第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件

第二章蘭州大學(xué)基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)第二章蘭州大學(xué)基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)1第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件2第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件3

內(nèi)切酶，即在核酸分子內(nèi)部制造切口的酶形成5`-P和3`-OH末端2性質(zhì)3功能

自我保護(hù)作用細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）內(nèi)切酶，即在核酸分子內(nèi)部制造切口的酶2性質(zhì)4a限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA分子進(jìn)行分解，切成小片段AABBBBBa限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)5b修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割b修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲6c限制修飾系統(tǒng)分子機(jī)理由三個(gè)連續(xù)基因位點(diǎn)所控制：hsdR,hsdM,

hsdS

hsdR---限制性內(nèi)切酶:能識(shí)別DNA分子上的特定位點(diǎn)并將雙鏈DNA切斷hsdM---限制性甲基化酶:催化DNA分子特定位點(diǎn)上的堿基甲基化反應(yīng)hsdS---控制兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá):協(xié)助上述兩種酶識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)c限制修飾系統(tǒng)分子機(jī)理由三個(gè)連續(xù)基因位點(diǎn)所控制：7宿主細(xì)胞內(nèi)的甲基化酶將自身DNA和噬菌體DNA實(shí)施特異性保護(hù)，封閉了自身限制性酶的識(shí)別位點(diǎn)這種限制不完全，總有少數(shù)入侵DNA會(huì)存活，得以在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并被宿主的甲基化酶修飾，但同時(shí)，也喪失了原宿主甲基化酶標(biāo)記宿主細(xì)胞內(nèi)的甲基化酶將自身DNA和噬菌體DNA實(shí)施特異性保護(hù)8d意義寄主控制的限制與修飾是一種廣泛的過程，廣泛存在于原核細(xì)菌中。有兩方面作用：保護(hù)自身DNA不受限制破壞外源DNA，使之迅速降解d意義寄主控制的限制與修飾是一種廣泛的過程，廣泛存在于原核9二限制性內(nèi)切酶的命名命名：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：酶編碼基因所在質(zhì)粒；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)二限制性內(nèi)切酶的命名命名：10三限制性內(nèi)切酶類型目前鑒定出3種不同的限制性內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶II型限制性內(nèi)切酶Ⅲ型限制性內(nèi)切酶三限制性內(nèi)切酶類型目前鑒定出3種不同的限制性內(nèi)切酶I型限11限制性內(nèi)切酶的類型及其主要特性

限制性內(nèi)切酶的類型及其主要特性12II型限制性內(nèi)切酶的基本特性1970年，由H.O.smith和K.W.wilcox從流感嗜血菌中分離得到

如HindII（1）識(shí)別位點(diǎn)未甲基化修飾的特異靶序列，多數(shù)呈中心對稱的回文結(jié)構(gòu)，由4-8個(gè)堿基組成，有些識(shí)別位點(diǎn)是連續(xù)的，有些則是間斷的，如GANTCII型限制性內(nèi)切酶的基本特性1970年，由H.O.sm13（2）切割位點(diǎn)絕大多數(shù)II類酶在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)切割DNA（2）切割位點(diǎn)絕大多數(shù)II類酶在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)切割DNA14粘性末端（cohensiveend）連接便利粘性末端（cohensiveend）連接便利15第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件16

DNA分子末端標(biāo)記平末端補(bǔ)齊DNA分子末端標(biāo)記平末端補(bǔ)齊17一把特殊的剪刀

—限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)一把特殊的剪刀

—限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、18

同裂酶(isoschizomers)：來源不同，識(shí)別的是同樣的核苷酸靶序列同裂酶(isoschizomers)：來源不同，識(shí)別的19第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件20同尾酶(isocaudamer)

：來源不同，識(shí)別的靶序列也各不相同,但都能產(chǎn)生相同的粘性末端由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來的，在基因克隆實(shí)驗(yàn)中很有用處同尾酶(isocaudamer)：來源不同，識(shí)別的靶序列也21由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，稱之為“雜種位點(diǎn)”(hybridsite)。但這類雜種位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，一般不再被原來的任何一種同尾酶所識(shí)別由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，稱之為“雜22影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1、DNA的純度2、DNA的甲基化程度3、酶切反應(yīng)的溫度4、DNA的分子結(jié)構(gòu)5、核酸限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1、DNA的純度23DNA的純度DNA的純度24第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件25DNA的甲基化程度原核生物限制—修飾體系，對識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化，會(huì)強(qiáng)烈影響酶活性。在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌，在選用酶時(shí)應(yīng)注意：所選用的限制酶對甲基化的敏感性依DNA的不同來源選擇不同的限制酶DNA的甲基化程度原核生物限制—修飾體系，對識(shí)別序列中特定核26反應(yīng)溫度大多數(shù)的核酸限制內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度為37℃，但也有許多例外，如SmaI為25℃，ApaI為30℃，TaqI為65℃消化反應(yīng)溫度高于或低于最適反應(yīng)溫度，都會(huì)影響酶的活性每ugDNA用1-5U酶切1-2h反應(yīng)溫度大多數(shù)的核酸限制內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度為37℃，但27DNA的分子結(jié)構(gòu)某些核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需的酶量比消化線性DNA高出20倍一些核酸內(nèi)切酶，切割處于不同位置的限制位點(diǎn)，其效率有明顯的差異，可能是由于側(cè)翼序列的核苷酸成分的差異造成的有些特定的限制位點(diǎn)，只有當(dāng)其它的限制位點(diǎn)被廣泛切割時(shí)，才能被有關(guān)的核酸限制性內(nèi)切酶消化少數(shù)酶，如SacII對不同部位的限制位點(diǎn)的切割活性會(huì)有很大的差異，其中有些位點(diǎn)很難被切割DNA的分子結(jié)構(gòu)某些核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒D28核酸限制性內(nèi)切酶的緩沖液核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組分：MgCl2、NaCl/KCl、Tris-HCl、巰基乙醇或DTT以及BSA等NaCl或Mg2＋濃度：降低酶的活性，導(dǎo)致識(shí)別序列特異性改變Tris-HCl:穩(wěn)定反應(yīng)液的pH在酶的最佳pH范圍內(nèi)巰基試劑：保持酶的穩(wěn)定性，避免失活Na、K離子：對部分酶反應(yīng)敏感，部分酶則適應(yīng)較廣的離子強(qiáng)度的變化幅度核酸限制性內(nèi)切酶的緩沖液核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組分：29酶解反應(yīng)中的星號(hào)活性星號(hào)活性（staractivity）當(dāng)酶反應(yīng)體系發(fā)生改變時(shí)，酶的性能甚至酶切位點(diǎn)發(fā)生改變的現(xiàn)象酶解反應(yīng)中的星號(hào)活性星號(hào)活性（staractivity）當(dāng)30如EcoRI等,在正常條件下，切割5`GAATTC3`，但在甘油濃度>5%時(shí),也可切割5`PnPnATPyPy3`或者5`AATT3`如EcoRI等,在正常條件下，切割5`GAATTC3`，但在31限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止

終止后直接電泳檢測酶切結(jié)果限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止終止后直接電泳檢測酶切結(jié)果32第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件33完全消化和部分消化完全消化和部分消化34完全消化完全消化35部分消化部分消化36雙酶切的方法①

先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性最高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl等金屬離子及第二種酶，繼續(xù)溫育②

使用適合于大多數(shù)限制酶的單種緩沖液--谷氨酸鉀緩沖液(KGB)，可使各種限制酶的活性達(dá)到較高雙酶切的方法37使用限制酶的注意事項(xiàng)

使用限制酶的注意事項(xiàng)38第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件39第二節(jié)甲基化酶特征：與限制性內(nèi)切酶相對應(yīng)，識(shí)別位點(diǎn)相同1.大腸桿菌中的甲基化酶（1）Dam（腺嘌呤甲基化酶）:此酶可在5`GATC3`序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，這樣可使一些識(shí)別順序中含有5`GATC3`的限制性內(nèi)切酶不能切割

如BclI（TGATCA）（2）Dcm（胞嘧啶甲基化酶）:

此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影響的限制性內(nèi)切酶是EcoRII第二節(jié)甲基化酶特征：與限制性內(nèi)切酶相對應(yīng)，識(shí)別位點(diǎn)相同402.甲基化酶的用途就許多II類限制性內(nèi)切酶而言，都相應(yīng)存在著相對的甲基化酶，它們可修飾限制酶識(shí)別順序中的第三位腺嘌呤上，從而使其免受切割甲基化酶的用途是在必要時(shí)可以封閉某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),同時(shí)又可能產(chǎn)生新的酶位點(diǎn)

2.甲基化酶的用途41

如兩個(gè)串聯(lián)的TaqI識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)M．TaqI甲基化封閉后，出現(xiàn)了一個(gè)依賴于甲基化的限制性核酸內(nèi)切酶DpnI的切割位點(diǎn)(下圖)如兩個(gè)串聯(lián)的TaqI識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)M．TaqI甲基化42第三節(jié)連接酶

廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其催化DNA雙鏈上相鄰的3`-OH和5`-P共價(jià)結(jié)合形成3`-5`磷酸二酯鍵DNA連接酶：大腸桿菌染色體DNA編碼,NAD+為能源輔助因子T4DNA連接酶:T4噬菌體DNA編碼,ATP為能源輔助因子,能進(jìn)行平末端DNA片段的連接連接溫度：通常37℃，但這時(shí)粘末端之間的氫鍵不穩(wěn)定，所以溫度應(yīng)界于酶連接速率和末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為4～15℃較合適第三節(jié)連接酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其催43一DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

1967年，世界多個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)催化DNA雙鏈上相鄰的3`-OH和5`-P共價(jià)結(jié)合形成3`-5`磷酸二酯鍵的酶一DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)1967年，世界多個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)催化D44二、特點(diǎn)二、特點(diǎn)452連接條件2連接條件463DNA連接酶連接反應(yīng)條件3DNA連接酶連接反應(yīng)條件47三、連接反應(yīng)機(jī)理三、連接反應(yīng)機(jī)理48第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件49第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件50四、連接反應(yīng)溫度四、連接反應(yīng)溫度51五、影響因素五、影響因素52第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件53六、反應(yīng)體系六、反應(yīng)體系54七、連接操作七、連接操作55第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件56八、體外連接DNA片段的幾種方法（1）直接用T4DNA連接酶連接（2）同聚物加尾，先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再

用DNA連接酶進(jìn)行連接（3）銜接物用銜接物連接平末端DNA分子（4）DNA接頭連接法八、體外連接DNA片段的幾種方法（1）直接用T4DNA連接酶57平頭末端（bluntend）在識(shí)別位點(diǎn)的對稱軸上同時(shí)切割，如EcoRⅤ平頭末端特點(diǎn)1、平末端和粘性末端連接方法平頭末端（bluntend）平頭末端特點(diǎn)1、平末端和58第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件592、同聚物加尾法2、同聚物加尾法60

3、銜接物法

銜接物(1inker)，化學(xué)方法合成的一段由10-12個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段

3、銜接物法銜接物(1inker)，化學(xué)方法合614、DNA接頭法4、DNA接頭法62第四節(jié)DNA聚合酶常用的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow大片段T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶特點(diǎn)：脫氧核糖核苷酸連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的3，-OH末端，催化核苷酸的聚合。其中，T7DNA聚合酶的聚合能力最強(qiáng)第四節(jié)DNA聚合酶常用的DNA聚合酶：631、DNA聚合酶I反應(yīng)條件1、DNA聚合酶I反應(yīng)條件64用途－

DNA雜交探針的制備

用途－DNA雜交探針的制備65第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件66缺口轉(zhuǎn)移

(nicktranslation)缺口轉(zhuǎn)移

(nicktranslation)672、Klenow酶2、Klenow酶68用途用途69第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件70第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件713、T4DNA聚合酶3、T4DNA聚合酶72第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件73第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件74T4DNA聚合酶用途T4DNA聚合酶用途75第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件764、逆轉(zhuǎn)錄酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶77第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件78第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件79第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件80TaqDNA聚合酶1.特點(diǎn)：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性TaqDNA聚合酶1.特點(diǎn)：812.用途DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個(gè)DNA分子因而可被擴(kuò)增4×106倍

DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，包括以下三個(gè)步驟：

DNA模板變性(95℃)→與DNA引物退火(45℃)→引物延伸(72℃)

2.用途82TaqPol和PCR

5’3’變性

3’5’

5’3’引物

3’5’復(fù)性

5’3’5’3’

3’5’引物

3’5’5’3’延伸

5’3’3’5’

3’5’

TaqPol和PCR5’83第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件84第五節(jié)核酸修飾酶第五節(jié)核酸修飾酶85第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件86第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件87第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件88第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件89第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件90第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件91第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件92第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件93第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件94第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件95第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件96第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件97第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件98第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件99第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件100第六節(jié)單鏈DNA內(nèi)切酶第六節(jié)單鏈DNA內(nèi)切酶101第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件102第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件103第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件104第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件105第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件106第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件107第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件108第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件109第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件110基因突變基因突變111第二章蘭州大學(xué)基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)第二章蘭州大學(xué)基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)112第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件113第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件114

內(nèi)切酶，即在核酸分子內(nèi)部制造切口的酶形成5`-P和3`-OH末端2性質(zhì)3功能

自我保護(hù)作用細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）內(nèi)切酶，即在核酸分子內(nèi)部制造切口的酶2性質(zhì)115a限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA分子進(jìn)行分解，切成小片段AABBBBBa限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)116b修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割b修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲117c限制修飾系統(tǒng)分子機(jī)理由三個(gè)連續(xù)基因位點(diǎn)所控制：hsdR,hsdM,

hsdS

hsdR---限制性內(nèi)切酶:能識(shí)別DNA分子上的特定位點(diǎn)并將雙鏈DNA切斷hsdM---限制性甲基化酶:催化DNA分子特定位點(diǎn)上的堿基甲基化反應(yīng)hsdS---控制兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá):協(xié)助上述兩種酶識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)c限制修飾系統(tǒng)分子機(jī)理由三個(gè)連續(xù)基因位點(diǎn)所控制：118宿主細(xì)胞內(nèi)的甲基化酶將自身DNA和噬菌體DNA實(shí)施特異性保護(hù)，封閉了自身限制性酶的識(shí)別位點(diǎn)這種限制不完全，總有少數(shù)入侵DNA會(huì)存活，得以在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并被宿主的甲基化酶修飾，但同時(shí)，也喪失了原宿主甲基化酶標(biāo)記宿主細(xì)胞內(nèi)的甲基化酶將自身DNA和噬菌體DNA實(shí)施特異性保護(hù)119d意義寄主控制的限制與修飾是一種廣泛的過程，廣泛存在于原核細(xì)菌中。有兩方面作用：保護(hù)自身DNA不受限制破壞外源DNA，使之迅速降解d意義寄主控制的限制與修飾是一種廣泛的過程，廣泛存在于原核120二限制性內(nèi)切酶的命名命名：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：酶編碼基因所在質(zhì)粒；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)二限制性內(nèi)切酶的命名命名：121三限制性內(nèi)切酶類型目前鑒定出3種不同的限制性內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶II型限制性內(nèi)切酶Ⅲ型限制性內(nèi)切酶三限制性內(nèi)切酶類型目前鑒定出3種不同的限制性內(nèi)切酶I型限122限制性內(nèi)切酶的類型及其主要特性

限制性內(nèi)切酶的類型及其主要特性123II型限制性內(nèi)切酶的基本特性1970年，由H.O.smith和K.W.wilcox從流感嗜血菌中分離得到

如HindII（1）識(shí)別位點(diǎn)未甲基化修飾的特異靶序列，多數(shù)呈中心對稱的回文結(jié)構(gòu)，由4-8個(gè)堿基組成，有些識(shí)別位點(diǎn)是連續(xù)的，有些則是間斷的，如GANTCII型限制性內(nèi)切酶的基本特性1970年，由H.O.sm124（2）切割位點(diǎn)絕大多數(shù)II類酶在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)切割DNA（2）切割位點(diǎn)絕大多數(shù)II類酶在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)切割DNA125粘性末端（cohensiveend）連接便利粘性末端（cohensiveend）連接便利126第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件127

DNA分子末端標(biāo)記平末端補(bǔ)齊DNA分子末端標(biāo)記平末端補(bǔ)齊128一把特殊的剪刀

—限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)一把特殊的剪刀

—限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、129

同裂酶(isoschizomers)：來源不同，識(shí)別的是同樣的核苷酸靶序列同裂酶(isoschizomers)：來源不同，識(shí)別的130第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件131同尾酶(isocaudamer)

：來源不同，識(shí)別的靶序列也各不相同,但都能產(chǎn)生相同的粘性末端由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來的，在基因克隆實(shí)驗(yàn)中很有用處同尾酶(isocaudamer)：來源不同，識(shí)別的靶序列也132由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，稱之為“雜種位點(diǎn)”(hybridsite)。但這類雜種位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，一般不再被原來的任何一種同尾酶所識(shí)別由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，稱之為“雜133影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1、DNA的純度2、DNA的甲基化程度3、酶切反應(yīng)的溫度4、DNA的分子結(jié)構(gòu)5、核酸限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1、DNA的純度134DNA的純度DNA的純度135第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件136DNA的甲基化程度原核生物限制—修飾體系，對識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化，會(huì)強(qiáng)烈影響酶活性。在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌，在選用酶時(shí)應(yīng)注意：所選用的限制酶對甲基化的敏感性依DNA的不同來源選擇不同的限制酶DNA的甲基化程度原核生物限制—修飾體系，對識(shí)別序列中特定核137反應(yīng)溫度大多數(shù)的核酸限制內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度為37℃，但也有許多例外，如SmaI為25℃，ApaI為30℃，TaqI為65℃消化反應(yīng)溫度高于或低于最適反應(yīng)溫度，都會(huì)影響酶的活性每ugDNA用1-5U酶切1-2h反應(yīng)溫度大多數(shù)的核酸限制內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度為37℃，但138DNA的分子結(jié)構(gòu)某些核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需的酶量比消化線性DNA高出20倍一些核酸內(nèi)切酶，切割處于不同位置的限制位點(diǎn)，其效率有明顯的差異，可能是由于側(cè)翼序列的核苷酸成分的差異造成的有些特定的限制位點(diǎn)，只有當(dāng)其它的限制位點(diǎn)被廣泛切割時(shí)，才能被有關(guān)的核酸限制性內(nèi)切酶消化少數(shù)酶，如SacII對不同部位的限制位點(diǎn)的切割活性會(huì)有很大的差異，其中有些位點(diǎn)很難被切割DNA的分子結(jié)構(gòu)某些核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒D139核酸限制性內(nèi)切酶的緩沖液核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組分：MgCl2、NaCl/KCl、Tris-HCl、巰基乙醇或DTT以及BSA等NaCl或Mg2＋濃度：降低酶的活性，導(dǎo)致識(shí)別序列特異性改變Tris-HCl:穩(wěn)定反應(yīng)液的pH在酶的最佳pH范圍內(nèi)巰基試劑：保持酶的穩(wěn)定性，避免失活Na、K離子：對部分酶反應(yīng)敏感，部分酶則適應(yīng)較廣的離子強(qiáng)度的變化幅度核酸限制性內(nèi)切酶的緩沖液核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組分：140酶解反應(yīng)中的星號(hào)活性星號(hào)活性（staractivity）當(dāng)酶反應(yīng)體系發(fā)生改變時(shí)，酶的性能甚至酶切位點(diǎn)發(fā)生改變的現(xiàn)象酶解反應(yīng)中的星號(hào)活性星號(hào)活性（staractivity）當(dāng)141如EcoRI等,在正常條件下，切割5`GAATTC3`，但在甘油濃度>5%時(shí),也可切割5`PnPnATPyPy3`或者5`AATT3`如EcoRI等,在正常條件下，切割5`GAATTC3`，但在142限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止

終止后直接電泳檢測酶切結(jié)果限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止終止后直接電泳檢測酶切結(jié)果143第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件144完全消化和部分消化完全消化和部分消化145完全消化完全消化146部分消化部分消化147雙酶切的方法①

先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性最高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl等金屬離子及第二種酶，繼續(xù)溫育②

使用適合于大多數(shù)限制酶的單種緩沖液--谷氨酸鉀緩沖液(KGB)，可使各種限制酶的活性達(dá)到較高雙酶切的方法148使用限制酶的注意事項(xiàng)

使用限制酶的注意事項(xiàng)149第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件150第二節(jié)甲基化酶特征：與限制性內(nèi)切酶相對應(yīng)，識(shí)別位點(diǎn)相同1.大腸桿菌中的甲基化酶（1）Dam（腺嘌呤甲基化酶）:此酶可在5`GATC3`序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，這樣可使一些識(shí)別順序中含有5`GATC3`的限制性內(nèi)切酶不能切割

如BclI（TGATCA）（2）Dcm（胞嘧啶甲基化酶）:

此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影響的限制性內(nèi)切酶是EcoRII第二節(jié)甲基化酶特征：與限制性內(nèi)切酶相對應(yīng)，識(shí)別位點(diǎn)相同1512.甲基化酶的用途就許多II類限制性內(nèi)切酶而言，都相應(yīng)存在著相對的甲基化酶，它們可修飾限制酶識(shí)別順序中的第三位腺嘌呤上，從而使其免受切割甲基化酶的用途是在必要時(shí)可以封閉某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),同時(shí)又可能產(chǎn)生新的酶位點(diǎn)

2.甲基化酶的用途152

如兩個(gè)串聯(lián)的TaqI識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)M．TaqI甲基化封閉后，出現(xiàn)了一個(gè)依賴于甲基化的限制性核酸內(nèi)切酶DpnI的切割位點(diǎn)(下圖)如兩個(gè)串聯(lián)的TaqI識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)M．TaqI甲基化153第三節(jié)連接酶

廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其催化DNA雙鏈上相鄰的3`-OH和5`-P共價(jià)結(jié)合形成3`-5`磷酸二酯鍵DNA連接酶：大腸桿菌染色體DNA編碼,NAD+為能源輔助因子T4DNA連接酶:T4噬菌體DNA編碼,ATP為能源輔助因子,能進(jìn)行平末端DNA片段的連接連接溫度：通常37℃，但這時(shí)粘末端之間的氫鍵不穩(wěn)定，所以溫度應(yīng)界于酶連接速率和末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為4～15℃較合適第三節(jié)連接酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其催154一DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

1967年，世界多個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)催化DNA雙鏈上相鄰的3`-OH和5`-P共價(jià)結(jié)合形成3`-5`磷酸二酯鍵的酶一DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)1967年，世界多個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)催化D155二、特點(diǎn)二、特點(diǎn)1562連接條件2連接條件1573DNA連接酶連接反應(yīng)條件3DNA連接酶連接反應(yīng)條件158三、連接反應(yīng)機(jī)理三、連接反應(yīng)機(jī)理159第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件160第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件161四、連接反應(yīng)溫度四、連接反應(yīng)溫度162五、影響因素五、影響因素163第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件164六、反應(yīng)體系六、反應(yīng)體系165七、連接操作七、連接操作166第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件167八、體外連接DNA片段的幾種方法（1）直接用T4DNA連接酶連接（2）同聚物加尾，先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再

用DNA連接酶進(jìn)行連接（3）銜接物用銜接物連接平末端DNA分子（4）DNA接頭連接法八、體外連接DNA片段的幾種方法（1）直接用T4DNA連接酶168平頭末端（bluntend）在識(shí)別位點(diǎn)的對稱軸上同時(shí)切割，如EcoRⅤ平頭末端特點(diǎn)1、平末端和粘性末端連接方法平頭末端（bluntend）平頭末端特點(diǎn)1、平末端和169第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件1702、同聚物加尾法2、同聚物加尾法171

3、銜接物法

銜接物(1inker)，化學(xué)方法合成的一段由10-12個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段

3、銜接物法銜接物(1inker)，化學(xué)方法合1724、DNA接頭法4、DNA接頭法173第四節(jié)DNA聚合酶常用的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow大片段T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶特點(diǎn)：脫氧核糖核苷酸連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的3，-OH末端，催化核苷酸的聚合。其中，T7DNA聚合酶的聚合能力最強(qiáng)第四節(jié)DNA聚合酶常用的DNA聚合酶：1741、DNA聚合酶I反應(yīng)條件1、DNA聚合酶I反應(yīng)條件175用途－

DNA雜交探針的制備

用途－DNA雜交探針的制備176第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件177缺口轉(zhuǎn)移

(nicktranslation)缺口轉(zhuǎn)移

(nicktranslation)1782、Klenow酶2、Klenow酶179用途用途180第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件181第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件1823、T4DNA聚合酶3、T4DNA聚合酶183第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件184第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件185T4DNA聚合酶用途T4DNA聚合酶用途186第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件1874、逆轉(zhuǎn)錄酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶188第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件189第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件190第二章基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)課件191TaqDNA聚合酶1.特點(diǎn)：