聚乳酸和骨生長因子復合植入塊修復骨缺損的實驗研究

聚乳酸和骨生長因子復合植入塊修復

骨缺損的實驗研究

【摘要】目的探討堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)對重組人骨形成蛋白2（recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2，rhBMP-2）誘導骨形成的影響，評價多孔聚乳酸（polylacticacid，PLA）復合人工骨修復骨缺損的作用。方法在56例下頜骨缺損的兔模型中分別植入PLA／rhBMP-2／bFGF、PLA／rhBMP-2、PLA／bFGF、PLA，并設空白對照。植入后2、4、8周行X線攝片和組織學觀察骨缺損區(qū)骨形成的情況。結果3種材料復合物較兩種材料復合物成骨更好，而后者又較單一的PLA成骨好，所有含骨生長因子的植入組成骨量與對照組比較差異均有顯著性(P<0.05)。結論PLA具有良好的生物相容性和可吸收性,有骨傳導性能；bFGF可促進rhBMP-2在骨缺損愈合過程中的骨誘導作用；PLA／rhBMP-2／bFGF復合材料是一種有臨床應用前景的骨移植材料。

【關鍵詞】重組蛋白質(zhì)類成纖維細胞生長因子，堿性骨基質(zhì)PolylacticacidcombinedwithrecombinanthumanbonemorphogeneticproteinandbasicfibroblastgrowthfactortorepairthemandibulardefectsinrabbitsXUJianhui,MENGZhaoye,YANGZhen,etal.DepartmentofStomatology,NanjingGeneralHospitalofPLA,Nanjing210002

【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)onboneformationinducedbyrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2(rhBMP-2)inrepairofmandibulardefectsinrabbits.Methods56adultdomesticrabbitswereclassifiedintofivegroups.Themandiblarthree-walldefects(1.5cm×0.5cm,fullthick)werecreatedinrightsides.Thedefectswereimplantedwithvariousgrafts:PLA/rhBMP-2/bFGF,PLA/rhBMP-2,PLA/bFGF,PLAandnoimplantascontrolgroup.At2,4and8weeksafteroperation,theeffectivenessesofdefectrepairewereobservedbyhistologicalandroentgenographicanalysis.ResultsThecompositeconsistingofthreematerialsstimulatedmoreboneformationthanoftwomaterials,andthelatterwasmorethansinglePLA(at4weekspostoperation,P<0.05).Allexperimentalgroups,whichhadoneortwogrowthfactors,weresignificantlyhighercomparedwithcontrolgroupineverystageofpostimplantation.ConclusionPLAhasgoodbiocompatibility,absorbabilityandosteoconductibility,rhBMP-2andbFGFarecooperatedinbonehealingprocess,andPLA/rhBMP-2/bFGFisapromisingbonesubstituteinclinicaluses.

【Keywords】RecombinantproteinsFibroblastgrowthfactor，basicBonematrix

骨基質(zhì)中含有多種生長因子，它們通過促進成骨細胞的增殖和分化來調(diào)節(jié)骨形成過程。脫鈣骨基質(zhì)植入試驗表明：一旦骨誘導過程被骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP）啟動，則其他生長因子均可參與骨誘導的調(diào)節(jié)［1］。堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)是其中的一種，它也參與了骨誘導過程，并對新骨形成產(chǎn)生影響。我們將人工合成、可被生物降解、吸收的多孔聚乳酸(polylacticacid,PLA)與重組人骨形成蛋白2（recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2，rhBMP-2）和bFGF組合修復兔大面積骨缺損，以期探討bFGF對rhBMP-2的誘導骨形成作用，并評價多孔PLA復合人工骨的生物學性能。材料與方法一、材料的制備

1.PLA:廣州中山大學高分子研究所提供，平均相對分子質(zhì)量為48000，為固體塊狀。

2.bFGF:廣州暨南大學生物工程研究所提供，為bFGF的PBS液，2.5g/L。

3.rhBMP-2：軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所研制，異位成骨試驗示活性良好。

4.PLA植入塊的制作：通過注模方式將配制成的10%PLA二氧六環(huán)［2］溶液倒入預先用石膏制成的模具內(nèi)，在-70℃下凍干24小時，4℃風干6小時后取出。成形后為1.5cm×0.5cm×0.3cm的長方體,常溫下保存。掃描電鏡觀察其內(nèi)部結構（1)，內(nèi)部微孔直徑為150～200μm，微孔相互串聯(lián)。1掃描電鏡觀察PLA的內(nèi)部結構，呈珊瑚狀，微孔相互串聯(lián)，

孔率達50%以上，孔徑約150～200μm(×400)

5.PLA／rhBMP-2、PLA／bFGF、PLA／rhBMP-2／bFGF的復合：用電子天秤稱取1.5mg定量的rhBMP-2干凍粉或（和）10μl濃度為50mg/LbFGF的PBS液(含bFGF500ng)，加入陰模內(nèi)，充分攪勻、干凍、風干，4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

6.植入塊的消毒：所有植入塊在植入術前，用2.5×104Gy的γ射線照射1小時，殺滅表面可能粘附的病菌［3］。

二、動物模型

健康家兔56只，雌雄不限,體重2.5～3.5kg，隨機分成5組，詳見表1。用2%戊巴比妥鈉按30～40mg／kg行耳緣靜脈注射麻醉，沿右下頜骨下緣作切口，暴露下頜骨體部，用牙鉆作1.5cm×0.5cm的三壁全厚缺損，術中切斷了下牙槽神經(jīng)血管束，形成血供不足的較大缺損模型。置入各種植入塊，并用鋼絲結扎固定。表1實驗動物分組及處理（n＝56，只）組別植入塊術后時間（周）248APLA／rhBMP-2／bFGF255BPLA／rhBMP-2255CPLA／bFGF255DPLA255對照無233注：PLA：多孔聚乳酸；rhBMP-2：重組人骨形成蛋白2；bFGF：堿性成纖維細胞生長因子

三、觀察方法

于術后2、4、8周分別處死動物，取兔右側（手術側）下頜骨。

1.X線攝片：兔下頜骨平放在膠片盒上，100mAX線機垂直照射，48kV條件下0.02s，預實驗X線片反應兔下頜骨結構清晰，對比度良好，PLA材料為非阻射。通過3人盲法估計骨形成和塑形，標準采用5分制［4］：0：缺損區(qū)無新骨；1：1%～25%被新骨充填；2：26%～50%被新骨充填；3：51%～75%被新骨充填；4：76%～100%被新骨充填。

2.組織學檢查：甲酸、硝酸脫鈣、脫水、石蠟包埋，制成5μm厚的切片，HE染色，光鏡下觀察新生骨的形成、PLA的吸收情況以及缺損區(qū)內(nèi)的組織及細胞構成。結果一、X線片檢查

各組動物缺損區(qū)均有不同程度的成骨反應，其中A組最明顯,達75%以上（2)。3描述了各種植入組的骨形成，A組與D組、對照組相比差異均有顯著性；而B、C2組僅和對照組間差異有顯著性，此2組與D組相比成骨量較高（4周，P＜0.05），但在第8周它們之間差異無顯著性。A、B、C3組之間兩兩比較差異無顯著性。2術后8周，PLA/rhBMP-2/bFGF植入組新骨形成占缺損區(qū)

面積的75%以上，見小梁結構PLA：多孔聚乳酸；rhBMP-2：重組人骨形成蛋白2；bFGF：堿性成纖維細胞生長因子

3植入組及對照組在2、4、8周的骨形成評分

二、組織學觀察

術后2周，各組骨缺損邊緣均有少量新生骨痂覆蓋。A組和B組，伴隨著新生骨痂有大量成纖維細胞、成骨母細胞和成骨細胞增殖，與植床緊密接觸的修復塊部分開始降解，少量纖維結締組織和骨髓來源的細胞組織進入表面的微孔內(nèi)，部分骨樣小島在植入塊周緣形成（4)。C組可見大量的梭形細胞和肥大的間充質(zhì)細胞增殖，成骨細胞和成纖維樣細胞的數(shù)量較多，許多血管向缺損區(qū)方向長入，植入塊內(nèi)偶見一些成骨樣組織。4術后2周，PLA/rhBMP-2/bFGF和PLA/rhBMP-2組植入塊周緣見骨樣小島(HE3.3×20)

術后4周，A、B、C3組缺損區(qū)均可見散在的類骨組織和新骨形成，成骨細胞數(shù)量較多，一些纖維組織長入缺損區(qū)，此3組組織類型已無明顯差別，大量編織骨形成，亦見少量板層結構和髓腔形成（5)，PLA大片降解吸收，微孔增大形成空隙，結構顯現(xiàn)不規(guī)則的松散狀態(tài)，見一些吞噬細胞和多核巨細胞以及少許的白細胞浸潤，部分PLA殘片被新生骨包圍，成骨活躍。在A、B兩組的部分標本中可在新生骨痂周圍見軟骨細胞增生、肥大、軟骨形成及軟骨內(nèi)化骨這一過程（6)。D組，骨缺損邊緣的新生骨組織通過PLA裂解形成的間隙侵入植入塊內(nèi)，同時較多的纖維結締組織也長入缺損區(qū)，編織骨形成緩慢，成骨細胞數(shù)量較少。對照組呈現(xiàn)部分纖維性成骨，纖維組織繼續(xù)增生，較多瘢痕組織形成。5術后4周，PLA/rhBMP-2/bFGF組見大量編織骨、部分板層結構和骨髓，PLA大片降解吸收，結構松散(HE3.3×10)6術后4周，rhBMP-2組可見軟骨內(nèi)骨化形成(HE3.3×10)

術后8周，A、B、C3組缺損區(qū)50%以上被新生骨占據(jù)，雖然編織骨成份占大多數(shù)，但板層骨數(shù)量有所增加，髓腔亦增大，新生骨周圍可見破骨細胞存在。同時，一定量的纖維組織及纖維性骨痂形成，PLA結構大部分破裂被新骨充填，部分新骨組織50%以上被新生骨融合成蜿蜒迂曲的骨小梁，板層結構及哈佛系統(tǒng)明顯（7)。D組，成骨亦活躍，但PLA吸收并被新骨替代較前3組少。對照組仍為缺損邊緣少量新生骨痂新生覆蓋和纖維組織的形成，缺損區(qū)大部分被瘢痕組織充填，部分標本見肌肉組織長入缺損區(qū)。7術后8周，PLA/rhBMP-2/bFGF植入組顯示骨改建和塑形，

板層結構和哈佛系統(tǒng)明顯，可見梁狀結構(HE3.3×20)討論現(xiàn)已從骨基質(zhì)、骨器官及骨系細胞培養(yǎng)液中分離了多種骨生長因子，包括BMP、β-轉化生長因子（TGF-β）、骨骼生長因子或胰島素樣生長因子（IGFs）、FGFs和血小板衍生性生長因子（PDGF）等。在眾多生長因子中，BMP被證明是正常胚胎時期骨、牙組織和成年骨修復中最主要的誘導分化因子，但其他生長因子都對BMP的骨誘導過程產(chǎn)生影響［5］。本實驗使用PLA／rhBMP-2／bFGF復合植入塊對兔下頜骨缺損進行修復，術后4周、8周，PLA／rhBMP-2／bFGF組的新骨形成高于PLA／rhBMP-2和PLA／bFGF2組，統(tǒng)計學上組間差異無顯著性，作者認為這是由于樣本含量較小所致。但PLA／rhBMP-2／bFGF與單獨PLA組相比差異有顯著性，PLA／rhBMP-2和PLA／bFGF與PLA組比較，僅在4周差異有顯著性，表明bFGF對rhBMP-2誘導骨形成的影響。

體外實驗發(fā)現(xiàn)，bFGF能促進軟骨細胞前質(zhì)的分化及軟骨細胞的增殖和成熟［6］。而在體內(nèi)，Aspenberg和Lohmander［7］在DBM中加入外源性的bFGF可增加誘導成骨的數(shù)量；此外，它是一種毛細血管增殖刺激劑，能促進毛細血管向斷端及骨移植物中長入，使骨修復早期的組織中軟骨島數(shù)量增多并使斷端骨痂和骨移植物提前血管重建時限［8］。bFGF不僅有利于多種細胞包括軟骨細胞的增殖和分化作用，而且有明顯的血管形成作用。在BMP誘導新骨形成過程中，血管大量形成、長入，隨之帶來大量的血管內(nèi)皮細胞和管外周細胞（未分化間充質(zhì)細胞），從而為BMP提供了大量的靶細胞，使骨量增多。本實驗結果顯示，含有bFGF的復合植入材料置入缺損區(qū)后，bFGF加速了新骨形成的過程，作用于骨誘導成骨的早期階段（至4周），未分化間充質(zhì)細胞、成纖維細胞、骨髓來源的基質(zhì)細胞、成骨細胞以及毛細血管侵入數(shù)量的明顯增多（與PLA組相比）。由于BMP主要起形態(tài)原（morphogeny）的作用，它是一種微弱絲裂原，而bFGF是一種較強的絲裂原，通過二者的協(xié)同作用，將加速骨誘導的進程。PLA／rhBMP-2／bFGF組在X線片和組織學觀察方面均表明新骨形成活躍，成骨量較多。

PLA具有骨傳導性，實驗已顯示其有良好的生物相容性和可吸收性，沒有嚴重的急性和亞急性組織反應及清理反應［9］。本研究中各實驗組通過組織學觀察，術后2周僅有一層微薄的結締組織膜包繞，術后4周見少量的巨噬細胞和多核巨細胞浸潤，但隨著纖維結締組織和新骨的形成并侵入到PLA內(nèi)，這些輕微的異物反應隨著植入物的降解和新骨組織的逐漸融合而消失，并不影響骨缺損的修復進程。術后8周，PLA／rhBMP-2／bFGF組缺損區(qū)新骨形成達75%以上,PLA組的成骨量亦明顯高于對照組。

PLA／rhBMP-2／bFGF復合材料將骨傳導性與誘導性結合起來，較大限度地促進了新骨的形成。結果表明：多孔狀PLA具有較好的生物相容性和骨傳導性。微孔孔徑在150～200μm（內(nèi)部），與人體骨組織的微孔道結構相似，起到類似松質(zhì)骨的支架作用，術后8周，PLA僅有小部分殘留，無炎癥反應。rhBMP-2和bFGF共同作用于骨誘導過程，成骨量明顯增加，出現(xiàn)大量松質(zhì)骨，部分已出現(xiàn)板層骨及骨髓并可見骨改建和塑形組織群。PLA／rhBMP-2／bFGF復合材料是一種有應用前景的骨移植替代品。作者單位：210002南京軍區(qū)南京總醫(yī)院口腔科（許建輝、孟昭業(yè)、楊震、張森林）；第一軍醫(yī)大學珠江醫(yī)院口腔科（梁河清）參考文獻[1]UristMR,DelangeRJ,FinermanGA.Bonecelldifferentiationandgrowthfactors.Science,1983,220:680-686.

[2]MikiT,HaradaK,ImaiY,etal.Effectoffreeze-driedpoly-L-lacticaciddiscsmixedwithbonemorphogeneticproteinonthehealingofratskulldefects.JOralMaxillofacSurg,1994,52:387-391.

[3]IjiriS,YamamuroT,NakamuraT,etal.Effectofsterilizationonbonemorphogeneticprotein.JOrthopRes,1994,12:628-636.

[4]BostromM,LaneJM,TominE,etal.Useofbonemorphogeneticprotein-2intherabbitulna