植物生物技術(shù)-第一章-植物組織培養(yǎng)實驗室的構(gòu)建與無菌操作技術(shù)課件

第一章植物組織培養(yǎng)實驗室的構(gòu)建與無菌操作技術(shù)第一章植物組織培養(yǎng)實驗室的構(gòu)建與無菌操作技術(shù)第一節(jié)、植物組織培養(yǎng)實驗室建設(shè)第二節(jié)、培養(yǎng)基配制第三節(jié)、植物組織培養(yǎng)離體操作技術(shù)本章主要內(nèi)容第一章第一節(jié)、植物組織培養(yǎng)實驗室建設(shè)本章主要內(nèi)容第一章本章教學(xué)目的與要求了解植物組織培養(yǎng)實驗室的基本設(shè)置掌握培養(yǎng)基的選擇及配制方法掌握基本的無菌操作技術(shù)第一章本章教學(xué)目的與要求了解植物組織培養(yǎng)實驗室的基本設(shè)置第一章一、植物組織培養(yǎng)實驗室設(shè)計二、儀器和設(shè)備三、玻璃器皿和用具第一節(jié)植物組織培養(yǎng)室建設(shè)第一章一、植物組織培養(yǎng)實驗室設(shè)計第一節(jié)植物組織培養(yǎng)室建設(shè)第一章一、植物組織培養(yǎng)實驗室設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室主要包括：1.準(zhǔn)備室2.無菌操作室（接種室）3.培養(yǎng)室4.溫室第一節(jié)一、植物組織培養(yǎng)實驗室設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室主要包括：第一節(jié)1、準(zhǔn)備室所需器具的清洗、干燥和保存培養(yǎng)基的配制和滅菌生理生化測定等第一節(jié)1、準(zhǔn)備室所需器具的清洗、干燥和保存第一節(jié)2、無菌操作室（接種室）主要設(shè)備：空調(diào)、培養(yǎng)架、燈光、除濕機(jī)、換氣扇等。要求：干爽安靜，清潔明亮，墻壁光滑平整不易積污灰塵，地面平坦無縫便于清洗和滅菌。第一節(jié)是開展組織培養(yǎng)研究包括接種、繼代、細(xì)胞融合等的場所。2、無菌操作室（接種室）主要設(shè)備：空調(diào)、培養(yǎng)架、燈光、除濕機(jī)3、培養(yǎng)室是將接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料進(jìn)行培養(yǎng)的場所。第一節(jié)4.溫室

植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進(jìn)行練苗，待生根成活后，再移到大田。3、培養(yǎng)室是將接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料進(jìn)行培養(yǎng)的場所。二、儀器和設(shè)備（一）無菌操作設(shè)備１、干燥箱：作用：干燥清洗后的器皿60-80℃高溫干熱滅菌160-200℃測干重時烘干培養(yǎng)材料80-100℃

第一節(jié)二、儀器和設(shè)備（一）無菌操作設(shè)備第一節(jié)2、高壓蒸汽消毒鍋類型：手提式高壓蒸汽消毒鍋全自動高溫高壓滅菌鍋作用：培養(yǎng)基、水和各種用具的消毒第一節(jié)手提式滅菌鍋

全自動滅菌鍋2、高壓蒸汽消毒鍋類型：手提式高壓蒸汽消毒鍋第一節(jié)手提式滅菌手提式高壓蒸汽消毒鍋使用方法：（1）加水：取下鍋蓋向鍋內(nèi)加3L左右的清水，以接近鍋底坐墊為準(zhǔn)，注意加水適量，過多容易濺至消毒物上，過少容易燒干。急用時可加入熱水。（2）放入待滅菌物品：將消毒物品用滅菌袋包裝，放入滅菌鍋，不能放得太擠，以免影響空氣流通，影響滅菌效果。（3）接通壓力表：將鍋蓋好，注意將蓋連接的軟管插入鋁籃的半圓型槽內(nèi)，以使籃內(nèi)感覺到壓力與壓力表相通。注意鍋蓋與鍋沿之間的橡皮墊扣準(zhǔn)，以免漏氣，然后旋緊消毒器的螺絲。手提式高壓蒸汽消毒鍋使用方法：（1）加水：取下鍋蓋向鍋內(nèi)加3（4）加熱，排放冷空氣：接通電源，使其加熱，待壓力表升至0.5kg時，開放氣閥門，放掉原來的空氣，直到見到熱氣。（5）高溫高壓滅菌：繼續(xù)加熱，使鍋內(nèi)壓力達(dá)到1.2kg，保持15~30分鐘。一般情況下超過1.5kg時會自動放氣，如達(dá)到1.5kg仍不自動放氣，則應(yīng)關(guān)電源，使其停止加熱。（6）冷卻減壓：滅菌時間到后關(guān)掉電源，使其自然冷卻，或間歇放氣數(shù)次，至完全減壓后才可打開鍋蓋，用完后，將鍋內(nèi)的水倒掉，涼干保管。（4）加熱，排放冷空氣：接通電源，使其加熱，待壓力表升至0.全自動高壓滅菌鍋使用方法（參數(shù)設(shè)置）（1）按“POWER”鍵打開儀器電源。（2）按“MODE”鍵選擇消毒模式（瓊脂、普通液體、固體模式）。（3）按“SET/ENT”鍵，用“▲”或“▼”設(shè)置消毒溫度；（4）按“NEXT”鍵，用“▲”或“▼”設(shè)置消毒時間；（5）按“NEXT”鍵，用“▲”或“▼”設(shè)置排氣速率；（6）按“NEXT”鍵，用“▲”或“▼”設(shè)置保溫溫度；（7）按“SET/ENT”鍵保存所設(shè)定的參數(shù)。全自動高壓滅菌鍋使用方法（參數(shù)設(shè)置）（1）按“POWER”鍵使用注意事項（1）使用前必須檢查滅菌腔內(nèi)是否有足夠的水。（2）消毒完后必須等壓力表指示回零后方可開蓋。（3）使用前必須檢查手動排氣旋鈕是否關(guān)閉。（4）長期不使用必須將滅菌腔內(nèi)的水排干。（5）經(jīng)常檢查排氣壺內(nèi)的水是否在安全線內(nèi)。（6）使用專用電源。使用注意事項（1）使用前必須檢查滅菌腔內(nèi)是否有足夠的水。3、超凈工作臺陳列于操作室（接種室）內(nèi)類型：垂直側(cè)流式和水平層流式工作原理：將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器過濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器過濾，由此送出的潔凈氣流以均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，形成無菌的工作環(huán)境作用：無菌操作第一節(jié)3、超凈工作臺陳列于操作室（接種室）內(nèi)第一節(jié)4.消毒器Zeiss濾器、玻璃濾器和微孔濾器。Zeiss濾器為不銹鋼的金屬結(jié)構(gòu)，中間夾有一層石棉制成的一次性纖維濾板。濾板具有一定的厚度，可承受—定的壓力，因此是過濾粘稠液體較理想的濾器。第一節(jié)4.消毒器Zeiss濾器、玻璃濾器和微孔濾器。第一節(jié)Zeiss濾器：抽濾式或加壓式。抽濾式濾器與抽濾瓶相連，真空泵抽氣形成負(fù)壓以過濾液體；加壓式濾器的容器為密閉式，加入待過濾的液體后，通以氣體（常用N2、O2或CO2），形成壓力將液體濾過。Zeiss濾器：抽濾式或加壓式。玻璃濾器為玻璃結(jié)構(gòu)，以燒結(jié)玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上可用于過濾各種培養(yǎng)液體只能采用抽濾式。玻璃濾器為玻璃結(jié)構(gòu)，以燒結(jié)玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上微孔濾膜濾器的基本結(jié)構(gòu)與Zeiss濾器相同，其中間是一次性的特制混合纖維素脂濾膜，可用于各種培養(yǎng)液體的過濾除菌，速度較快，效果較好，有孔徑為0.6μm、0.45μm、0.22μm三種濾膜，用以過濾除菌時，最好使用0.22μm孔徑的濾膜（可以除去細(xì)菌和霉菌）。25微孔濾膜濾器的基本結(jié)構(gòu)與Zeiss濾器相同，其中間是一次性的（二）藥品貯存、配制相關(guān)儀器設(shè)備1、冰箱規(guī)格：4℃，-20℃，-80℃作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。超低溫冰箱第一節(jié)（二）藥品貯存、配制相關(guān)儀器設(shè)備1、冰箱超低溫冰箱第一節(jié)2、天平陳列于制備室中作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑第一節(jié)2、天平陳列于制備室中第一節(jié)3、酸度計陳列于準(zhǔn)備室中作用：測定培養(yǎng)基、酶制劑或緩沖液等的pH值PHS-802中文臺式酸度計第一節(jié)3、酸度計陳列于準(zhǔn)備室中PHS-802中文臺式酸度計第一節(jié)4.純水裝置植物組織培養(yǎng)要求使用高純度的水，進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時，配制各種培養(yǎng)液及試劑等均需使用重蒸餾水，玻璃器皿等的沖洗，也應(yīng)用蒸餾水自動雙重純水蒸餾器，使用方便、安全、蒸餾速度快。這種蒸餾器的使用方法是將經(jīng)金屬蒸餾器蒸餾的蒸餾水加入玻璃蒸餾器內(nèi)進(jìn)行蒸餾。第一節(jié)4.純水裝置植物組織培養(yǎng)要求使用高純度的水，進(jìn)行植物組織培5.離心機(jī)作用：離心洗滌、收集細(xì)胞或原生質(zhì)體、制備細(xì)胞懸液、調(diào)整細(xì)胞密度等低速離心，使用80~100g的離心力即可，太大有時可能引起細(xì)胞的損傷。因此配置4000rpm的國產(chǎn)臺式離心機(jī)，離心速度1000rpm即可。第一節(jié)5.離心機(jī)作用：離心洗滌、收集細(xì)胞或原生質(zhì)體、制備細(xì)胞懸液（三）培養(yǎng)設(shè)備第一節(jié)（三）培養(yǎng)設(shè)備第一節(jié)第一節(jié)1.空調(diào)作用：控制培養(yǎng)溫度2.加濕器和去濕機(jī)作用：控制培養(yǎng)室內(nèi)濕度狀況3.定時器作用：控制光照時間4.培養(yǎng)架作用：盛放培養(yǎng)物第一節(jié)1.空調(diào)3.定時器第一節(jié)第一節(jié)（四）觀察分析儀器設(shè)備倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細(xì)胞活力觀察體視顯微鏡形態(tài)分化的實體觀察激光共聚焦顯微鏡掃描電鏡病毒檢測、細(xì)胞器變化透射電鏡第一節(jié)（四）觀察分析儀器設(shè)備倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察倒置顯微鏡主要用于活體的觀察比如原生質(zhì)體培養(yǎng)的過程原生質(zhì)體融合的動態(tài)過程等第一節(jié)倒置顯微鏡主要用于活體的觀察第一節(jié)正置顯微鏡第一節(jié)正置顯微鏡第一節(jié)相差:

一般在顯微鏡鏡頭上配置相差環(huán)；該方法不要求標(biāo)本染色，用于觀察活體細(xì)胞和微生物最為理想。熒光：一般在顯微鏡鏡體上配置熒光濾片，進(jìn)行熒光蛋白質(zhì)或熒光染色的觀察第一節(jié)相差:一般在顯微鏡鏡頭上配置相差環(huán)；該方法不要求標(biāo)本染色，霍夫曼調(diào)制相襯(HMC)使透明的活體標(biāo)本產(chǎn)生生動、具有三維立體感的圖像。HMC成像技術(shù)中，標(biāo)本可以置于塑料培養(yǎng)皿中觀察。

微分干涉相襯（DIC）未經(jīng)染色的活體細(xì)胞和微生物所觀察到的圖像具有三維浮雕狀的立體感，且對比度和靈敏度出眾。

第一節(jié)霍夫曼調(diào)制相襯(HMC)微分干涉相襯（DIC）第一節(jié)體視顯微鏡（解剖鏡）第一節(jié)立體標(biāo)本或材料的觀察體視顯微鏡（解剖鏡）第一節(jié)立體標(biāo)本或材料的觀察激光共聚焦顯微鏡Confocalmicroscopy第一節(jié)綠色熒光蛋白標(biāo)記目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞中的表達(dá)激光共聚焦顯微鏡第一節(jié)綠色熒光蛋白標(biāo)記目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉掃描電鏡第一節(jié)ABDCEF棉花纖維細(xì)胞的突起及伸長掃描電鏡第一節(jié)ABDCEF棉花纖維細(xì)胞的突起及伸長觀察動植物、微生物細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、核膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體等透射電鏡第一節(jié)體細(xì)胞胚與合子胚超微結(jié)構(gòu)的觀察觀察動植物、微生物細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、核膜、線粒體、三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培養(yǎng)器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等2.分注器類型：注射器式分注器、漏斗式分注器、量筒漏斗式分注器3.其他玻璃儀器燒杯、量筒、移液管、容量瓶、試劑瓶等第一節(jié)三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿第一節(jié)第一節(jié)第一節(jié)（二）.器械類1.鑷子類型：槍式鑷子（接種、轉(zhuǎn)移）、尖頭鑷子2.剪刀類型：大剪刀、小剪刀、彎頭剪刀3.解剖刀類型：固定式和活動式4.接種針用來轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織第一節(jié)本節(jié)完（二）.器械類1.鑷子第一節(jié)本節(jié)完第二節(jié)培養(yǎng)基配制主要內(nèi)容：一、培養(yǎng)基的構(gòu)成二、常用培養(yǎng)基及其特點三、培養(yǎng)基的配制第一章第二節(jié)培養(yǎng)基配制主要內(nèi)容：第一章一、培養(yǎng)基的構(gòu)成（一）水分

類型：蒸餾水作用：構(gòu)成培養(yǎng)基的主要成分第二節(jié)一、培養(yǎng)基的構(gòu)成（一）水分第二節(jié)（二）無機(jī)鹽類

大量元素：氮(N)、磷（P）、鉀（K）、硫（S）、鈣(Ca)、鎂(Mg)微量元素：鐵(Fe)、錳（Mn）、銅（Cu）、鋅(Zn)、硼（B）和鋁（Al）濃度大于0.5mmol/L的元素為大量元素，小于0.5mmol/L的元素為微量元素作用：提供植物生長所需營養(yǎng)元素第二節(jié)（二）無機(jī)鹽類

大量元素：氮(N)、磷（P）、鉀（K）、硫（（三）有機(jī)營養(yǎng)成分---糖類最常用的碳源是蔗糖和葡萄糖使用濃度為2%－5%作為植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓第二節(jié)（三）有機(jī)營養(yǎng)成分---糖類最常用的碳源是蔗糖和葡萄糖第二節(jié)（三）有機(jī)營養(yǎng)成分---維生素硫胺素（VB1）一般認(rèn)為是一種必需的成分吡哆醇（VB6），煙酸（VB3），泛酸鈣（VB5）和肌醇也都能顯著地改善培養(yǎng)的植物組織生長狀況第二節(jié)（三）有機(jī)營養(yǎng)成分---維生素硫胺素（VB1）一般認(rèn)為是一種（四）植物生長調(diào)節(jié)劑

1．生長素

2．細(xì)胞分裂素

3．赤霉素類4.油菜素內(nèi)脂5.乙烯第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑1．生長素第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—生長素生長素影響到植物莖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現(xiàn)象在離體植物組織培養(yǎng)中，生長素被用于誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和根的分化常用的生長素：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）和2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—生長素生長素影響到植物莖和節(jié)間的伸長、其中IBA和NAA廣泛用于生根，并能與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖

2，4-D對于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長非常有效2，4-D+KTIBA+KT第二節(jié)其中IBA和NAA廣泛用于生根，并能與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素影響植物細(xì)胞分裂、頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化等常用的細(xì)胞分裂素有：BAP（芐氨基嘌呤）、6—BA（芐基腺膘呤）、2—ip（異戊烯氨基嘌呤）、KT（激動素，呋喃氨基嘌呤）和ZT（玉米素）第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素影響植物細(xì)胞分裂、（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—赤霉素常用GA3促進(jìn)莖伸長生長誘導(dǎo)開花促進(jìn)雄花分化棉花的胚珠培養(yǎng)第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—赤霉素常用GA3第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—油菜素內(nèi)脂促進(jìn)伸長機(jī)理與生長素類似第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—油菜素內(nèi)脂促進(jìn)伸長第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—乙烯解除休眠調(diào)節(jié)莖伸長生長促進(jìn)根生長及分化促進(jìn)果實成熟第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—乙烯解除休眠第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—脫落酸促進(jìn)休眠抑制生長促進(jìn)氣孔關(guān)閉促進(jìn)脫落第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—脫落酸促進(jìn)休眠第二節(jié)（五）凝固劑瓊脂(agar)是固體培養(yǎng)基的必要成分，瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。新型凝固劑：phytagel第二節(jié)（五）凝固劑瓊脂(agar)是固體培養(yǎng)基的必要成分，瓊脂是（六）天然有機(jī)添加物質(zhì)類型：椰子汁、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥作用：提供有機(jī)營養(yǎng)（七）其他添加物類型：活性炭、Vc等作用：防褐化第二節(jié)（六）天然有機(jī)添加物質(zhì)第二節(jié)（八）抗生素抗生物質(zhì)(antibiotic)，包括青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢霉素等，用量在10—500mg/L之間添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，進(jìn)行選擇培養(yǎng)第二節(jié)（八）抗生素第二節(jié)二、培養(yǎng)基的選擇（一）培養(yǎng)基的基本類型1.含鹽量較高的培養(yǎng)基：種類：MS培養(yǎng)基(1962)、LS培養(yǎng)基、BL培養(yǎng)基、ER培養(yǎng)基（1965）等。特點：無機(jī)鹽濃度高，特別是硝酸根離子、鉀離子和銨離子含量豐富。第二節(jié)二、培養(yǎng)基的選擇（一）培養(yǎng)基的基本類型第二節(jié)2.硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基類型：B5培養(yǎng)基（1968）、N6培養(yǎng)基（1974）、SH培養(yǎng)基。特點：培養(yǎng)基的濃度較高，銨態(tài)氮含量較低，但硝酸鉀和鹽酸硫胺素(VB1)含量較高。第二節(jié)2.硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基類型：B5培養(yǎng)基（1968）、N3.中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基類型：Nitsch培養(yǎng)基（1969）、Miller培養(yǎng)基和H培養(yǎng)基。特點：大量元素含量約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類少但含量較高，維生素種類較多。第二節(jié)3.中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基類型：Nitsch培養(yǎng)基（1964.低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基類型：White培養(yǎng)基（1983）、WS培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基。特點：無機(jī)鹽含量非常低，為MS培養(yǎng)基的1/4左右，有機(jī)成分也很低。第二節(jié)4.低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基類型：White培養(yǎng)基（1983）、（二）基本培養(yǎng)基的選擇ＭＳ培養(yǎng)基：多數(shù)植物，但不適合生長緩慢、對無機(jī)鹽類要求低的植物，尤其是不適合銨鹽高會發(fā)生毒害的植物。第二節(jié)（二）基本培養(yǎng)基的選擇ＭＳ培養(yǎng)基：多數(shù)植物，但不適合生長第二B5培養(yǎng)基：豆類、木本科植物。N6培養(yǎng)基：適合植物的花藥培養(yǎng)。White培養(yǎng)基：應(yīng)用較廣，非常適合生根培養(yǎng)和幼胚培養(yǎng)。WPM培養(yǎng)基：適合木本植物的培養(yǎng)。特點：氮含量比較低。KM8P:原生質(zhì)體培養(yǎng)注意！實際應(yīng)用中要通過試驗篩選。第二節(jié)B5培養(yǎng)基：豆類、木本科植物。注意！實際應(yīng)用中要通過試驗篩三、培養(yǎng)基的配制（一）培養(yǎng)基母液的配制（以MS為例）1.基本培養(yǎng)基母液類型：大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液、維生素母液、肌醇、甘氨酸儲存：各種容量試劑瓶常溫或2~4冰箱倍數(shù)：10X、100X、1000等標(biāo)記：名稱、配制倍數(shù)、日期等。第二節(jié)三、培養(yǎng)基的配制（一）培養(yǎng)基母液的配制（以MS為例）第二節(jié)2.植物生長調(diào)節(jié)劑（1000倍）配制方法：2,4－D、NAA、IAA、IBA、GA3、ZT：先用少量95%酒精溶解后，加水定容。KT、6-BA：用1mol/L的鹽酸溶解后，加水定容。儲存：4度或以下長期保存標(biāo)記：名稱、配制倍數(shù)、日期等。第二節(jié)2.植物生長調(diào)節(jié)劑（1000倍）配制方法：第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)（二）培養(yǎng)基的配制步驟取一干凈燒杯，加入1/3體積的蒸餾水，用移液管量取所需量的母液加入燒杯稱取定量瓊脂加入燒杯中，加熱煮沸攪拌，待瓊脂完全溶解，分裝稱取定量的糖加入燒杯中并不斷攪拌，直到完全溶解，定容用NaOH或稀HCl調(diào)節(jié)pH值高壓滅菌，（121℃，15

min~20min）冷卻，取出，備用第二節(jié)本節(jié)完（二）培養(yǎng)基的配制步驟取一干凈燒杯，加入1/3體積的蒸餾水，第三節(jié)植物組織培養(yǎng)離體操作技術(shù)一、器皿和用具的清洗二、滅菌與消毒三、無菌操作步驟四、無菌培養(yǎng)第一章第三節(jié)植物組織培養(yǎng)離體操作技術(shù)一、器皿和用具的清洗第一章一、器皿和用具的清洗（一）玻璃器皿的清洗（二）塑料器皿的清洗（三）器皿包裝第三節(jié)一、器皿和用具的清洗（一）玻璃器皿的清洗第三節(jié)二、滅菌與消毒（一）滅菌和消毒的種類1.培養(yǎng)基的滅菌2.器皿和用具的滅菌3.外植體的消毒4.接種區(qū)滅菌5.培養(yǎng)環(huán)境消毒第三節(jié)二、滅菌與消毒（一）滅菌和消毒的種類第三節(jié)物理滅菌化學(xué)滅菌高溫高壓滅菌干熱滅菌射線照射滅菌過濾滅菌熏蒸滅菌消毒液滅菌（二）.滅菌方法第三節(jié)物理滅菌化學(xué)滅菌高溫高壓滅菌熏蒸滅菌（二）.滅菌方法第三節(jié)（三）

滅菌原理1.高溫高壓滅菌

原理：將待滅菌的物品放在一個密封的高壓高溫滅菌鍋內(nèi)，在121℃高溫和每平方厘米1個大氣壓下，一般持續(xù)15－30min，就可殺死一切微生物的營養(yǎng)體及其孢子，適于器皿、工具、衣物和培養(yǎng)基滅菌。第三節(jié)（三）滅菌原理第三節(jié)滅菌需要的時間與物品有關(guān)：含有20-50ml培養(yǎng)基的試管或三角瓶，1210C，15’含有50-500ml培養(yǎng)基的三角瓶，1210C，15’含有500-5000ml培養(yǎng)基的三角瓶，1210C，20’空試管、瓶、濾紙等，1210C，30’第三節(jié)滅菌需要的時間與物品有關(guān)：第三節(jié)高溫高壓滅菌后可能出現(xiàn)的問題(1).pH值下降0.3-0.5(2).太高溫度滅菌時會使糖焦化,可能產(chǎn)生毒性(3).滅菌時間太長會使鹽沉淀,同時使瓊脂解聚(4).揮發(fā)性物質(zhì)不能高溫滅菌,否則會被破壞第三節(jié)高溫高壓滅菌后可能出現(xiàn)的問題第三節(jié)不能高溫高壓滅菌的物質(zhì)：多糖Colchicine（秋水仙素）Zeatin（玉米素）GA3（95%失活）VB12、Vc、泛酸Antibiotics（抗生素）PlantextractsEnzymes第三節(jié)不能高溫高壓滅菌的物質(zhì)：第三節(jié)2.過濾滅菌法

原理：將帶菌的液體或氣體通過孔徑小于0.45μm微孔濾器裝置，使液、氣體通過濾膜流入無孔瓶中。第三節(jié)2.過濾滅菌法第三節(jié)3.化學(xué)滅菌法主要用于植物材料的消毒，所用濃度、消毒時間因不同材料而定.第三節(jié)3.化學(xué)滅菌法第三節(jié)一些表面消毒劑的使用方法消毒劑使用濃度消毒時間（min）次氯酸鈣9-10%5-30次氯酸鈉2%3-40過氧化氫10-12%5-15溴水1-2%2-10硝酸銀1%3-30氯化汞0.1-1%2-15抗生素4-500mg/L30-60第三節(jié)一些表面消毒劑的使用方法第三節(jié)對于難消毒的材料,如有茸毛的、粗糙不平的、地下部的等,在消毒前，一般先用肥皂水洗凈，自來水沖凈再在70%酒精或1N鹽酸中浸30’再進(jìn)入消毒劑，消毒劑中可加數(shù)滴吐溫20，以增強(qiáng)消毒劑的效果第三節(jié)對于難消毒的材料,如有茸毛的、粗糙不平的、地下部的等,在消毒三、無菌操作技術(shù)(一)、植物材料的消毒 接種前必須使材料完全無菌，這是取得植物組織培養(yǎng)成功的根本保證。取材應(yīng)注意的事項：從健壯株上取材,不要有傷口嚴(yán)格防治病蟲要在晴天取，最好中午或下午取材最好避開選用田間材料，選用無菌苗若非要用田間材料，最好將材料種在大棚里(無雨水的地方)或生長箱里第三節(jié)三、無菌操作技術(shù)(一)、植物材料的消毒第三節(jié)(二)、無菌操作植物組織培養(yǎng)是一種無菌技術(shù)，因此不僅要求整個操作過程，一切用具、材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)室、工作人員的衣物都要避免帶菌，而且要求工作人員在操作過程中要遵守?zé)o菌操作的規(guī)程在進(jìn)行無菌操作是要嚴(yán)守以下幾點：

第三節(jié)(二)、無菌操作第三節(jié)1.入無菌室前，要洗手2.入室時要穿上經(jīng)過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等3.操作前要用70％的酒精擦洗工作人員的手，操作中要經(jīng)常用酒精擦洗手4.少講話，亦不準(zhǔn)對著操作區(qū)呼吸，以免微生物污染材料、培養(yǎng)基和用具5.每次重新操作都要把工具在火焰上消毒

第三節(jié)1.入無菌室前，要洗手第三節(jié)6.必須在酒精燈火焰處進(jìn)行操作，如打開瓶口，轉(zhuǎn)接材料。蓋瓶蓋前應(yīng)將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上燒一下，然后蓋上7.超凈臺內(nèi)不要放置太多物品，要保證接種區(qū)域空曠，有無菌風(fēng)吹過。8.定期用70％的酒精擦洗超凈工作臺，并用紫外燈殺菌,保持接種室干凈整潔第三節(jié)6.必須在酒精燈火焰處進(jìn)行操作，如打開瓶口，轉(zhuǎn)接材料。蓋瓶關(guān)燈（10min）酒精消毒點燃酒精燈開始操作無菌操作步驟紫外燈滅菌（≥10min）第三節(jié)關(guān)燈（10min）酒精消毒點燃酒精燈開始操作無菌操作步驟紫四、無菌培養(yǎng)材料接種后應(yīng)移入培養(yǎng)室培養(yǎng)，一般培養(yǎng)室要求整潔干凈，有理想的光照控溫系統(tǒng)，一般材料要求25-28℃左右，晚上一般不應(yīng)低于20℃

。第三節(jié)四、無菌培養(yǎng)第三節(jié)

本章思考題組織培養(yǎng)常用的設(shè)備有哪些？各有何用途？培養(yǎng)基的種類和特點培養(yǎng)基的成分及配制方法滅菌的方法及原理無菌操作注意事項有哪些？本章思考題組織培養(yǎng)常用的設(shè)備有哪些？各有何用途？第一章植物組織培養(yǎng)實驗室的構(gòu)建與無菌操作技術(shù)第一章植物組織培養(yǎng)實驗室的構(gòu)建與無菌操作技術(shù)第一節(jié)、植物組織培養(yǎng)實驗室建設(shè)第二節(jié)、培養(yǎng)基配制第三節(jié)、植物組織培養(yǎng)離體操作技術(shù)本章主要內(nèi)容第一章第一節(jié)、植物組織培養(yǎng)實驗室建設(shè)本章主要內(nèi)容第一章本章教學(xué)目的與要求了解植物組織培養(yǎng)實驗室的基本設(shè)置掌握培養(yǎng)基的選擇及配制方法掌握基本的無菌操作技術(shù)第一章本章教學(xué)目的與要求了解植物組織培養(yǎng)實驗室的基本設(shè)置第一章一、植物組織培養(yǎng)實驗室設(shè)計二、儀器和設(shè)備三、玻璃器皿和用具第一節(jié)植物組織培養(yǎng)室建設(shè)第一章一、植物組織培養(yǎng)實驗室設(shè)計第一節(jié)植物組織培養(yǎng)室建設(shè)第一章一、植物組織培養(yǎng)實驗室設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室主要包括：1.準(zhǔn)備室2.無菌操作室（接種室）3.培養(yǎng)室4.溫室第一節(jié)一、植物組織培養(yǎng)實驗室設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室主要包括：第一節(jié)1、準(zhǔn)備室所需器具的清洗、干燥和保存培養(yǎng)基的配制和滅菌生理生化測定等第一節(jié)1、準(zhǔn)備室所需器具的清洗、干燥和保存第一節(jié)2、無菌操作室（接種室）主要設(shè)備：空調(diào)、培養(yǎng)架、燈光、除濕機(jī)、換氣扇等。要求：干爽安靜，清潔明亮，墻壁光滑平整不易積污灰塵，地面平坦無縫便于清洗和滅菌。第一節(jié)是開展組織培養(yǎng)研究包括接種、繼代、細(xì)胞融合等的場所。2、無菌操作室（接種室）主要設(shè)備：空調(diào)、培養(yǎng)架、燈光、除濕機(jī)3、培養(yǎng)室是將接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料進(jìn)行培養(yǎng)的場所。第一節(jié)4.溫室

植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進(jìn)行練苗，待生根成活后，再移到大田。3、培養(yǎng)室是將接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料進(jìn)行培養(yǎng)的場所。二、儀器和設(shè)備（一）無菌操作設(shè)備１、干燥箱：作用：干燥清洗后的器皿60-80℃高溫干熱滅菌160-200℃測干重時烘干培養(yǎng)材料80-100℃

第一節(jié)二、儀器和設(shè)備（一）無菌操作設(shè)備第一節(jié)2、高壓蒸汽消毒鍋類型：手提式高壓蒸汽消毒鍋全自動高溫高壓滅菌鍋作用：培養(yǎng)基、水和各種用具的消毒第一節(jié)手提式滅菌鍋

全自動滅菌鍋2、高壓蒸汽消毒鍋類型：手提式高壓蒸汽消毒鍋第一節(jié)手提式滅菌手提式高壓蒸汽消毒鍋使用方法：（1）加水：取下鍋蓋向鍋內(nèi)加3L左右的清水，以接近鍋底坐墊為準(zhǔn)，注意加水適量，過多容易濺至消毒物上，過少容易燒干。急用時可加入熱水。（2）放入待滅菌物品：將消毒物品用滅菌袋包裝，放入滅菌鍋，不能放得太擠，以免影響空氣流通，影響滅菌效果。（3）接通壓力表：將鍋蓋好，注意將蓋連接的軟管插入鋁籃的半圓型槽內(nèi)，以使籃內(nèi)感覺到壓力與壓力表相通。注意鍋蓋與鍋沿之間的橡皮墊扣準(zhǔn)，以免漏氣，然后旋緊消毒器的螺絲。手提式高壓蒸汽消毒鍋使用方法：（1）加水：取下鍋蓋向鍋內(nèi)加3（4）加熱，排放冷空氣：接通電源，使其加熱，待壓力表升至0.5kg時，開放氣閥門，放掉原來的空氣，直到見到熱氣。（5）高溫高壓滅菌：繼續(xù)加熱，使鍋內(nèi)壓力達(dá)到1.2kg，保持15~30分鐘。一般情況下超過1.5kg時會自動放氣，如達(dá)到1.5kg仍不自動放氣，則應(yīng)關(guān)電源，使其停止加熱。（6）冷卻減壓：滅菌時間到后關(guān)掉電源，使其自然冷卻，或間歇放氣數(shù)次，至完全減壓后才可打開鍋蓋，用完后，將鍋內(nèi)的水倒掉，涼干保管。（4）加熱，排放冷空氣：接通電源，使其加熱，待壓力表升至0.全自動高壓滅菌鍋使用方法（參數(shù)設(shè)置）（1）按“POWER”鍵打開儀器電源。（2）按“MODE”鍵選擇消毒模式（瓊脂、普通液體、固體模式）。（3）按“SET/ENT”鍵，用“▲”或“▼”設(shè)置消毒溫度；（4）按“NEXT”鍵，用“▲”或“▼”設(shè)置消毒時間；（5）按“NEXT”鍵，用“▲”或“▼”設(shè)置排氣速率；（6）按“NEXT”鍵，用“▲”或“▼”設(shè)置保溫溫度；（7）按“SET/ENT”鍵保存所設(shè)定的參數(shù)。全自動高壓滅菌鍋使用方法（參數(shù)設(shè)置）（1）按“POWER”鍵使用注意事項（1）使用前必須檢查滅菌腔內(nèi)是否有足夠的水。（2）消毒完后必須等壓力表指示回零后方可開蓋。（3）使用前必須檢查手動排氣旋鈕是否關(guān)閉。（4）長期不使用必須將滅菌腔內(nèi)的水排干。（5）經(jīng)常檢查排氣壺內(nèi)的水是否在安全線內(nèi)。（6）使用專用電源。使用注意事項（1）使用前必須檢查滅菌腔內(nèi)是否有足夠的水。3、超凈工作臺陳列于操作室（接種室）內(nèi)類型：垂直側(cè)流式和水平層流式工作原理：將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器過濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器過濾，由此送出的潔凈氣流以均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，形成無菌的工作環(huán)境作用：無菌操作第一節(jié)3、超凈工作臺陳列于操作室（接種室）內(nèi)第一節(jié)4.消毒器Zeiss濾器、玻璃濾器和微孔濾器。Zeiss濾器為不銹鋼的金屬結(jié)構(gòu)，中間夾有一層石棉制成的一次性纖維濾板。濾板具有一定的厚度，可承受—定的壓力，因此是過濾粘稠液體較理想的濾器。第一節(jié)4.消毒器Zeiss濾器、玻璃濾器和微孔濾器。第一節(jié)Zeiss濾器：抽濾式或加壓式。抽濾式濾器與抽濾瓶相連，真空泵抽氣形成負(fù)壓以過濾液體；加壓式濾器的容器為密閉式，加入待過濾的液體后，通以氣體（常用N2、O2或CO2），形成壓力將液體濾過。Zeiss濾器：抽濾式或加壓式。玻璃濾器為玻璃結(jié)構(gòu)，以燒結(jié)玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上可用于過濾各種培養(yǎng)液體只能采用抽濾式。玻璃濾器為玻璃結(jié)構(gòu)，以燒結(jié)玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上微孔濾膜濾器的基本結(jié)構(gòu)與Zeiss濾器相同，其中間是一次性的特制混合纖維素脂濾膜，可用于各種培養(yǎng)液體的過濾除菌，速度較快，效果較好，有孔徑為0.6μm、0.45μm、0.22μm三種濾膜，用以過濾除菌時，最好使用0.22μm孔徑的濾膜（可以除去細(xì)菌和霉菌）。25微孔濾膜濾器的基本結(jié)構(gòu)與Zeiss濾器相同，其中間是一次性的（二）藥品貯存、配制相關(guān)儀器設(shè)備1、冰箱規(guī)格：4℃，-20℃，-80℃作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。超低溫冰箱第一節(jié)（二）藥品貯存、配制相關(guān)儀器設(shè)備1、冰箱超低溫冰箱第一節(jié)2、天平陳列于制備室中作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑第一節(jié)2、天平陳列于制備室中第一節(jié)3、酸度計陳列于準(zhǔn)備室中作用：測定培養(yǎng)基、酶制劑或緩沖液等的pH值PHS-802中文臺式酸度計第一節(jié)3、酸度計陳列于準(zhǔn)備室中PHS-802中文臺式酸度計第一節(jié)4.純水裝置植物組織培養(yǎng)要求使用高純度的水，進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時，配制各種培養(yǎng)液及試劑等均需使用重蒸餾水，玻璃器皿等的沖洗，也應(yīng)用蒸餾水自動雙重純水蒸餾器，使用方便、安全、蒸餾速度快。這種蒸餾器的使用方法是將經(jīng)金屬蒸餾器蒸餾的蒸餾水加入玻璃蒸餾器內(nèi)進(jìn)行蒸餾。第一節(jié)4.純水裝置植物組織培養(yǎng)要求使用高純度的水，進(jìn)行植物組織培5.離心機(jī)作用：離心洗滌、收集細(xì)胞或原生質(zhì)體、制備細(xì)胞懸液、調(diào)整細(xì)胞密度等低速離心，使用80~100g的離心力即可，太大有時可能引起細(xì)胞的損傷。因此配置4000rpm的國產(chǎn)臺式離心機(jī)，離心速度1000rpm即可。第一節(jié)5.離心機(jī)作用：離心洗滌、收集細(xì)胞或原生質(zhì)體、制備細(xì)胞懸液（三）培養(yǎng)設(shè)備第一節(jié)（三）培養(yǎng)設(shè)備第一節(jié)第一節(jié)1.空調(diào)作用：控制培養(yǎng)溫度2.加濕器和去濕機(jī)作用：控制培養(yǎng)室內(nèi)濕度狀況3.定時器作用：控制光照時間4.培養(yǎng)架作用：盛放培養(yǎng)物第一節(jié)1.空調(diào)3.定時器第一節(jié)第一節(jié)（四）觀察分析儀器設(shè)備倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細(xì)胞活力觀察體視顯微鏡形態(tài)分化的實體觀察激光共聚焦顯微鏡掃描電鏡病毒檢測、細(xì)胞器變化透射電鏡第一節(jié)（四）觀察分析儀器設(shè)備倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察倒置顯微鏡主要用于活體的觀察比如原生質(zhì)體培養(yǎng)的過程原生質(zhì)體融合的動態(tài)過程等第一節(jié)倒置顯微鏡主要用于活體的觀察第一節(jié)正置顯微鏡第一節(jié)正置顯微鏡第一節(jié)相差:

一般在顯微鏡鏡頭上配置相差環(huán)；該方法不要求標(biāo)本染色，用于觀察活體細(xì)胞和微生物最為理想。熒光：一般在顯微鏡鏡體上配置熒光濾片，進(jìn)行熒光蛋白質(zhì)或熒光染色的觀察第一節(jié)相差:一般在顯微鏡鏡頭上配置相差環(huán)；該方法不要求標(biāo)本染色，霍夫曼調(diào)制相襯(HMC)使透明的活體標(biāo)本產(chǎn)生生動、具有三維立體感的圖像。HMC成像技術(shù)中，標(biāo)本可以置于塑料培養(yǎng)皿中觀察。

微分干涉相襯（DIC）未經(jīng)染色的活體細(xì)胞和微生物所觀察到的圖像具有三維浮雕狀的立體感，且對比度和靈敏度出眾。

第一節(jié)霍夫曼調(diào)制相襯(HMC)微分干涉相襯（DIC）第一節(jié)體視顯微鏡（解剖鏡）第一節(jié)立體標(biāo)本或材料的觀察體視顯微鏡（解剖鏡）第一節(jié)立體標(biāo)本或材料的觀察激光共聚焦顯微鏡Confocalmicroscopy第一節(jié)綠色熒光蛋白標(biāo)記目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞中的表達(dá)激光共聚焦顯微鏡第一節(jié)綠色熒光蛋白標(biāo)記目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉掃描電鏡第一節(jié)ABDCEF棉花纖維細(xì)胞的突起及伸長掃描電鏡第一節(jié)ABDCEF棉花纖維細(xì)胞的突起及伸長觀察動植物、微生物細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、核膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體等透射電鏡第一節(jié)體細(xì)胞胚與合子胚超微結(jié)構(gòu)的觀察觀察動植物、微生物細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、核膜、線粒體、三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培養(yǎng)器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等2.分注器類型：注射器式分注器、漏斗式分注器、量筒漏斗式分注器3.其他玻璃儀器燒杯、量筒、移液管、容量瓶、試劑瓶等第一節(jié)三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿第一節(jié)第一節(jié)第一節(jié)（二）.器械類1.鑷子類型：槍式鑷子（接種、轉(zhuǎn)移）、尖頭鑷子2.剪刀類型：大剪刀、小剪刀、彎頭剪刀3.解剖刀類型：固定式和活動式4.接種針用來轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織第一節(jié)本節(jié)完（二）.器械類1.鑷子第一節(jié)本節(jié)完第二節(jié)培養(yǎng)基配制主要內(nèi)容：一、培養(yǎng)基的構(gòu)成二、常用培養(yǎng)基及其特點三、培養(yǎng)基的配制第一章第二節(jié)培養(yǎng)基配制主要內(nèi)容：第一章一、培養(yǎng)基的構(gòu)成（一）水分

類型：蒸餾水作用：構(gòu)成培養(yǎng)基的主要成分第二節(jié)一、培養(yǎng)基的構(gòu)成（一）水分第二節(jié)（二）無機(jī)鹽類

大量元素：氮(N)、磷（P）、鉀（K）、硫（S）、鈣(Ca)、鎂(Mg)微量元素：鐵(Fe)、錳（Mn）、銅（Cu）、鋅(Zn)、硼（B）和鋁（Al）濃度大于0.5mmol/L的元素為大量元素，小于0.5mmol/L的元素為微量元素作用：提供植物生長所需營養(yǎng)元素第二節(jié)（二）無機(jī)鹽類

大量元素：氮(N)、磷（P）、鉀（K）、硫（（三）有機(jī)營養(yǎng)成分---糖類最常用的碳源是蔗糖和葡萄糖使用濃度為2%－5%作為植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓第二節(jié)（三）有機(jī)營養(yǎng)成分---糖類最常用的碳源是蔗糖和葡萄糖第二節(jié)（三）有機(jī)營養(yǎng)成分---維生素硫胺素（VB1）一般認(rèn)為是一種必需的成分吡哆醇（VB6），煙酸（VB3），泛酸鈣（VB5）和肌醇也都能顯著地改善培養(yǎng)的植物組織生長狀況第二節(jié)（三）有機(jī)營養(yǎng)成分---維生素硫胺素（VB1）一般認(rèn)為是一種（四）植物生長調(diào)節(jié)劑

1．生長素

2．細(xì)胞分裂素

3．赤霉素類4.油菜素內(nèi)脂5.乙烯第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑1．生長素第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—生長素生長素影響到植物莖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現(xiàn)象在離體植物組織培養(yǎng)中，生長素被用于誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和根的分化常用的生長素：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）和2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—生長素生長素影響到植物莖和節(jié)間的伸長、其中IBA和NAA廣泛用于生根，并能與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖

2，4-D對于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長非常有效2，4-D+KTIBA+KT第二節(jié)其中IBA和NAA廣泛用于生根，并能與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素影響植物細(xì)胞分裂、頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化等常用的細(xì)胞分裂素有：BAP（芐氨基嘌呤）、6—BA（芐基腺膘呤）、2—ip（異戊烯氨基嘌呤）、KT（激動素，呋喃氨基嘌呤）和ZT（玉米素）第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素影響植物細(xì)胞分裂、（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—赤霉素常用GA3促進(jìn)莖伸長生長誘導(dǎo)開花促進(jìn)雄花分化棉花的胚珠培養(yǎng)第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—赤霉素常用GA3第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—油菜素內(nèi)脂促進(jìn)伸長機(jī)理與生長素類似第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—油菜素內(nèi)脂促進(jìn)伸長第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—乙烯解除休眠調(diào)節(jié)莖伸長生長促進(jìn)根生長及分化促進(jìn)果實成熟第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—乙烯解除休眠第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—脫落酸促進(jìn)休眠抑制生長促進(jìn)氣孔關(guān)閉促進(jìn)脫落第二節(jié)（四）植物生長調(diào)節(jié)劑—脫落酸促進(jìn)休眠第二節(jié)（五）凝固劑瓊脂(agar)是固體培養(yǎng)基的必要成分，瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。新型凝固劑：phytagel第二節(jié)（五）凝固劑瓊脂(agar)是固體培養(yǎng)基的必要成分，瓊脂是（六）天然有機(jī)添加物質(zhì)類型：椰子汁、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥作用：提供有機(jī)營養(yǎng)（七）其他添加物類型：活性炭、Vc等作用：防褐化第二節(jié)（六）天然有機(jī)添加物質(zhì)第二節(jié)（八）抗生素抗生物質(zhì)(antibiotic)，包括青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢霉素等，用量在10—500mg/L之間添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，進(jìn)行選擇培養(yǎng)第二節(jié)（八）抗生素第二節(jié)二、培養(yǎng)基的選擇（一）培養(yǎng)基的基本類型1.含鹽量較高的培養(yǎng)基：種類：MS培養(yǎng)基(1962)、LS培養(yǎng)基、BL培養(yǎng)基、ER培養(yǎng)基（1965）等。特點：無機(jī)鹽濃度高，特別是硝酸根離子、鉀離子和銨離子含量豐富。第二節(jié)二、培養(yǎng)基的選擇（一）培養(yǎng)基的基本類型第二節(jié)2.硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基類型：B5培養(yǎng)基（1968）、N6培養(yǎng)基（1974）、SH培養(yǎng)基。特點：培養(yǎng)基的濃度較高，銨態(tài)氮含量較低，但硝酸鉀和鹽酸硫胺素(VB1)含量較高。第二節(jié)2.硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基類型：B5培養(yǎng)基（1968）、N3.中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基類型：Nitsch培養(yǎng)基（1969）、Miller培養(yǎng)基和H培養(yǎng)基。特點：大量元素含量約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類少但含量較高，維生素種類較多。第二節(jié)3.中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基類型：Nitsch培養(yǎng)基（1964.低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基類型：White培養(yǎng)基（1983）、WS培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基。特點：無機(jī)鹽含量非常低，為MS培養(yǎng)基的1/4左右，有機(jī)成分也很低。第二節(jié)4.低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基類型：White培養(yǎng)基（1983）、（二）基本培養(yǎng)基的選擇ＭＳ培養(yǎng)基：多數(shù)植物，但不適合生長緩慢、對無機(jī)鹽類要求低的植物，尤其是不適合銨鹽高會發(fā)生毒害的植物。第二節(jié)（二）基本培養(yǎng)基的選擇ＭＳ培養(yǎng)基：多數(shù)植物，但不適合生長第二B5培養(yǎng)基：豆類、木本科植物。N6培養(yǎng)基：適合植物的花藥培養(yǎng)。White培養(yǎng)基：應(yīng)用較廣，非常適合生根培養(yǎng)和幼胚培養(yǎng)。WPM培養(yǎng)基：適合木本植物的培養(yǎng)。特點：氮含量比較低。KM8P:原生質(zhì)體培養(yǎng)注意！實際應(yīng)用中要通過試驗篩選。第二節(jié)B5培養(yǎng)基：豆類、木本科植物。注意！實際應(yīng)用中要通過試驗篩三、培養(yǎng)基的配制（一）培養(yǎng)基母液的配制（以MS為例）1.基本培養(yǎng)基母液類型：大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液、維生素母液、肌醇、甘氨酸儲存：各種容量試劑瓶常溫或2~4冰箱倍數(shù)：10X、100X、1000等標(biāo)記：名稱、配制倍數(shù)、日期等。第二節(jié)三、培養(yǎng)基的配制（一）培養(yǎng)基母液的配制（以MS為例）第二節(jié)2.植物生長調(diào)節(jié)劑（1000倍）配制方法：2,4－D、NAA、IAA、IBA、GA3、ZT：先用少量95%酒精溶解后，加水定容。KT、6-BA：用1mol/L的鹽酸溶解后，加水定容。儲存：4度或以下長期保存標(biāo)記：名稱、配制倍數(shù)、日期等。第二節(jié)2.植物生長調(diào)節(jié)劑（1000倍）配制方法：第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)（二）培養(yǎng)基的配制步驟取一干凈燒杯，加入1/3體積的蒸餾水，用移液管量取所需量的母液加入燒杯稱取定量瓊脂加入燒杯中，加熱煮沸攪拌，待瓊脂完全溶解，分裝稱取定量的糖加入燒杯中并不斷攪拌，直到完全溶解，定容用NaOH或稀HCl調(diào)節(jié)pH值高壓滅菌，（121℃，15

min~20min）冷卻，取出，備用第二節(jié)本節(jié)完（二）培養(yǎng)基的配制步驟取一干凈燒杯，加入1/3體積的蒸餾水，第三節(jié)植物組織培養(yǎng)離體操作技術(shù)一、器皿和用具的清洗二、滅菌與消毒三、無菌操作步驟四、無菌培養(yǎng)第一章第三節(jié)植物組織培養(yǎng)離體操作技術(shù)一、器皿和用具的清洗第一章一、器皿和用具的清洗（一）玻璃器皿的清洗（二）塑料器皿的清洗（三）器皿包裝第三節(jié)一、器皿和用具的清洗（一）玻璃器皿的清洗第三節(jié)二、滅菌與消毒（一）滅菌和消毒的種類1.培養(yǎng)基的滅菌2.器皿和用具的滅菌3.外植體的消毒4.接種區(qū)滅菌5.培養(yǎng)環(huán)境消毒第三節(jié)二、滅菌與消毒（一）滅菌和消毒的種類第三節(jié)物理滅菌化學(xué)滅菌高溫高壓滅菌干熱滅菌射線照射滅菌過濾滅菌熏蒸滅菌消毒液滅菌（二）.滅菌方法第三節(jié)物理滅菌化學(xué)滅菌高溫高壓滅菌熏蒸滅菌（二）.滅菌方法第三節(jié)（三）

滅菌原理1.高溫高壓滅菌

原理：將待滅菌的物品放在一個密封的高壓高溫滅菌鍋內(nèi)，在121℃高溫和每平方厘米1個大氣壓下，一般持續(xù)