基因工程的奇跡課件

第三章基因工程的奇跡第三章13.1DNA雙螺旋DNA—脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）1953年，詹姆斯·沃森（JamesWatson）和弗朗西斯·克里克（FrancisCrick）共同發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，他們的發(fā)現(xiàn)從此改變了人類對自身的認(rèn)識。3.1DNA雙螺旋DNA—脫氧核糖核酸（deoxyribo2DNA的構(gòu)造元件是核苷酸一分子戊糖一個磷酸基團一種堿基組成核苷酸之間由磷酸二酯鍵連接堿基之間通過氫鍵連接

DNA的構(gòu)造元件是核苷酸一分子戊糖核苷酸之間由磷酸二酯鍵連接3A和T數(shù)量相當(dāng)，G和C數(shù)目一致，符合堿基當(dāng)量規(guī)則。遺傳信息就儲存在這些堿基序列中

A和T數(shù)量相當(dāng)，遺傳信息就儲存在這些堿基序列中43.2遺傳密碼RNA——核糖核酸（ribonucleicacid）RNA中尿嘧啶(U)取代了DNA中胸腺嘧啶(T)RNA有3種：mRNA（信使RNA）rRNA（核糖體RNA）tRNA（轉(zhuǎn)運RNA）

均由RNA聚合酶以DNA為模板轉(zhuǎn)錄出來3.2遺傳密碼RNA——核糖核酸（ribonucleic5RNA聚合酶與新合成的RNADNARNARNA聚合酶RNA聚合酶與新合成的RNADNARNARNA聚合酶6真正攜帶著蛋白質(zhì)信息的是mRNA！DNA編碼片段復(fù)制產(chǎn)生mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription）

真正攜帶著蛋白質(zhì)信息的是mRNA！DNA編碼片段復(fù)制產(chǎn)生mR7結(jié)構(gòu)基因：外顯子+內(nèi)含子外顯子（exon）：真核基因中遺傳信息的編碼區(qū)段。內(nèi)含子（intron）：真核基因中不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段。只攜帶蛋白質(zhì)編碼信息的mRNA就是成熟的mRNA結(jié)構(gòu)基因：外顯子+內(nèi)含子外顯子（exon）：真核基因中遺傳信8第三章基因工程的奇跡課件9幾個不同的三聯(lián)體密碼子編碼相同的氨基酸，稱為密碼子的兼并性。纈氨酸丙氨酸亮氨酸由6種不同的密碼子編碼如：都是由4種不同的密碼子編碼為什么無法準(zhǔn)確的從蛋白質(zhì)序列推定相應(yīng)的DNA序列？幾個不同的三聯(lián)體密碼子編碼相同的氨基酸，稱為密碼子的兼并性10UAA,UAG,UGA：肽鏈翻譯的終止信號AUG(編碼甲硫氨酸)：真核生物中的翻譯起始信號UAA,UAG,UGA：肽鏈翻譯的終止信號AUG(編碼甲硫氨11鬼筆鵝膏產(chǎn)生的α-鵝膏菌素能夠?qū)е翿NA聚合酶不可逆轉(zhuǎn)的失活。鬼筆鵝膏產(chǎn)生的α-鵝膏菌素能夠?qū)е翿NA聚合酶不可逆轉(zhuǎn)的失123.3蛋白質(zhì)生產(chǎn)工廠——核糖體核糖體一個大亞基一個小亞基蛋白質(zhì)+rRNAtRNA的作用：將活性狀態(tài)的氨基酸結(jié)合到核糖體上。tRNA是一種三葉草結(jié)構(gòu)3.3蛋白質(zhì)生產(chǎn)工廠——核糖體核糖體一個大亞基蛋白質(zhì)+13蛋白質(zhì)的合成過程蛋白質(zhì)的合成過程143.4重組（recombination）定義：將來源于兩種或更多種生物的基因區(qū)段重新排列組合。基因重組是基因工程必不可少的重要一步！

3.4重組（recombination）定義：將來源于兩種153.4.1質(zhì)?！z傳重組的理想載體攜帶外源基因進入受體細(xì)胞進行擴增和表達的工具叫做載體（vector）。

3.4.1質(zhì)?！z傳重組的理想載體攜帶外源基因進入受體細(xì)16質(zhì)粒：存在于細(xì)菌體內(nèi)并獨立于細(xì)菌染色體之外的能夠自我復(fù)制的小的閉合環(huán)狀的雙鏈DNA。

質(zhì)粒：存在于細(xì)菌體內(nèi)并獨立于細(xì)菌染色體之外的能夠自我復(fù)制的小17大腸桿菌的質(zhì)粒大腸桿菌的質(zhì)粒18通過結(jié)合建立起來一道“橋”來交換質(zhì)粒通過結(jié)合建立起來一道“橋”來交換質(zhì)粒19細(xì)菌具有的抗藥性并非是質(zhì)粒直接賦予的，而是質(zhì)粒所攜帶的抗菌素抗性基因表達出的酶能夠使那些抗菌素失活，它把這種特性給予了細(xì)菌，使細(xì)菌也具有了相應(yīng)的抗生素抗性。細(xì)菌具有的抗藥性并非是質(zhì)粒直接賦予的，而是質(zhì)粒所攜帶的抗菌素20質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性a.質(zhì)粒大小為1-200kb不等，可以“友好”地借居在宿主細(xì)胞中。b.質(zhì)粒最重要的編碼特性是對抗菌素具有抗性。氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性a.質(zhì)粒大小為1-200kb不等，可以“21第三章基因工程的奇跡課件22c.質(zhì)粒具有3種不同的構(gòu)型：超螺旋(SC)、開環(huán)(OC)、線性(L)c.質(zhì)粒具有3種不同的構(gòu)型：超螺旋(SC)、開環(huán)(OC)、線23d.質(zhì)粒有2種不同的復(fù)制類型，嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）和松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）。e.質(zhì)粒具有不親和性，也叫不相容性。d.質(zhì)粒有2種不同的復(fù)制類型，嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent24目前基因工程技術(shù)中使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101：8.8kb，拷貝數(shù)5，四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TCrColE1：6.5kb，拷貝數(shù)20-30，大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1rRSF2124：ColE1衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr目前基因工程技術(shù)中使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)25抗菌素選擇原理當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能在含有抗菌素的培養(yǎng)基中生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。活死抗性基因抗菌素抗菌素選擇原理當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌26為什么質(zhì)粒可以作為遺傳重組的載體？斯坦福大學(xué)的質(zhì)粒專家Cohen

：在體外，質(zhì)粒能夠“走私”外源DNA（形成重組體），然后象布谷鳥一樣將自己的蛋（重組體）下到別家的鳥窩（細(xì)菌細(xì)胞）里。

為什么質(zhì)粒可以作為遺傳重組的載體？斯坦福大學(xué)的質(zhì)粒專家C273.4.2限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶——分子級別的剪刀和膠水限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

能夠識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并由此產(chǎn)生切割的一類內(nèi)切酶。3.4.2限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶——分子級別的剪28①能夠識別由4-8個核苷酸組成的具有回文對稱結(jié)構(gòu)的序列

EcoRI的切割位點

EcoRI的識別序列

5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’基本特性：①能夠識別由4-8個核苷酸組成的具有回文對稱29②DNA分子有二種斷裂類型一是具有粘性末端的DNA片段。如EcoRⅠ、PstⅠ粘性末端：指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。②DNA分子有二種斷裂類型粘性末端：指DNA分子在限制酶的30EcoRI產(chǎn)生的5’粘性末端EcoRI產(chǎn)生的5’粘性末端31PstI產(chǎn)生的3’粘性末端PstI產(chǎn)生的3’粘性末端32第二種具有平末端的DNA片段。如EcoRⅤ、PvuⅡ具有平末端的DNA片段不易于重新環(huán)化

②DNA分子有二種斷裂類型一是具有粘性末端的DNA片段。如EcoRⅠ、PstⅠ第二種具有平末端的DNA片段。如EcoRⅤ、PvuⅡ②DN33PvuII產(chǎn)生的平頭末端PvuII產(chǎn)生的平頭末端34③同位酶、同裂酶、同尾酶同位酶（isoschizomers）：來源不同的限制酶可識別相同的DNA序列，但是在序列中切割位置卻不同。如：XmaⅠCCCGGGSmaⅠCCCGGGGGGCCCGGGCCC③同位酶、同裂酶、同尾酶同位酶（isoschizomers35同裂酶（isoschizomers）：來源不同的限制酶識別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。如：SstⅠCCGCGGSacⅠCCGCGGGGCGCCGGCGCC同裂酶（isoschizomers）：來源不同的限制酶識別同36同尾酶（isocaudamers）：來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端。常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端。同尾酶（isocaudamers）：來源各異，識別的靶子序列37限制性核酸內(nèi)切酶的命名

限制性核酸內(nèi)切酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。如HindⅢ，前三個字母來自于菌種名稱H.influenzae，“d”表示菌系為d型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。EcoRⅠ---EsoherichiacoliRⅠSacⅠ---StreptomycesachromagenesⅠ限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶由三部38DNA連接酶（DNAligase）:

能夠催化DNA雙鏈上相鄰的3’-OH和5’-P共價結(jié)合形成3’-5’磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來的酶。

最常用T4—DNA連接酶，來源于T4噬菌體DNA連接酶（DNAligase）:能夠催化DNA雙鏈上39T4—DNA連接酶的基本性質(zhì)T4—DNA連接酶的基本性質(zhì)40(2)修復(fù)RNA—DNA雜交雙鏈上缺口處的磷酸二酯鍵(2)修復(fù)RNA—DNA雜交雙鏈上缺口處的磷酸二酯鍵41(3)連接完全斷開的兩個平頭雙鏈DNA分子(3)連接完全斷開的兩個平頭雙鏈DNA分子423.5基因技術(shù)的第一次嘗試——呱呱落地的細(xì)菌S.Cohenand

H.Boyer

1972年，他們共同開創(chuàng)基因技術(shù)的第一次實驗3.5基因技術(shù)的第一次嘗試——呱呱落地的細(xì)菌S.Cohen43TCKanTCKanTCKanTCKan44TC具有雙抗性的重組工程菌呱呱落地了

!TC具有雙抗性的重組工程菌呱呱落地了!45“爪蟾-細(xì)菌”融合質(zhì)?！白?細(xì)菌”融合質(zhì)粒46從中得到的更重要的東西：一種基因工程普遍適用的方法——DNA克隆技術(shù)得以發(fā)展，它能夠制造和分析大量高等生物的遺傳材料。從中得到的更重要的東西：一種基因工程普遍適用的方法——DNA473.6如何獲得基因為什么真核基因不能在原核細(xì)菌中表達？原核生物體內(nèi)不具有對真核生物基因的內(nèi)含子進行剪切的功能。3.6如何獲得基因為什么真核基因不能在原核細(xì)菌中表達？原核48獲得基因的方法：a.將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNAb.化學(xué)合成基因，前提是基因的序列已知逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）：將單鏈mRNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA(complementaryDNA,互補DNA)的酶。獲得基因的方法：逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscrip49DNA合成儀DNA合成儀503.7胰島素

是由胰腺的胰島細(xì)胞分泌的一種非常重要的小分子激素蛋白。I型糖尿?。河捎谝认僦幸葝u細(xì)胞被破壞不能產(chǎn)生胰島素而引起的，又稱胰島素依賴型糖尿病。II型糖尿?。河捎跈C體的肝臟、肌肉及脂肪細(xì)胞等對胰島素促進葡萄糖的吸收、轉(zhuǎn)化、利用發(fā)生了抵抗而導(dǎo)致的。3.7胰島素是由胰腺的胰島細(xì)胞分泌的一種非常重要的小分子511953年，美國科學(xué)家F.Sanger證實了胰島素的結(jié)構(gòu)，它是由兩條多肽鏈組成的，其中一條有21個氨基酸，稱為A鏈，另一條有30個氨基酸，稱為B鏈。

F.Sanger（1918~）1953年，美國科學(xué)家F.Sanger證實了胰島素的結(jié)構(gòu)，它52人體內(nèi)胰島素的合成人體內(nèi)胰島素的合成53人體內(nèi)胰島素的合成人體內(nèi)胰島素的合成5435個氨基酸稱為C鏈，它對于胰島素的空間構(gòu)象的正確折疊是必需的，能夠保證A鏈和B鏈在連接時的正確朝向。

24個氨基酸是信號肽，幫助前胰島素原從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入細(xì)胞質(zhì)中。35個氨基酸稱為C鏈，它對于胰島素的空間構(gòu)象的正確折疊是必需55豬胰島素與人胰島素相比，有一個氨基酸序列的差異，人胰島素B鏈的末端是蘇氨酸，而豬胰島素B鏈末端是丙氨酸。

豬胰島素與人胰島素相比，有一個氨基酸序列的差異，人胰島素B鏈56胰蛋白酶（trypsin）：一種水解酶a.能夠特異水解蛋白質(zhì)中賴氨酸或者精氨酸旁邊的肽段。而豬胰島素B鏈末端的丙氨酸恰巧就在賴氨酸后面。b.在無水環(huán)境下可以重組肽鏈（將其它的氨基酸連接到肽鏈上）。

胰蛋白酶（trypsin）：一種水解酶a.能夠特異水解蛋白質(zhì)57第三章基因工程的奇跡課件5820世紀(jì)30年代Hoechst公司生產(chǎn)的豬胰島素產(chǎn)品廣告

20世紀(jì)30年代Hoechst公司生產(chǎn)的豬胰島素產(chǎn)品廣告593.8第一種基因工程胰島素的誕生

1982年，美國EliLilly公司首先開始利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素。

A鏈和B鏈的基因分別合成3.8第一種基因工程胰島素的誕生1982年，美國Eli60第三章基因工程的奇跡課件61有活性的重組人胰島素誕生了

有活性的重組人胰島素誕生了62Humulin（優(yōu)泌林）

重組人胰島素1982年10月在美國上市，全球第一個商業(yè)化基因重組人胰島素。EliLillyandCompanyHumulin重組人胰島素1982年10月在美國上市，全球第63缺點：A鏈和B鏈的連接方向難以確定，二硫鍵的正確配對率較低，使得每克胰島素的成本仍高達100美元以上。缺點：A鏈和B鏈的連接方向難以確定，二硫鍵的正確配對率較低，643.9從單一大腸桿菌菌株中獲得人胰島素合成了除信號肽序列以外的整個胰島素原基因，即B-C-A的DNA序列。細(xì)胞培養(yǎng)3.9從單一大腸桿菌菌株中獲得人胰島素合成了除信號肽序列65這正是現(xiàn)在的醫(yī)藥企業(yè)制造胰島素的方法

CNBrBCAβ-Gal多肽鏈折疊，通過亞硫酸鹽氧化半胱氨酸殘基活性胰島素這正是現(xiàn)在的醫(yī)藥企業(yè)制造胰島素的方法CNBrB66由于C肽的存在，幫助了A鏈和B鏈確定正確的連接方向，二硫鍵的正確配對率相應(yīng)提高，每克胰島素最終產(chǎn)品的成本僅50美元。由于C肽的存在，幫助了A鏈和B鏈確定正確的連接方向，二硫鍵67Novolin（諾和靈）1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)的人胰島素。NovoNordiskNovolin（諾和靈）1987年，Novo公司又推出了利683.10利用轉(zhuǎn)基因哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)復(fù)合蛋白質(zhì)復(fù)雜的動物和人類蛋白質(zhì)在發(fā)揮作用前，還需要進行糖基化、磷酸化等等一些修飾或加上其他的核酸基團，而原核細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)并不能進行這些過程

。

為什么重組的真核基因在原核細(xì)菌里表達出來的蛋白質(zhì)不具有活性？3.10利用轉(zhuǎn)基因哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)復(fù)合蛋白質(zhì)復(fù)雜的動物和人69最好的基因工程細(xì)胞表達系統(tǒng)是哺乳動物細(xì)胞（mammaliancell）最具代表性的是CHO，中國倉鼠卵巢細(xì)胞(ChineseHamsterOvary,CHO)。

真核酵母的局限性：它們?nèi)狈δ承┨囟ǖ鞍踪|(zhì)修飾所需的酶或輔因子，或者缺乏使蛋白質(zhì)正確折疊并形成穩(wěn)定二硫鍵的細(xì)胞器。

最好的基因工程細(xì)胞表達系統(tǒng)是哺乳動物細(xì)胞（mammalian70第三章基因工程的奇跡第三章713.1DNA雙螺旋DNA—脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）1953年，詹姆斯·沃森（JamesWatson）和弗朗西斯·克里克（FrancisCrick）共同發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，他們的發(fā)現(xiàn)從此改變了人類對自身的認(rèn)識。3.1DNA雙螺旋DNA—脫氧核糖核酸（deoxyribo72DNA的構(gòu)造元件是核苷酸一分子戊糖一個磷酸基團一種堿基組成核苷酸之間由磷酸二酯鍵連接堿基之間通過氫鍵連接

DNA的構(gòu)造元件是核苷酸一分子戊糖核苷酸之間由磷酸二酯鍵連接73A和T數(shù)量相當(dāng)，G和C數(shù)目一致，符合堿基當(dāng)量規(guī)則。遺傳信息就儲存在這些堿基序列中

A和T數(shù)量相當(dāng)，遺傳信息就儲存在這些堿基序列中743.2遺傳密碼RNA——核糖核酸（ribonucleicacid）RNA中尿嘧啶(U)取代了DNA中胸腺嘧啶(T)RNA有3種：mRNA（信使RNA）rRNA（核糖體RNA）tRNA（轉(zhuǎn)運RNA）

均由RNA聚合酶以DNA為模板轉(zhuǎn)錄出來3.2遺傳密碼RNA——核糖核酸（ribonucleic75RNA聚合酶與新合成的RNADNARNARNA聚合酶RNA聚合酶與新合成的RNADNARNARNA聚合酶76真正攜帶著蛋白質(zhì)信息的是mRNA！DNA編碼片段復(fù)制產(chǎn)生mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription）

真正攜帶著蛋白質(zhì)信息的是mRNA！DNA編碼片段復(fù)制產(chǎn)生mR77結(jié)構(gòu)基因：外顯子+內(nèi)含子外顯子（exon）：真核基因中遺傳信息的編碼區(qū)段。內(nèi)含子（intron）：真核基因中不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段。只攜帶蛋白質(zhì)編碼信息的mRNA就是成熟的mRNA結(jié)構(gòu)基因：外顯子+內(nèi)含子外顯子（exon）：真核基因中遺傳信78第三章基因工程的奇跡課件79幾個不同的三聯(lián)體密碼子編碼相同的氨基酸，稱為密碼子的兼并性。纈氨酸丙氨酸亮氨酸由6種不同的密碼子編碼如：都是由4種不同的密碼子編碼為什么無法準(zhǔn)確的從蛋白質(zhì)序列推定相應(yīng)的DNA序列？幾個不同的三聯(lián)體密碼子編碼相同的氨基酸，稱為密碼子的兼并性80UAA,UAG,UGA：肽鏈翻譯的終止信號AUG(編碼甲硫氨酸)：真核生物中的翻譯起始信號UAA,UAG,UGA：肽鏈翻譯的終止信號AUG(編碼甲硫氨81鬼筆鵝膏產(chǎn)生的α-鵝膏菌素能夠?qū)е翿NA聚合酶不可逆轉(zhuǎn)的失活。鬼筆鵝膏產(chǎn)生的α-鵝膏菌素能夠?qū)е翿NA聚合酶不可逆轉(zhuǎn)的失823.3蛋白質(zhì)生產(chǎn)工廠——核糖體核糖體一個大亞基一個小亞基蛋白質(zhì)+rRNAtRNA的作用：將活性狀態(tài)的氨基酸結(jié)合到核糖體上。tRNA是一種三葉草結(jié)構(gòu)3.3蛋白質(zhì)生產(chǎn)工廠——核糖體核糖體一個大亞基蛋白質(zhì)+83蛋白質(zhì)的合成過程蛋白質(zhì)的合成過程843.4重組（recombination）定義：將來源于兩種或更多種生物的基因區(qū)段重新排列組合?；蛑亟M是基因工程必不可少的重要一步！

3.4重組（recombination）定義：將來源于兩種853.4.1質(zhì)?！z傳重組的理想載體攜帶外源基因進入受體細(xì)胞進行擴增和表達的工具叫做載體（vector）。

3.4.1質(zhì)?！z傳重組的理想載體攜帶外源基因進入受體細(xì)86質(zhì)粒：存在于細(xì)菌體內(nèi)并獨立于細(xì)菌染色體之外的能夠自我復(fù)制的小的閉合環(huán)狀的雙鏈DNA。

質(zhì)粒：存在于細(xì)菌體內(nèi)并獨立于細(xì)菌染色體之外的能夠自我復(fù)制的小87大腸桿菌的質(zhì)粒大腸桿菌的質(zhì)粒88通過結(jié)合建立起來一道“橋”來交換質(zhì)粒通過結(jié)合建立起來一道“橋”來交換質(zhì)粒89細(xì)菌具有的抗藥性并非是質(zhì)粒直接賦予的，而是質(zhì)粒所攜帶的抗菌素抗性基因表達出的酶能夠使那些抗菌素失活，它把這種特性給予了細(xì)菌，使細(xì)菌也具有了相應(yīng)的抗生素抗性。細(xì)菌具有的抗藥性并非是質(zhì)粒直接賦予的，而是質(zhì)粒所攜帶的抗菌素90質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性a.質(zhì)粒大小為1-200kb不等，可以“友好”地借居在宿主細(xì)胞中。b.質(zhì)粒最重要的編碼特性是對抗菌素具有抗性。氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性a.質(zhì)粒大小為1-200kb不等，可以“91第三章基因工程的奇跡課件92c.質(zhì)粒具有3種不同的構(gòu)型：超螺旋(SC)、開環(huán)(OC)、線性(L)c.質(zhì)粒具有3種不同的構(gòu)型：超螺旋(SC)、開環(huán)(OC)、線93d.質(zhì)粒有2種不同的復(fù)制類型，嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）和松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）。e.質(zhì)粒具有不親和性，也叫不相容性。d.質(zhì)粒有2種不同的復(fù)制類型，嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent94目前基因工程技術(shù)中使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101：8.8kb，拷貝數(shù)5，四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TCrColE1：6.5kb，拷貝數(shù)20-30，大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1rRSF2124：ColE1衍生質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr目前基因工程技術(shù)中使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)95抗菌素選擇原理當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能在含有抗菌素的培養(yǎng)基中生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長?；钏揽剐曰蚩咕乜咕剡x擇原理當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌96為什么質(zhì)粒可以作為遺傳重組的載體？斯坦福大學(xué)的質(zhì)粒專家Cohen

：在體外，質(zhì)粒能夠“走私”外源DNA（形成重組體），然后象布谷鳥一樣將自己的蛋（重組體）下到別家的鳥窩（細(xì)菌細(xì)胞）里。

為什么質(zhì)粒可以作為遺傳重組的載體？斯坦福大學(xué)的質(zhì)粒專家C973.4.2限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶——分子級別的剪刀和膠水限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

能夠識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并由此產(chǎn)生切割的一類內(nèi)切酶。3.4.2限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶——分子級別的剪98①能夠識別由4-8個核苷酸組成的具有回文對稱結(jié)構(gòu)的序列

EcoRI的切割位點

EcoRI的識別序列

5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’基本特性：①能夠識別由4-8個核苷酸組成的具有回文對稱99②DNA分子有二種斷裂類型一是具有粘性末端的DNA片段。如EcoRⅠ、PstⅠ粘性末端：指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。②DNA分子有二種斷裂類型粘性末端：指DNA分子在限制酶的100EcoRI產(chǎn)生的5’粘性末端EcoRI產(chǎn)生的5’粘性末端101PstI產(chǎn)生的3’粘性末端PstI產(chǎn)生的3’粘性末端102第二種具有平末端的DNA片段。如EcoRⅤ、PvuⅡ具有平末端的DNA片段不易于重新環(huán)化

②DNA分子有二種斷裂類型一是具有粘性末端的DNA片段。如EcoRⅠ、PstⅠ第二種具有平末端的DNA片段。如EcoRⅤ、PvuⅡ②DN103PvuII產(chǎn)生的平頭末端PvuII產(chǎn)生的平頭末端104③同位酶、同裂酶、同尾酶同位酶（isoschizomers）：來源不同的限制酶可識別相同的DNA序列，但是在序列中切割位置卻不同。如：XmaⅠCCCGGGSmaⅠCCCGGGGGGCCCGGGCCC③同位酶、同裂酶、同尾酶同位酶（isoschizomers105同裂酶（isoschizomers）：來源不同的限制酶識別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。如：SstⅠCCGCGGSacⅠCCGCGGGGCGCCGGCGCC同裂酶（isoschizomers）：來源不同的限制酶識別同106同尾酶（isocaudamers）：來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端。常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端。同尾酶（isocaudamers）：來源各異，識別的靶子序列107限制性核酸內(nèi)切酶的命名

限制性核酸內(nèi)切酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。如HindⅢ，前三個字母來自于菌種名稱H.influenzae，“d”表示菌系為d型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。EcoRⅠ---EsoherichiacoliRⅠSacⅠ---StreptomycesachromagenesⅠ限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶由三部108DNA連接酶（DNAligase）:

能夠催化DNA雙鏈上相鄰的3’-OH和5’-P共價結(jié)合形成3’-5’磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來的酶。

最常用T4—DNA連接酶，來源于T4噬菌體DNA連接酶（DNAligase）:能夠催化DNA雙鏈上109T4—DNA連接酶的基本性質(zhì)T4—DNA連接酶的基本性質(zhì)110(2)修復(fù)RNA—DNA雜交雙鏈上缺口處的磷酸二酯鍵(2)修復(fù)RNA—DNA雜交雙鏈上缺口處的磷酸二酯鍵111(3)連接完全斷開的兩個平頭雙鏈DNA分子(3)連接完全斷開的兩個平頭雙鏈DNA分子1123.5基因技術(shù)的第一次嘗試——呱呱落地的細(xì)菌S.Cohenand

H.Boyer

1972年，他們共同開創(chuàng)基因技術(shù)的第一次實驗3.5基因技術(shù)的第一次嘗試——呱呱落地的細(xì)菌S.Cohen113TCKanTCKanTCKanTCKan114TC具有雙抗性的重組工程菌呱呱落地了

!TC具有雙抗性的重組工程菌呱呱落地了!115“爪蟾-細(xì)菌”融合質(zhì)?！白?細(xì)菌”融合質(zhì)粒116從中得到的更重要的東西：一種基因工程普遍適用的方法——DNA克隆技術(shù)得以發(fā)展，它能夠制造和分析大量高等生物的遺傳材料。從中得到的更重要的東西：一種基因工程普遍適用的方法——DNA1173.6如何獲得基因為什么真核基因不能在原核細(xì)菌中表達？原核生物體內(nèi)不具有對真核生物基因的內(nèi)含子進行剪切的功能。3.6如何獲得基因為什么真核基因不能在原核細(xì)菌中表達？原核118獲得基因的方法：a.將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNAb.化學(xué)合成基因，前提是基因的序列已知逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）：將單鏈mRNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA(complementaryDNA,互補DNA)的酶。獲得基因的方法：逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscrip119DNA合成儀DNA合成儀1203.7胰島素

是由胰腺的胰島細(xì)胞分泌的一種非常重要的小分子激素蛋白。I型糖尿?。河捎谝认僦幸葝u細(xì)胞被破壞不能產(chǎn)生胰島素而引起的，又稱胰島素依賴型糖尿病。II型糖尿?。河捎跈C體的肝臟、肌肉及脂肪細(xì)胞等對胰島素促進葡萄糖的吸收、轉(zhuǎn)化、利用發(fā)生了抵抗而導(dǎo)致的。3.7胰島素是由胰腺的胰島細(xì)胞分泌的一種非常重要的小分子1211953年，美國科學(xué)家F.Sanger證實了胰島素的結(jié)構(gòu)，它是由兩條多肽鏈組成的，其中一條有21個氨基酸，稱為A鏈，另一條有30個氨基酸，稱為B鏈。

F.Sanger（1918~）1953年，美國科學(xué)家F.Sanger證實了胰島素的結(jié)構(gòu)，它122人體內(nèi)胰島素的合成人體內(nèi)胰島素的合成123人體內(nèi)胰島素的合成人體內(nèi)胰島素的合成12435個氨基酸稱為C鏈，它對于胰島素的空間構(gòu)象的正確折疊是必需的，能夠保證A鏈和B鏈在連接時的正確朝向。

24個氨基酸是信號肽，幫助前胰島素原從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入細(xì)胞質(zhì)中。35個氨基酸稱為C鏈，它對于胰島素的空間構(gòu)象的正確折疊是必需125豬胰島素與人胰島素相比，有一個氨基酸序列的差異，人胰島素B鏈的末端是蘇氨酸，而豬胰島素B鏈末端是丙氨酸。

豬胰