新型重組類人膠原蛋白醫(yī)學(xué)及其應(yīng)用

新型重組類人膠原蛋白及其應(yīng)用┃Human-likeCollagen類人膠原蛋白膠原蛋白傳統(tǒng)提取方法的問題國內(nèi)外重組膠原蛋白概況類人膠原蛋白研發(fā)背景膠原蛋白傳統(tǒng)提取方式和面臨的問題[1]He|ckeT．Gelatin，Thefoodtechnologist’sfriendorfoe．InternationalFoodIngredients．2000．1，6-8．病毒隱患動物源疾病(如瘟疫、禽流感等)或人體傳染病(如病毒性肝炎和艾滋病等)病毒的傳染危險[2]排異反應(yīng)異種或異體排斥反應(yīng),導(dǎo)致植入部位無菌性炎癥以及細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)改變細(xì)胞毒性不溶于水，加工過程中所用的酸、堿、鹽溶劑很難脫除完全,產(chǎn)生細(xì)胞毒性，并降低細(xì)胞粘附性制備方法：○酸水解法○堿水解法○酶解法原料來源：豬/牛/驢/魚等動物的結(jié)締組織123類人膠原蛋白研發(fā)背景FDA、歐盟對

動物源膠原蛋白醫(yī)學(xué)應(yīng)用的限制[2][3][4]Cooperman,L.andMichaeli,D.,1984,Theimmunogenicityofinjectablecollagen.I.A1-yearprospectivestudy.JAmAcadDermatol,10:638-646.

Lee,C.H.,Singla,A.andLee,Y.,2001,Biomedicalapplicationsofcollagen.IntJPharm,221:1-22.Olsen,D.,Yang,C.L.,Bodo,M.,Chang,R.,Leigh,S.,Baez,J.,Carmichael,D.,Per?l?,M.,H?m?l?inen,E.R.,Jarvinen,M.andPolarek,J.,2003,Recombinantcollagenandgelatinfordrugdelivery.AdvDrugDelivRev,55:1547-1567.尋找一種安全、有效并具有良好生物功效的膠原蛋白類材料在組織工程、醫(yī)藥美容等領(lǐng)域受到越來越廣泛的關(guān)注國外重組膠原蛋白的研究現(xiàn)狀2000年MyllyharjuJ等人使用甲基酵母表達(dá)生產(chǎn)準(zhǔn)人纖維膠原蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型[5]1998年NokelainenM等用兩種桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)類人特異性軟骨膠原II型[6]2001年NokelainenM等使用四種人類基因報道了使用甲基酵母高水平表達(dá)I型前膠原[7]UittoJ等從人皮膚細(xì)胞體外培養(yǎng)中得到了Ⅰ，Ⅲ型前膠原[8]VaughnPR等在啤酒酵母中表達(dá)出了攜帶有羥基化片斷的類人Ⅲ型膠原蛋白[9]由于哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)成本高,周期長,重組膠原蛋白表達(dá)量極低(1%左右)，培養(yǎng)只能限于實(shí)驗(yàn)規(guī)模,不可能滿足產(chǎn)業(yè)化、大批量的需求[5]MyllyharjuJ，NokelainenM，Vuorela人KividkkoKI．ExpressionofrecombinanthumantypeI-IIIcollagensintheyeastpichiapastoris．BiochemSocTrans．2000．28(4)，353-7．[6]NokelainenM，TuH，Vuorela^NotbohmH，KivirikkoKI,MyllyharjuJ．High-levelproductionofhumantypeIcollagenintheyeastPichiapastoris．Yeast．2001J蚰30．18(9)．797-806．[7]NokelainenM，HelaakoskiT，MyllyharjuJ，NotbohmH，PihlajaniemiT'FietzekPP，KivirikkoKI．ExpressionandcharacterizationofrecombinanthumantypeIIcollagenswithlowandhighcontentsofhydroxylysineanditsglycosylatedforms．MatrixBi01．1998Jan．16(6)，329-38．[8]UittoJ，BoothBPolakKL．CollagenbiosynthesisbyhumanskinfibroblastsIIIsolationandfurthercharacterizationoftypeIandtypeIIIprocoUagenssynthesizedinculture．BiochimBiophysActa．1980Aug21．624(2)，545—61．[9]VaughnPR，GalanisM，RichardsKM，TebbTA，RamshawJA，WerkmeisterJA．Productionofrecombinanthydroxylatedhumantype1IIcollagenfragmentinSaccharomycescerevisiae．DNACellBi01．1998Jun．17(6)，511—8．中國巨子生物率先實(shí)現(xiàn)重組膠原蛋白規(guī)模化生產(chǎn)的突破在中國,西北大學(xué)的范代娣等[10,11]采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，得到數(shù)段人膠原蛋白基因段，接著進(jìn)行拼接重復(fù),轉(zhuǎn)化E.coli(大腸桿菌)，并通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)人源性膠原白，所得重組膠原蛋白表達(dá)量高達(dá)29.4%[12][10]AdaehiT.,etal.GenerationofhybridtransgenicsilkwormsthatexpressBombyxmoriProlyl-hy-droxylasea-subunitsandhumancollagensinposteriorsilkglands:Productionofcocoonsthatcontainedcollagenswithhy-droxylatedpralineresidues[J].JournalofBiotechnology2006,126(2):205~219[11]駱艷娥,范代娣,花秀夫,張兮.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白的過程研究.西北大學(xué)學(xué)報2005,35(2):180~183[12]膠原蛋白與重組膠原蛋白的研究進(jìn)展陳光徐珍珍吳銘明膠科學(xué)與技術(shù)第31卷第1期2011年3月Vol.31.No.1Mar.2011.科技部對類人膠原蛋白的評價世界首創(chuàng)全球唯一國際領(lǐng)先類人膠原蛋白的來源和制備類人膠原蛋白的創(chuàng)新性類人膠原蛋白的實(shí)驗(yàn)研究類人膠原蛋白介紹質(zhì)粒載體人膠原蛋白基因構(gòu)建原始菌(不具膠原合成能力)重組菌(膠原蛋白生產(chǎn)菌)基因工程菌的構(gòu)建反饋補(bǔ)料壓力脈沖饑餓脅迫定向調(diào)控高密度發(fā)酵離心除雜除雜蛋白除內(nèi)毒素類人膠原蛋白蛋白質(zhì)分離純化類人膠原蛋白的來源和制備類人膠原蛋白的基本生物學(xué)功能通過基因重組和生物工程技術(shù)得到的，一種水溶性高分子生物膠原蛋白在結(jié)構(gòu)、特性方面與人類膠原蛋白極為相似，命名它為類人膠原蛋白具備膠原蛋白基本生物學(xué)功能：生物相容性生物吸收性細(xì)胞粘附性促新細(xì)胞形成ECM示意圖類人膠膠原蛋蛋白的創(chuàng)新新性無細(xì)胞毒性基因工程單細(xì)胞蛋白從根本上杜絕隱患保證醫(yī)學(xué)應(yīng)用安全低排異反應(yīng)無病毒隱患來源于人類基因結(jié)構(gòu)最大程度相似修飾過程去除端肽溶于水沒有酸堿溶劑殘留避免影響細(xì)胞代謝類人膠膠原蛋蛋白的創(chuàng)新新性單螺旋線性結(jié)構(gòu)pH值6.5-7.5保持皮膚酸堿平衡維持細(xì)胞粘附性變性溫度高酸堿度中性變性溫度72℃動物膠原37℃-40℃易于儲運(yùn)保存使用分子量90kD利于皮膚滲透利用均質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強(qiáng)類人膠膠原蛋蛋白的安全全性評評價實(shí)實(shí)驗(yàn)安全全身毒性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)皮膚刺激實(shí)驗(yàn)眼部刺激實(shí)驗(yàn)皮膚過敏實(shí)驗(yàn)亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)皮下植入實(shí)驗(yàn)由“中中國食食品藥藥品檢檢定研研究院院”完完成的生物學(xué)學(xué)評價價試驗(yàn)驗(yàn)植入實(shí)實(shí)驗(yàn)評評價:小鼠、、家兔兔皮下下植入入，90天無不不良反反應(yīng)類人膠膠原蛋蛋白透皮與與吸收收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)小白鼠鼠背部部去毛毛清潔潔后，，涂抹抹熒光光染料料(tritc)標(biāo)記過過的明明膠和和類人膠膠原蛋蛋白溶液；；于4h，8h分別在在涂抹抹試樣樣區(qū)域域取1cm×2cm大小的的皮膚膚，進(jìn)進(jìn)行冰冰凍切切片，，采用用熒光光顯微微鏡觀觀察；；結(jié)果表表明：：類人人膠原原蛋白白具有有較強(qiáng)強(qiáng)的透透皮吸吸收行行為，，而明明膠的的透皮皮吸收收較差差。[14][14]TheTransdermalAbsorptionStudyofHuman-LikeCollagen.AdvancedMaterialsResearch,415-417:1781-1985明膠涂抹8h后明膠涂抹4h后類人涂抹8h后類人涂抹4h后皮下真皮表皮皮下真皮表皮類人膠膠原蛋蛋白促細(xì)胞胞生長長實(shí)驗(yàn)驗(yàn)[15]程寧,范代娣

類人膠原蛋白對BHK-21細(xì)胞生長的影響，西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，35(5):581-584,20050.1%類人膠原蛋白可促進(jìn)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的生長，其作用明顯優(yōu)于0.1%的維生素C和0.1%的明膠，其促進(jìn)細(xì)胞生長的速度，是對照組的1.4-1.6倍。類人膠膠原蛋蛋白促細(xì)胞胞生長長實(shí)驗(yàn)驗(yàn)[15]程寧,范代娣娣類人膠膠原蛋蛋白對對BHK-21細(xì)胞生生長的的影響響，西西北大大學(xué)學(xué)學(xué)報(自然科科學(xué)版版)，35(5):581-584,2005結(jié)果顯示：應(yīng)用類人膠原蛋白溶液培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量有大幅度增加，細(xì)胞形態(tài)正常、透亮飽滿。類人膠膠原蛋蛋白細(xì)胞親親和性性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果顯顯示：：14天時成成纖維維細(xì)胞胞大量量貼附附在類類人膠膠原蛋蛋白海海綿表表面，，且生生長良良好。。反映映了類類人膠膠原蛋蛋白具具有良良好的的細(xì)胞胞親和和性和和相容容性。。類人膠膠原蛋蛋白海海綿表表面2BS培養(yǎng)14天后掃掃描電電鏡觀觀察[15]程寧,范代娣娣類人膠膠原蛋蛋白對對BHK-21細(xì)胞生生長的的影響響，西西北大大學(xué)學(xué)學(xué)報(自然科科學(xué)版版)，35(5):581-584,2005類人膠膠原蛋蛋白組織相相容性性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)試驗(yàn)方方法：：將類人膠膠原蛋蛋白海海綿、動物物膠原原蛋白白海綿綿和可可吸收收明膠膠海綿綿分別別植入入兔子子肝臟臟，4周后開開腹觀觀察植植入處處的肝肝組織織。[16]類人膠膠原蛋蛋白生生物相相容性性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)研究究《西北大大學(xué)學(xué)學(xué)報（（自然然科學(xué)學(xué)版））》2004年2月第32卷第1期作作者：：西北北大學(xué)學(xué)范范代娣娣，米米鈺，，惠俊俊峰等等類人膠原蛋白細(xì)胞核形態(tài)正常明膠海綿細(xì)胞核皺縮動物膠原海綿細(xì)胞核皺縮變形類人膠膠原蛋蛋白組織相相容性性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果表表明：：明膠海海綿和和動物物膠原原蛋白白海綿綿植入處處造成成細(xì)胞胞形態(tài)態(tài)和數(shù)數(shù)量改改變，，組織織腫脹，，大量量炎性細(xì)胞胞浸潤潤類人膠膠原蛋蛋白海海綿對植入入處肝肝細(xì)胞胞形態(tài)態(tài)幾乎乎不造造成影影響，，細(xì)胞胞器的的形態(tài)態(tài)較好好；組組織相相容性性好，，優(yōu)于于供試試的其其他產(chǎn)產(chǎn)品類人膠原蛋白植入處組織形態(tài)正常少量炎性細(xì)胞浸潤明膠海綿植入處大量炎性細(xì)胞浸潤組織增生，細(xì)胞腫脹動物膠原海綿植入處大量炎性細(xì)胞浸潤組織增生，細(xì)胞腫脹[16]類人膠膠原蛋蛋白生生物相相容性性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)研究究《西北大大學(xué)學(xué)學(xué)報（（自然然科學(xué)學(xué)版））》2004年2月第32卷第1期作作者：：西北北大學(xué)學(xué)范范代娣娣，米米鈺，，惠俊俊峰等等皮膚美美容止血材材料骨修復(fù)復(fù)材料料人工血血管皮下注注射填填充類人膠膠原蛋蛋白的的應(yīng)用用類人膠膠原蛋蛋白在皮膚膚美容容領(lǐng)域的應(yīng)用皮膚美容:眼膜、面膜膜、噴霧、、原液等系系列；用于于衰老性肌肌膚緊致抗抗衰；日常常的肌膚養(yǎng)養(yǎng)護(hù)；皮炎炎、痤瘡、、敏感肌膚膚等問題肌肌膚的修護(hù)護(hù)。生產(chǎn)環(huán)境為萬級條件下的局部百級，等同于手術(shù)室的潔凈要求親和層析+凝膠過濾層析+超濾

的純化工藝，可滿足體內(nèi)植入的要求所采用的為注射用水，無菌、無內(nèi)毒素真正不含防防腐劑類人膠原蛋蛋白在皮膚美容容領(lǐng)域的應(yīng)用類人膠原蛋蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究究可降解止血海綿:主要用于腔腔內(nèi)、顱內(nèi)內(nèi)的外科手手術(shù)止血可吸收明膠海綿動物膠原蛋白海綿進(jìn)口可吸收紗布類人膠原蛋白止血海綿可降解止血海綿:主要用于腔腔內(nèi)、顱內(nèi)內(nèi)的外科手手術(shù)止血馬茂，范代娣

殼聚糖-類人膠原蛋白對兔肝創(chuàng)面的止血效果及組織相容性觀察，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28(12):1122-1124專利成果：一種可生物物降解止血血海綿材料料及其制備備方法。專專利號：ZL200610041913.3一種規(guī)模制制備類人膠膠原蛋白止止血海綿的的方法。申申請?zhí)枺?00910218514.3類人膠原蛋蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究究骨修復(fù)材料料:仿生礦化，，制備骨修修復(fù)材料，，用于骨缺缺損的修復(fù)復(fù)類人膠原蛋蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究究類人膠原蛋蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究究人工血管：模擬人體血血管結(jié)構(gòu)，，仿生制備備，用于血血管修復(fù)類人膠原蛋蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究究注射填充水凝膠應(yīng)用領(lǐng)域采用皮下注注射或填充充，可用于于去皺、豐豐唇、面部部矯形、凹凹陷填充等等。產(chǎn)品特點(diǎn)生物相容性性優(yōu)異；降解時間可可控；產(chǎn)品可促進(jìn)進(jìn)注射部位位細(xì)胞活性性和膠原蛋蛋白纖維的的再生研發(fā)團(tuán)隊(duì)研發(fā)成果產(chǎn)業(yè)化之路路類人膠原蛋蛋白的科研研和產(chǎn)業(yè)化化類人膠原蛋白的研發(fā)團(tuán)隊(duì)隊(duì)范代娣：新世紀(jì)“百百千萬人才才工程”國國家人選獲“中國青青年女科學(xué)學(xué)家”提名名享受“國務(wù)務(wù)院特殊津津貼”博士生導(dǎo)師師研發(fā)團(tuán)隊(duì)：：博士研究生生20余人碩士研究生生50余人類人膠原蛋蛋白的專業(yè)水準(zhǔn)準(zhǔn)XiaoxuanMa,DaidiFan,Long-anShang,QiangCai,LeiChi,ChenhuiZhu,YuMi,Yan-eLuo.Oxygentransferratecontrolintheproductionofhuman-likecollagenbyrecombinantEscherichiacoil.BiotechnologyandBiochemistry.2010,55,4：169-174(SCI)WenjiaoXue,DaidiFan,LonganShang.Effectsofaceticacidanditsassimilationinfed-batchculturesofrecombinantEscherichiacolicontaininghuman-likecollagencDNA.JournalofBioscienceandBioengineering.2010.109（3）：257-261(SCI)Xiao-JunWang,Dai-DiFan,Yan-ELuo.BreakthroughModelofRecombinantHuman-LikecollageninImmobilizedMetalAffinityChromatography.AppliedBiochemistryandBiotechnology,2009,158(2),262-276.(SCI)WenJXue,DaiDFan,LonganShang,ChenHZhu,XiaoXMa,YuanYYu.Productionofbiomassandrecombinanthuman-likecollageninEscherichiacoliprocesseswithdifferentCO2pulses.BiotechnologyLetters.2009,31:221-226.(SCI)DaiD.Fan，L.-H.Wang，L.-A.Shangetal.AMicrocalorimetricMethodforStudyingtheBiologicalEffectsofMg2+IononRecombinantEscherichiacoli.ChemicalBiochemicalEngineering,2008,22(3):363-368.(SCI)DAIDFAN,LIHWANG,LONGASHANG,HUIJSHI,XIAOXMA,YUMI,LIFGU,KANGZXU.AmicrocalorimetricmethodtostudytheeffectofkanamycinonthemetabolismofrecombinantEscherichiacoliChemicalEngineeringCommunications,2007，194:1127-1137.(SCI)YanELuo,DaiDFan,LongAShang,HuiJShi,XiaoXMa,YuMi,GuiFZhao.AnalysisofmetabolicfluxinEscherichiacoliexpressinghuman-likecollageninfed-batchculture,Biotechnologyletters,30(4):637-643,2008.(SCI,EI)DaiDFan,YaneLuo,YuMi,XiaoXMa,LonganShang.Characteristicsoffed-batchculturesofrecombinantEscherichiacolicontaininghuman-likecollagencDNAatdifferentspecificgrowthrates.BiotechnologyLetters,2005,27:865–870.(SCI,EI)LUOYane,FANDaidi,MAXiaoxuan,WANGDewei,MIYu,HUAXiufuandLIWenhong.ProcessControlforProductionofHuman-likeCollageninFed-batchCultureofEscherichiacoliBL21.ChineseJ.Chem.Eng.,2005,13(2):276-279.(SCI,EI)HUAXiufu,FANDaidi,LUOYane,HANGXI,SHIHuijuan,MIYu,MAXiaoxuan,SHANGLong'an,ZHAOGuifang.KineticsofHighCellDensityFed-batchCultureofRecombinantEscherichiacoliProducingHuman-likeCollagen.ChineseJ.Chem.Eng.,2006,14(2):242-247.(SCI,EI)……60余篇SCI文獻(xiàn)報道類人膠原蛋蛋白的專業(yè)水準(zhǔn)準(zhǔn)國家自然科科學(xué)基金：：工程控制制策略有效效解除大腸腸桿菌培養(yǎng)養(yǎng)過程中乙乙酸抑制機(jī)機(jī)理探索（（21076169）國家自然科科學(xué)基金：：周期性饑饑餓協(xié)迫對對重組大腸腸桿菌高密密度培養(yǎng)的的影響（31000019）國家自然科科學(xué)基金：：重組類人人膠原蛋白白大腸桿菌菌表達(dá)體系系高密度發(fā)發(fā)酵的代謝謝調(diào)控及動動力學(xué)（20606026）國家自然科科學(xué)基金：：重組E.coli類人膠原蛋蛋白表達(dá)體體系多聚體體現(xiàn)象研究究(20476085)國家高技術(shù)術(shù)產(chǎn)業(yè)化示示范工程發(fā)發(fā)展計(jì)劃：：基因工程程技術(shù)生產(chǎn)產(chǎn)類人膠原原蛋白生物物材料高技技術(shù)產(chǎn)業(yè)化化示范工程程[發(fā)改高計(jì)(2004)2563]國家科技部部863計(jì)劃：重組組類人膠原原蛋白Ⅱ可降解材料料制造關(guān)鍵鍵技術(shù)及應(yīng)應(yīng)用(2006AA02Z246)國家科技部部創(chuàng)新基金金：重組基基因工程菌菌生產(chǎn)類膠膠原蛋白(01C26216110599)國家火炬計(jì)計(jì)劃：類人人膠原蛋白白(2002EB021307）利用重組類類人膠原礦礦化仿生制制備骨修復(fù)復(fù)材料及應(yīng)應(yīng)用(2007AA03Z456)類人膠原蛋蛋白人工血血管體外構(gòu)構(gòu)建過程的的工程學(xué)（（20776119）新型有機(jī)無無機(jī)雜化納納米生物功功能材料復(fù)復(fù)合制備及及控制機(jī)理理（21006079）……13項(xiàng)國家級科研項(xiàng)目類人膠原蛋蛋白的專業(yè)水準(zhǔn)準(zhǔn)一種類人膠膠原蛋白及及其生產(chǎn)方方法。專利利號：ZL01106757.8膠原蛋白敷