5）選擇適合的宿主菌株；（6）表達含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性；（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）誘導(dǎo)過程中加入化學物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：36原核表達常見的幾個問題及回答（2）2、必須去除融合多肽或蛋白質(zhì)標簽才能使目的蛋白獲得活性嗎？回答：大多數(shù)情況下目的蛋白帶有His-Tag,S-Tag,11個氨基酸的T7-Tag或HSV-Tag等小肽時仍能表現(xiàn)出完全的活性。這些肽段都較為親水，理論上都不會干擾蛋白的三維結(jié)構(gòu)。我們建議首先測試蛋白活性，再看是否一定要去除前導(dǎo)序列才能適合特定的應(yīng)用要求。原核表達常見的幾個問題及回答（2）2、必須去除融合多肽或蛋白37原核表達常見的幾個問題及回答（3）3、如果目的蛋白包含信號序列，它會不會被運至細胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在？還是目的蛋白甚至可以被分泌到生長培養(yǎng)基中？回答：如果目的蛋白包含ompT或pelB這樣的前導(dǎo)序列，理論上它應(yīng)該被運至細胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在。如果在生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)目的蛋白的話，多半是因為細胞壁受到破壞，而并不代表蛋白是被分泌到培養(yǎng)基中的。除了信號肽對蛋白質(zhì)的運輸有影響，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成熟區(qū)對蛋白質(zhì)的運轉(zhuǎn)也有影響。因此在細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)及其它區(qū)域發(fā)現(xiàn)目的蛋白都很正常。某些情況下降低誘導(dǎo)時的培養(yǎng)溫度至25-30℃，可能提高蛋白運輸?shù)谋壤?。原核表達常見的幾個問題及回答（3）3、如果目的蛋白包含信號序38原核表達常見的幾個問題及回答（4）4、IPTG誘導(dǎo)后細胞停止了生長，是不是表示細胞死了？回答：T7RNA聚合酶非?；钴S，T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號極強，因此，一旦誘導(dǎo)，細胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達的方面轉(zhuǎn)化。在通常情況下，細胞將停止生長，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成試驗可以用來檢測表達系統(tǒng)的性能。但也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴緊的載體/宿主菌組合(比如含有plysE的宿主菌)等，這時在誘導(dǎo)后菌落還是會繼續(xù)生長。原核表達常見的幾個問題及回答（4）4、IPTG誘導(dǎo)后細胞停止39原核表達常見的幾個問題及回答（5）5、除了毒性和降解，還有些什么因素會影響目的蛋白的表達水平？回答：（1）mRNA轉(zhuǎn)錄子中的二級結(jié)構(gòu)會干擾AUG翻譯起始密碼子和/或核糖體結(jié)合位點。所有pET載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是下列兩種之一：RbsNdeI/NcoI5’…AAGAAGGAGAUAUACAUAUG…3’5’…AAGAAGGAGAUAUACCAUGG…3’如果發(fā)現(xiàn)表達很差，你可以通過檢查編碼插入序列的鏈上的與上述序列互補的序列：5‘-CATATGTATATCTCCTTCTT-3’或5’-CCATGGTATATCTCCTTCTT-3‘以確定是否因為存在潛在的二級結(jié)構(gòu)造成麻煩。原核表達常見的幾個問題及回答（5）5、除了毒性和降解，還有些40原核表達常見的幾個問題及回答（5）（2）目的基因中稀有密碼子比較多也是常見的表達水平低的原因。如果稀有密碼子集中出現(xiàn)在氨基端情況更為嚴重。應(yīng)該注意，根據(jù)現(xiàn)有對大腸桿菌高表達的基因研究發(fā)現(xiàn)的有限的稀有密碼子，已經(jīng)觀察到由于其對應(yīng)的tRNAs水平很低，直接導(dǎo)致了翻譯延伸的困難。（3）序列中的意外的終止密碼子可能造成突變，這在PCR克隆產(chǎn)物的情況下較為突出。可以通過測序發(fā)現(xiàn)此類問題，也可以用體外翻譯的方法確認重組子的表達能力。原核表達常見的幾個問題及回答（5）（2）目的基因中稀有密碼子41原核表達常見的幾個問題及回答（6）有時除了全長的目的蛋白以外，還能看到截短的產(chǎn)物，這時怎么回事？回答：一個最直接原因就是蛋白水解了。然而第二點翻譯起始也非常有可能。起始密碼子AUG（Met）的上游在RNA編碼區(qū)有類似于核糖體結(jié)合位點序列（AAGGAGG）的間隔序列（通常是5-13個核苷酸）時，容易出現(xiàn)這種問題。截短蛋白在純化全長蛋白的操作時往往造成麻煩。解決途徑之一即是選用兩端都帶有融合標簽的pET載體，例如pET28和pET30序列載體。這樣，全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度，在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區(qū)分開。另外pET29和pET30系列載體在N端融合有S-Tag，而C端有His-Tag，因此可以先后用固定化S-蛋白和HisBinding樹脂親和純化以獲取全長蛋白。原核表達常見的幾個問題及回答（6）有時除了全長的目的蛋白以外42重組質(zhì)粒和菌株的保存建議

在實驗室里保存重組菌株的時候，為了挑菌和傳代方便，我們常用LB平板保存在4℃冰箱中，需要提質(zhì)粒和表達接種的時候，就直接從平板上挑菌，但是這種方法對于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、表達水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。我們建議：

1、長期存放菌株和pET重組子應(yīng)該在菌液中加入甘油并放置于－70℃保種。但是要注意高濃度甘油(>10%)會導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。請盡量保持甘油濃度為8％左右。（15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液1:1就行）

2、重組質(zhì)粒不宜長期保存于表達菌株（帶DE3的大腸桿菌）中，請盡量使用帶有recAendA突變的克隆菌株（比如C600，DH5a）進行質(zhì)粒抽提和保存質(zhì)粒。表達型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會有質(zhì)量不高或者背景的問題。特別是在大量抽提過程中。重組質(zhì)粒和菌株的保存建議

在實驗室里保存重組43thankyou!!!thankyou!!!44

1、想要體面生活，又覺得打拼辛苦；想要健康身體，又無法堅持運動。人最失敗的，莫過于對自己不負責任，連答應(yīng)自己的事都辦不到，又何必抱怨這個世界都和你作對？人生的道理很簡單，你想要什么，就去付出足夠的努力。

2、時間是最公平的，活一天就擁有24小時，差別只是珍惜。你若不相信努力和時光，時光一定第一個辜負你。有夢想就立刻行動，因為現(xiàn)在過的每一天，都是余生中最年輕的一天。

3、無論正在經(jīng)歷什么，都請不要輕言放棄，因為從來沒有一種堅持會被辜負。誰的人生不是荊棘前行，生活從來不會一蹴而就，也不會永遠安穩(wěn)，只要努力，就能做獨一無二平凡可貴的自己。

4、努力本就是年輕人應(yīng)有的狀態(tài)，是件充實且美好的事，可一旦有了表演的成分，就會顯得廉價，努力，不該是為了朋友圈多獲得幾個贊，不該是每次長篇贅述后的自我感動，它是一件平凡而自然而然的事，最佳的努力不過是：但行好事，莫問前程。愿努力，成就更好的你！

5、付出努力卻沒能實現(xiàn)的夢想，愛了很久卻沒能在一起的人，活得用力卻平淡寂寞的青春，遺憾是每一次小的挫折，它磨去最初柔軟的心智、讓我們懂得累積時間的力量；那些孤獨沉寂的時光，讓我們學會守候內(nèi)心的平和與堅定。那些脆弱的不完美，都會在努力和堅持下，改變模樣。

6、人生中總會有一段艱難的路，需要自己獨自走完，沒人幫助，沒人陪伴，不必畏懼，昂頭走過去就是了，經(jīng)歷所有的挫折與磨難，你會發(fā)現(xiàn)，自己遠比想象中要強大得多。多走彎路，才會找到捷徑，經(jīng)歷也是人生，修煉一顆強大的內(nèi)心，做更好的自己！

7、“一定要成功”這種內(nèi)在的推動力是我們生命中最神奇最有趣的東西。一個人要做成大事，絕不能缺少這種力量，因為這種力量能夠驅(qū)動人不停地提高自己的能力。一個人只有先在心里肯定自己，相信自己，才能成就自己！

8、人生的旅途中，最清晰的腳印，往往印在最泥濘的路上，所以，別畏懼暫時的困頓，即使無人鼓掌，也要全情投入，優(yōu)雅堅持。真正改變命運的，并不是等來的機遇，而是我們的態(tài)度。

9、這世上沒有所謂的天才，也沒有不勞而獲的回報，你所看到的每個光鮮人物，其背后都付出了令人震驚的努力。請相信，你的潛力還遠遠沒有爆發(fā)出來，不要給自己的人生設(shè)限，你自以為的極限，只是別人的起點。寫給渴望突破瓶頸、實現(xiàn)快速跨越的你。

10、生活中，有人給予幫助，那是幸運，沒人給予幫助，那是命運。我們要學會在幸運青睞自己的時候?qū)W會感恩，在命運磨練自己的時候?qū)W會堅韌。這既是對自己的尊重，也是對自己的負責。

11、失敗不可怕，可怕的是從來沒有努力過，還怡然自得地安慰自己，連一點點的懊悔都被麻木所掩蓋下去。不能怕，沒什么比自己背叛自己更可怕。

12、跌倒了，一定要爬起來。不爬起來，別人會看不起你，你自己也會失去機會。在人前微笑，在人后落淚，可這是每個人都要學會的成長。

13、要相信，這個世界上永遠能夠依靠的只有你自己。所以，管別人怎么看，堅持自己的堅持，直到堅持不下去為止。

14、也許你想要的未來在別人眼里不值一提，也許你已經(jīng)很努力了可還是有人不滿意，也許你的理想離你的距離從來沒有拉近過......但請你繼續(xù)向前走，因為別人看不到你的努力，你卻始終看得見自己。

15、所有的輝煌和偉大，一定伴隨著挫折和跌倒；所有的風光背后，一定都是一串串揉和著淚水和汗水的腳印。

16、成功的反義詞不是失敗，而是從未行動。有一天你總會明白，遺憾比失敗更讓你難以面對。

17、沒有一件事情可以一下子把你打垮，也不會有一件事情可以讓你一步登天，慢慢走，慢慢看，生命是一個慢慢累積的過程。

18、努力也許不等于成功，可是那段追逐夢想的努力，會讓你找到一個更好的自己，一個沉默努力充實安靜的自己。

19、你相信夢想，夢想才會相信你。有一種落差是，你配不上自己的野心，也辜負了所受的苦難。

20、生活不會按你想要的方式進行，它會給你一段時間，讓你孤獨、迷茫又沉默憂郁。但如果靠這段時間跟自己獨處，多看一本書，去做可以做的事，放下過去的人，等你度過低潮，那些獨處的時光必定能照亮你的路，也是這些不堪陪你成熟。所以，現(xiàn)在沒那么糟，看似生活對你的虧欠，其實都是祝愿。1、想要體面生活，又覺得打拼辛苦；想要健康身體，又無法堅45微生物基因工程培訓(xùn)講義整理課件46微生物基因工程李剛副教授微生物基因工程47教學內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；

二、基因組文庫的建立與篩選；

三、定向進化技術(shù)在微生物酶制劑研究中的應(yīng)用；

四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略；五、真核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略。教學內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；

二、基因組文庫48四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略

原核生物表達系統(tǒng)主要包括：

大腸桿菌表達系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)、鏈霉菌表達系統(tǒng)等,其中應(yīng)用最廣泛的是大腸桿菌表達系統(tǒng)。四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略原核生物表達系統(tǒng)49原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點1、細菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格低廉；2、外源基因表達產(chǎn)物的水平高(如大腸桿菌中目的蛋白的表達量可超過細菌總蛋白量的80%)；3、基因背景和表達特性清楚。原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點1、細菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格50大腸桿菌表達系統(tǒng)自20世紀70年代以來,大腸桿菌一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達系統(tǒng)。尤其是進入后基因組時代以來,有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及功能研究的開展,對基因表達的要求更高,這時大腸桿菌往往是表達的第一選擇。大腸桿菌表達系統(tǒng)自20世紀70年代以來,大腸桿菌一直是51大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡單、生長繁殖快、安全性好、可以高效表達不同外源基因產(chǎn)物等特點,是許多外源基因表達系統(tǒng)中最好的一種,是目前研究最深入、發(fā)展也最完善的表達系統(tǒng),大量的有價值的多肽和蛋白質(zhì)已在大腸桿菌中獲得了超量表達。缺點：大腸桿菌表達體系與其他表達體系相比,也具有一些缺點:①高效表達易形成包涵體。②不能進行翻譯后的加工修飾,如糖基化、磷酸化及?；取４竽c桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：52大腸桿菌表達系統(tǒng)的操作流程

大腸桿菌表達系統(tǒng)操作的一般程序如下：

獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉(zhuǎn)化表達宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測。大腸桿菌表達系統(tǒng)的操作流程

大腸桿菌表達系統(tǒng)操作的一般程序53大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念首先講述一些大腸桿菌表達的基本概念：一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株，如果是特殊的誘導(dǎo)表達還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達載體的選擇上。表達載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動子，多克隆位點，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復(fù)制子，篩選標記/報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實驗室之間交換得到免費的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個MCS？是我們要特別注意的。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念首先講述一些大腸桿菌表達的基本概念54大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念復(fù)制子：通常表達載體都會選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴謹方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質(zhì)粒拷貝數(shù)和表達量是非線性的正相關(guān)，當然也不是越多越好，超過細胞的承受范圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。

篩選標記和報告基因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標記，卡那霉素或者是新霉素次之，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微?？剐曰虻倪x擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達篩選中要注意的問題應(yīng)該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。今天耐青霉素的超級細菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在100多萬個單位，青霉素劑量似乎越來越大了。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念復(fù)制子：通常表達載體都會選用高拷貝55大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念對于做表達來說，如果不是要研究啟動子的強弱，通常比較少關(guān)心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了（注意選擇適用原核表達版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶，熒光素酶等等。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。

啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點：

啟動子：啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達和誘導(dǎo)調(diào)控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子。

轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用——控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，分別是Rho因子作用下使mRNA轉(zhuǎn)錄終止的終止子和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA轉(zhuǎn)錄的終止子。常見的是rrnB

、rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念對于做表達來說，如果不是要研究啟動56大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念

核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3'端互補的SD序列對形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達，要留意。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念

核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄57大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。

誘導(dǎo)調(diào)控型表達：表達載體采用誘導(dǎo)型啟動子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達的，也屬于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。

大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式組成型表達：表達載體的啟動子為58大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（Tag），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。

分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包涵體，而且表達產(chǎn)物通常是可溶的活性狀態(tài)，不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間。

可溶性表達：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包涵體顆粒，包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式融合表達：表達載體的多克隆位點59提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：（1）在細胞中表達分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合（例如Takara的ChaperoneplasmidSet）；（2）共表達折疊酶，催化共價鍵形成；（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚合傾向的中間體的濃度；（4）選擇中等強度或低強度的啟動子代替強啟動子，降低重組蛋白的合成速度；（5）選擇適合的宿主菌株；（6）表達含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性；（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）誘導(dǎo)過程中加入化學物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：60大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子最早應(yīng)用于大腸桿菌表達系統(tǒng)的是Lac乳糖操縱子，由啟動子Plac、操縱基因lacO和結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負調(diào)控。lacUV5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO

上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子最早應(yīng)用于大腸桿菌表達系統(tǒng)61大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子tac啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動子是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強啟動子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達量不高，僅能滿足細胞自身的lac操縱子，無法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達，為了讓表達系統(tǒng)嚴謹調(diào)控產(chǎn)物表達，能過量表達lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為Lac/Tac/trc表達系統(tǒng)的表達菌株。大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子tac啟動子是trp啟動子62大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq基因，以表達更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴謹?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開啟轉(zhuǎn)錄。熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。

大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子現(xiàn)在的Lac/Tac/tr63大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子以λ噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個強啟動子受控于λ噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，PL、PR

表達載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴謹調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的PL表達系統(tǒng)，就是將受trp啟動子嚴謹調(diào)控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導(dǎo)抑制trp啟動子，抑制cI基因的表達，從而解除強大的PL啟動子的抑制。

大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子以λ噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動子P64大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子T7啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流，這個功能強大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設(shè)計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強大的T7啟動子完全專一受控于T7

RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍——當二者同時存在時，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7表達系統(tǒng)，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導(dǎo)表達后僅幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。由于大腸桿菌本身不含T7

RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA

聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式——非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對宿主細胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導(dǎo)條件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。

大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子T7啟動子是當今大腸桿菌表65常用的幾種大腸桿菌表達系統(tǒng)1、GE（原安瑪西亞）-pGEX系列，特點：使用該系列載體可以很方便進行下一步重組蛋白的純化。

常用的幾種大腸桿菌表達系統(tǒng)1、GE（原安瑪西亞）-pGEX系66GE（原安瑪西亞）-pGEX系列GE（原安瑪西亞）-pGEX系列67Invitrogen-Champion?pETExpressionSystem等四個系列比起其它公司的原核表達系列來說Invitrogen有個非常突出的地方就是它的重組克隆技術(shù)。像之前Novagen大部分載體都是用傳統(tǒng)的酶切、鏈接方式做重組質(zhì)粒，但是Invitrogen的表達系統(tǒng)大量運用了它的TOPO技術(shù)和Gateway技術(shù)。Invitrogen公司總共有四個原核表達系統(tǒng)它們分別是：Champion?pETExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystem、pLSystem和T7-basedSystems。這四個系列的載體可謂把原核表達的發(fā)展史中出現(xiàn)過的幾種啟動子都囊括進去了，包括T7、pL、pBAD和trc啟動子，同時幾種經(jīng)典的調(diào)控方式也都出現(xiàn)了，包括有乳糖操縱子、色氨酸操縱子和阿拉伯糖操縱子。Champion?pETExpressionSystem之所以取了個冠軍系統(tǒng)的稱號是因為它結(jié)合了經(jīng)典的T7表達系統(tǒng)和Invitrogen的王牌定向TOPO技術(shù)及Gateway技術(shù)，這可謂是強強聯(lián)手。

Invitrogen-Champion?pETExpr68微生物基因工程培訓(xùn)講義整理課件69微生物基因工程培訓(xùn)講義整理課件70InvitrogenpET100/D-TOPO載體圖譜InvitrogenpET100/D-TOPO載體圖譜71Novagen公司-pET表達載體序列Novagen公司（Merck的子公司）出品了多種原核表達載體系列，其中的pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達系統(tǒng)，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達了各種各樣的異源蛋白。pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進行表達的載體。Novagen公司-pET表達載體序列Novagen公司（M72Novagen公司的pET表達載體系列pETVectorswithuniquefeaturesinclude:pET-31b(+)forhighyieldbioproductionofpeptidesandsmallproteinspET-32a-cforproductionofsoluble,activetargetproteinsinE.coli

pET-33bforproductionoftargetproteinssuitableforsite-specific32P-labelingpET-39band40busingDsbtagsforexportandperiplasmicfoldingoftargetproteinspET-41a-cand42a-cwithpopularGSTfusiontagsforenhancedproductionandsolubilitypET-43.1a-cdesignedforcloningandhigh-levelexpressionofpolypeptidesequencesfusedwiththe495aaNusA(Nus?Tag?)proteinpET-44a-cwithNus?Tag?sequenceplusN-andC-terminalHis?TagsequencespET-45b(+)withamino-terminalHis?Tag?sequenceandminimalextraneoussequencespET-46Ek/LICpreparedvectorforligation-independentcloning,withamino-terminalHis?Tag?sequencepET-47b(+)throughpET-50b(+)withHRV3CProteasecleavagesiteforefficientfusiontagremovalAdditionalvectorsinthistableinclude:pLacIpLysEandpLysSNovagen公司的pET表達載體系列pETVectors73Novagen公司的PET32a表達載體圖譜Novagen公司的PET32a表達載體圖譜74Novagen公司的pET表達載體選擇從開始涉及表達的時候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼子進行選擇，Novagen公司僅提供三個載體：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。根據(jù)是否要可溶性表達，選擇加有不同標記的載體。一般說來在大腸桿菌中不加標記外源蛋白都會以不溶的包涵體形式表達。為了讓外源蛋白融合表達一般說來有三個策略：1.與一個高度可溶的多肽聯(lián)合一起表達，比如：谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneStransferase,GST）、硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）和N利用底物A蛋白（NutilizationsubstanceA,NusA）。2.轉(zhuǎn)入一個酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白，DsbA，DsbC。3.插入一個定位到周質(zhì)空間的信號肽序列。以上載體都是采用抗生素抗性篩選，如果你希望用藍白斑篩選可以使用pETBlue系列載體。在重組技術(shù)上，Novagen除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式：Ligation-Independentcloning，簡稱LIC。采用LIC方法的pET載體是線性化的，在末端有12-15個突出的堿基以在退火時和目的片斷互補。在設(shè)計PCR擴增引物時加入與LIC載體互補的序列，PCR產(chǎn)物用3’→5’的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補的序列。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入LIC載體上。Novagen公司的pET表達載體選擇從開始涉及表達的時候可75Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇Novagen提供多種表達使用的菌株，為了提高表達量做出了各種改造，它們大致分為以下幾個種類：1.蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，這包括有B834,BL21,BLR,Origami?B,Rosetta?和Tuner?。因此在純化時可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。BL21(DE3)是應(yīng)用最多的表達的表達菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大腸桿菌中介導(dǎo)同源重組的重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。2.保證所有細胞以同樣量進行表達Tuner?株及它的衍生株（Origami?B和Rosetta?）是BL21菌株的lacY1缺失突變型，在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細胞中表達。Lac滲透酶的突變使進入每個細胞的IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達濃度可以隨著IPTG濃度而改變。通過對IPTG濃度的控制可以使細胞微量表達或者大量表達。一般說來，低濃度表達有利于蛋白的可溶性和活性。Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇Novagen提供多種表76Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇3.二硫鍵形成與溶解性增強二硫鍵的形成對某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也專門設(shè)計了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（gor）和/或硫氧還蛋白還原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami?。在這些菌株中表達蛋白，可以更大程度促進二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。4.稀有密碼子的補給不同物種有不同的密碼子偏愛性，如果外源蛋白中含大量大腸桿菌的稀有密碼子，特別當這些稀有密碼子呈連續(xù)分布的時候，就會造成蛋白表達量極低，或者翻譯提前終止。Rosetta?是為了表達真核蛋白而特別設(shè)計的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。Rosetta系列是來自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。5.硒蛋氨酸標記B834是來源于BL21的蛋氨酸（met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性35S-met標記和晶體成像蛋氨酸標記中非常有用。Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇3.二硫鍵形成與溶解性77原核表達需要考慮的問題在原核蛋白表達過程中，選擇構(gòu)建一個合適原核表達體系需要綜合考慮3大因素：表達載體、宿主菌株、表達誘導(dǎo)條件,以獲得最滿意的表達效果。原核表達需要考慮的問題在原核蛋白表達過程中，選擇構(gòu)建一個合適78大腸桿菌表達系統(tǒng)的高效表達策略1、采用高強度啟動子-如T7啟動子；2、將目的基因所有密碼子都換成大腸桿菌偏好的密碼子（需要重新合成基因），或采用含有大腸桿菌稀有密碼子tRNA

的Rosetta系列菌株。3、采用豐富培養(yǎng)基（如TB）代替普通的LB培養(yǎng)基；4、優(yōu)化大腸桿菌的生長條件和目的基因的誘導(dǎo)表達條件。大腸桿菌表達系統(tǒng)的高效表達策略1、采用高強度啟動子-如T7啟79使用pET表達系統(tǒng)的常見問題分析

幾個常見問題如下表：使用pET表達系統(tǒng)的常見問題分析幾個常見問題如下表：80原核表達常見的幾個問題及回答（1）1、目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)。解決辦法：采用以下八種策略提高目的蛋白的可溶性。原核表達常見的幾個問題及回答（1）1、目的蛋白總是以不可溶的81提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：（1）在細胞中表達分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合；（2）共表達折疊酶，催化共價鍵形成；（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚合傾向的中間體的濃度；（4）選擇中等強度或低強度的啟動子代替強啟動子，降低重組蛋白的合成速度；（5）選擇適合的宿主菌株；（6）表達含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性；（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）誘導(dǎo)過程中加入化學物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：82原核表達常見的幾個問題及回答（2）2、必須去除融合多肽或蛋白質(zhì)標簽才能使目的蛋白獲得活性嗎？回答：大多數(shù)情況下目的蛋白帶有His-Tag,S-Tag,11個氨基酸的T7-Tag或HSV-Tag等小肽時仍能表現(xiàn)出完全的活性。這些肽段都較為親水，理論上都不會干擾蛋白的三維結(jié)構(gòu)。我們建議首先測試蛋白活性，再看是否一定要去除前導(dǎo)序列才能適合特定的應(yīng)用要求。原核表達常見的幾個問題及回答（2）2、必須去除融合多肽或蛋白83原核表達常見的幾個問題及回答（3）3、如果目的蛋白包含信號序列，它會不會被運至細胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在？還是目的蛋白甚至可以被分泌到生長培養(yǎng)基中？回答：如果目的蛋白包含ompT或pelB這樣的前導(dǎo)序列，理論上它應(yīng)該被運至細胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在。如果在生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)目的蛋白的話，多半是因為細胞壁受到破壞，而并不代表蛋白是被分泌到培養(yǎng)基中的。除了信號肽對蛋白質(zhì)的運輸有影響，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成熟區(qū)對蛋白質(zhì)的運轉(zhuǎn)也有影響。因此在細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)及其它區(qū)域發(fā)現(xiàn)目的蛋白都很正常。某些情況下降低誘導(dǎo)時的培養(yǎng)溫度至25-30℃，可能提高蛋白運輸?shù)谋壤?。原核表達常見的幾個問題及回答（3）3、如果目的蛋白包含信號序84原核表達常見的幾個問題及回答（4）4、IPTG誘導(dǎo)后細胞停止了生長，是不是表示細胞死了？回答：T7RNA聚合酶非?；钴S，T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號極強，因此，一旦誘導(dǎo)，細胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達的方面轉(zhuǎn)化。在通常情況下，細胞將停止生長，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成試驗可以用來檢測表達系統(tǒng)的性能。但也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴緊的載體/宿主菌組合(比如含有plysE的宿主菌)等，這時在誘導(dǎo)后菌落還是會繼續(xù)生長。原核表達常見的幾個問題及回答（4）4、IPTG誘導(dǎo)后細胞停止85原核表達常見的幾個問題及回答（5）5、除了毒性和降解，還有些什么因素會影響目的蛋白的表達水平？回答：（1）mRNA轉(zhuǎn)錄子中的二級結(jié)構(gòu)會干擾AUG翻譯起始密碼子和/或核糖體結(jié)合位點。所有pET載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是下列兩種之一：RbsNdeI/NcoI5’…AAGAAGGAGAUAUACAUAUG…3’5’…AAGAAGGAGAUAUACCAUGG…3’如果發(fā)現(xiàn)表達很差，你可以通過檢查編碼插入序列的鏈上的與上述序列互補的序列：5‘-CATATGTATATCTCCTTCTT-3’或5’-CCATGGTATATCTCCTTCTT-3‘以確定是否因為存在潛在的二級結(jié)構(gòu)造成麻煩。原核表達常見的幾個問題及回答（5）5、除了毒性和降解，還有些86原核表達常見的幾個問題及回答（5）（2）目的基因中稀有密碼子