分子生物學(xué)基因治療

關(guān)于分子生物學(xué)基因治療第一頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、基因治療的概念1990人類第一例基因治療獲得成功1966年，Lederberg提出基因治療概念基因治療(genetherapy)：將正?；蛑踩氚屑?xì)胞代替遺傳缺陷的基因,或關(guān)閉、抑制異常表達(dá)的基因，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的一種臨床治療技術(shù)。人類疾病治療的重大突破!與傳統(tǒng)的方法相比較，從根本上消除遺傳病因。第二頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、基因治療類型和途徑生殖細(xì)胞基因治療(germinalgenethrapy)體外（exvivo）間接基因治療

體細(xì)胞基因治療(somaticgenethrapy)1、類型2、途徑

體內(nèi)（invivo）直接基因治療第三頁，共四十五頁，2022年，8月28日1、基因矯正：原位修復(fù)缺陷基因原位替換（同源重組）2、基因添加：正常基因非特異插入基因組以補(bǔ)償異?；虻墓δ苋毕?、基因失活：抑制、關(guān)閉異常表達(dá)的基因矯正突變?nèi)⒒蛑委煹牟呗?、重新開放已關(guān)閉的基因第四頁，共四十五頁，2022年，8月28日四、基因治療的方法（一）體細(xì)胞的基因治療方法

2、受體細(xì)胞的選擇3、將治療轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)4、將帶有目的基因的細(xì)胞重新輸回體內(nèi)體外基因治療時(shí)（二）反義技術(shù)（antisensetechnology)（三）RNA干擾（shortinterferenceRNA)1、治療基因的制備第五頁，共四十五頁，2022年，8月28日五、基因治療的現(xiàn)狀1、一些單基因病的治療

嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷癥（ADA綜合癥）、血友病B、囊性纖維化（CF），苯丙酮尿癥等2、Bata-地中海貧血病別醇嘌呤重新開放r基因3、多基因病心血管疾病，糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等4、腫瘤5、其它疾?。篐IV第六頁，共四十五頁，2022年，8月28日六、基因治療的問題、前景問題：1、穩(wěn)定性2、安全性3、導(dǎo)入基因的高效表達(dá)4、免疫性5、倫理問題

前景：十分有潛力的技術(shù)，有深遠(yuǎn)的意義

“基因治療作為一項(xiàng)新的治療技術(shù)，將不只限于遺傳病和腫瘤的治療，在可見的將來，它將是臨床上多種疾病可選擇的治療方法?！?/p>

第七頁，共四十五頁，2022年，8月28日應(yīng)用腺苷脫氨酶基因ADA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷癥（SCID）第八頁，共四十五頁，2022年，8月28日遺傳病的常規(guī)治療（一）外科治療矯正畸形、組織和器官移植（二）內(nèi)科治療用藥物及飲食治療

1、禁其所忌酶缺乏不能對(duì)底物進(jìn)行正常代謝的遺傳病。

2、去其所余酶缺乏使體內(nèi)貯存過多的“毒物”所致的遺傳病

促排泄劑或螯合劑、換血或血漿過濾等

3、補(bǔ)其不足由于基因缺陷使體內(nèi)缺乏某種酶和蛋白質(zhì)而導(dǎo)致功能喪失的遺傳病。第九頁，共四十五頁，2022年，8月28日第十頁，共四十五頁，2022年，8月28日第十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日ACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAAACGTCGGTGCGTCGCTTTGCAGCCACGCAGCGAACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAA突變基因原位修復(fù)突變修復(fù)第十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日帶異?；虻娜旧wDNA分子帶正?；虻耐庠赐雌瓮粗亟M過程第十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日添加正?；虻谑捻摚菜氖屙?，2022年，8月28日使γ重新表達(dá)，形成HbF,HbF代償HbA的功能。第十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日目的基因的制備方法1、從基因組中分離2、化學(xué)合成3、用mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA4、從基因文庫中篩選5、PCR合成第十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日受體細(xì)胞的選擇

選擇受體細(xì)胞的原則：

1、易于從人體分離又便于輸回體內(nèi)2、易于接受外源的遺傳物質(zhì)3、能夠分裂，生命周期長4、患病的器官或部位。常用的受體細(xì)胞：骨髓干細(xì)胞皮膚纖緯細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞肝細(xì)胞淋巴細(xì)胞第十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日治療基因的轉(zhuǎn)移方法3、腺相關(guān)病毒(Adeno-AssociatedVirus,AAV)4、單皰疹病毒(Herpessimplexviruses,HSV)化學(xué)法磷酸鈣共沉淀物理法微粒轟擊、電穿孔法、顯微注射脂質(zhì)體法生物法將病毒（virus)改造成缺陷病毒載體1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（

Retroviruses)2、腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（Adenoviruses）第十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日脂質(zhì)體法優(yōu)點(diǎn)：易大量制備無致病性細(xì)胞類型多治療過程可控缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率不高血循中快速清除(肝巨噬細(xì)胞)第十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日第二十頁，共四十五頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄病毒的改造第二十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞過程第二十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1、能高效率的感染宿主細(xì)胞（100%）2、其宿主范圍廣泛，包括來自不同種的生物和細(xì)胞類型3、被整合的基因在宿主基因組中穩(wěn)定表達(dá)4、用復(fù)制缺陷的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，毒性小缺點(diǎn)：1、只能感染分裂細(xì)胞2、其外源DNA的容量太小3、安全性問題（激活癌基因的潛在性）第二十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日腺病毒感染細(xì)胞的過程第二十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1、具有較廣的宿主范圍，能感染除造血細(xì)胞以外的幾乎所有細(xì)胞2、可以感染分裂及非分裂細(xì)胞3、能高效地感染宿主細(xì)胞4、外源基因容量大5、安全性較高（不引起癌基因激活）缺點(diǎn)：1、技術(shù)上需進(jìn)一步改進(jìn)2、不整合到人類基因組腺病毒是基因治療載體的發(fā)展方向。第二十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日1、野生型的AAV為非病原性，其安全性高2、AAV病毒顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定3、應(yīng)用宿主范圍較廣，使用于分裂及非分裂細(xì)胞4、可整合入宿主染色體上，可長期表達(dá)目的蛋白腺相關(guān)病毒載體優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：重組AAV的制作較為繁雜、效率低，滴度低第二十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日單皰疹病毒載體優(yōu)點(diǎn)

具有對(duì)神經(jīng)元的特異的親和力可插入的基因片段容量很大，可達(dá)40-50kb缺點(diǎn)

對(duì)細(xì)胞有較大的毒性第二十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日反義技術(shù)

反義技術(shù)（antisensetechnology)也稱反義寡核苷酸,是指利用人工合成的反義RNA或反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，控制細(xì)胞生長的中間階段，使基因不能轉(zhuǎn)錄或翻譯，因而不能合成蛋白質(zhì)，以達(dá)到治療某中疾病的目的。(1)將cDNA導(dǎo)入基因組中，轉(zhuǎn)錄得反義RNA(2)直接輸入反義寡核苷酸二、反義基因技術(shù)（阻斷轉(zhuǎn)錄）類型：1、反義RNA技術(shù)（阻斷翻譯）第二十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日

第二十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日

第三十頁，共四十五頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄阻斷反基因技術(shù)示意圖第三十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日第三十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日正常細(xì)胞(無細(xì)胞毒性)胞嘧啶脫氨酶基因erbB-2啟動(dòng)子5-FC5-FC5-FU

(細(xì)胞毒性)腫瘤細(xì)胞腫瘤特異性高表達(dá)因子藥物靶向治療腫瘤細(xì)胞死亡第三十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日RNA干擾（RNAinterferenceRNAi)

2003年10大科學(xué)進(jìn)展--第四(Science)正常生物體內(nèi)一些小的雙鏈RNA可以抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的小雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)時(shí)，可以通過促使該mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。這些小的雙鏈RNA稱為siRNA(Small/shortinterferingRNA，siRNA)。第三十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日RISC:RNA-inducedsilencingcomplexRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物第三十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日RNAiingenetherapy第三十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日基因治療的現(xiàn)狀-1第三十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日基因治療的現(xiàn)狀-2第三十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日基因治療的現(xiàn)狀-3第三十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日基因治療的現(xiàn)狀-4第四十頁，共四十五頁，2022年，8月28日基因治療的現(xiàn)狀-5第四十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日基因治療的現(xiàn)狀-6第四十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日HemophiliaB,FIXfunctionreduced,X-linkedMalestobleedaftercircumcision第一例臨床實(shí)驗(yàn)——中國上海1995-1996年載體——AAV自體皮膚成纖維細(xì)胞兩名血友病B患者(兄弟),先后治療了四名患者FIX水平升高2倍并持續(xù)了1年以上2003年獲得國家批準(zhǔn)進(jìn)行中國首次AAV基因治療血友病B臨床試驗(yàn)中國的基因治療第四十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日AAVbasedgenetherapyforhemophiliaB1.ViralgenesareremovedfromAAV2.AgeneforbloodclottingproteinFactorIXisplacedinsidetheemptyAAV3.TheFactorI