總RNA提取定量與RTPCR

總RNA的提取、定量與RT-PCR南方醫(yī)科大學生物化學與分子生物學實驗教學示范中心ExpertimentalTeachingCenterofBiochemistryandMolecularBiology總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!完整RNA的提取和純化,是進行RNA方面的研究工作如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。掌握從細胞中提取總RNA的方法熟悉紫外吸收法檢測RNA濃度與純度的原理及測定方法掌握RT-PCR基因擴增的原理和過程目的總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!實驗流程提取原理操作步驟逆轉(zhuǎn)錄原理操作步驟提取總RNA定量合成cDNA鏈原理體系引物選擇PCR電泳原理電泳步驟電泳計算方法操作步驟總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。

關(guān)鍵點總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!原理Trizol是一種新型總RNA抽提試劑其主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，其主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白/核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase?？俁NA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!RNA酶污染來源RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。嚴格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑的污染。最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶：而各種組織和細胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶?？俁NA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!防止RNA酶污染的措施

所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長時間。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。配制的溶液應盡可能用0.1%DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過濾除菌。操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。

設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!操作步驟

樣品處理提取組織RNA時，每50～100mg組織用1mlTrizol試劑對組織進行裂解；懸浮細胞先離心沉淀，每5-10×106個細胞加1mlTrizol后，反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞。

培養(yǎng)貼壁細胞不須消化，可直接用Trizol進行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/ml比例加入。

(注意：勻漿一定要徹底，是提取高質(zhì)量RNA的前提；細胞數(shù)量與Trizol的比例，細胞的數(shù)量不能過多。)實驗材料：人胚胎腎細胞293

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!操作步驟加入等體積異丙醇混勻，4℃放置5-10min。4℃12,000g離心10min，棄上清，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇洗滌RNA沉淀，（切勿觸及沉淀！）溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃12,000g離心5min，盡量棄上清。室溫晾干或真空干燥RNA沉淀5-10min。（注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。）加入10μl無RNase的水，充分震蕩混勻?？俁NA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!

原理：物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應而且物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜

因此不同波長的單色光通過溶液時其光的能量就會被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.紫外光吸收法總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!RNA純品:OD260/OD280≈2.0(1.8～2.0)，OD260/OD230＞2.0

若OD260/OD280小于1.8，說明樣品中還可能含有蛋白質(zhì)或酚，應再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化RNA。若OD260/OD280大于2.0，則提示可能有異硫氰酸殘存或RNA降解。OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。紫外吸收檢測RNA的純度總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!RNA完整性檢測完整的RNA的甲醛電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條帶，并且28S大約是18S的兩倍寬。若兩條帶不明顯,則說明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!RNA降解A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。C.細胞在用胰酶處理時過度。D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染A.樣品勻漿時加的試劑量太少B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇，DMSO等)，強緩沖液或堿性溶液常見問題分析總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。原理總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!隨機六聚體引物：用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA鏈模板，通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復雜性方面均要小。特異性引物：是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。

（二）引物的選擇

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!儀器和主要試劑基因擴增儀、微量加樣槍、滅菌超薄PCR反應管總RNA鏈cDNA合成試劑盒（含有逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、緩沖液）dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mmol/L總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!操作步驟采用TaKaRaPrimeScript

RTreagentkit進行cDNA鏈合成：按下列組分配制RT反應液5XPrimeScripBuffer2.0μl

PrimeScriptRTEnzymeMix0.5μl

OligodTPrimer(50μ

M)0.5μl

Random6mers(100μ

M)0.5μl

TotalRNA6.5μl

總體積10l反轉(zhuǎn)錄反應條件如下37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應）85℃5sec（反轉(zhuǎn)錄酶失活反應）注：反轉(zhuǎn)錄步驟在PCR儀中進行總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!①94℃預變性5分鐘后開始以下循環(huán)②94℃30秒

55℃30秒30循環(huán)

72℃30秒③72℃5分鐘④4℃保溫實驗過程約1小時30分鐘PCR參數(shù)設置總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!

本實驗所擴增的產(chǎn)物DNA片段長度400bp～500bp,可取5l

PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。利用標準DNAmarker評估擴增的特異性。

瓊脂糖凝膠電泳總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!影響遷移速率因素

1、DNA的分子大小

2、瓊脂糖濃度

3、DNA分子的構(gòu)象

4、電源電壓

5、嵌入染料的存在

6、離子強度影響

瓊脂糖凝膠電泳原理有效分離范圍總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!溴化乙錠(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，可與DNA結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,有致癌性.Gelview:是一種新型核酸染料,可與DNA分子形成復合物，能產(chǎn)生極強的熒光信號，其靈敏度比EB高,且熒光強度與DNA含量成正比熒光,在紫外光照射下呈現(xiàn)綠色熒光.常用染料實驗材料總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!凝膠準備膠床準備鋪膠靜置膠床置于電泳槽中加電泳緩沖液拔梳子上樣電泳取出凝膠拍照實驗步驟總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!部分細胞總RNA的提取及定量

ExtractionandQuantitationofCellTotalRNA

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!原理10-5μgRNA/細胞RNA分離的方法：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法；鹽酸胍-有機溶劑法；氯化鋰-尿素法；蛋白酶K-細胞質(zhì)RNA提取法；異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(Trizol法)等。目前常用的是Trizol法。rRNA80-85%：28S18S5StRNA,snRNA10-15%mRNA1-5%總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!在加入氯仿離心后，氯仿比重大，使溶液分為水相、中間層和有機相。RNA在上層水相中，DNA和蛋白質(zhì)位于中間層，有顏色的下層為有機相。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA。原理總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!常用的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯

（DEPC)

是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。異硫氰酸胍

目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白體中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)

從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其他

SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!操作步驟細胞或組織加Trizol（RNAisoPlus）后劇烈振蕩15s，室溫放置5min，使其充分裂解。

（注意：此時可放入-70℃長期保持）按0.2ml氯仿/1mlTrizol加入氯仿(本實驗加100μl)，劇烈振蕩混勻后室溫放置5min。

(注意：此步振蕩非常重要，建議在旋渦振蕩器上進行。)4℃12,000g離心15min。樣品分為三層：底層為黃色（紅或綠）有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用Trizol試劑的60％。吸取上層水相，至另一離心管中。一般400-450μl就足夠了，寧少勿多！

（注：千萬不要吸取中間界面）

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!操作步驟

收集適量細胞，加500μl

Trizol用移液槍反復吹吸，直至裂解液中無明顯沉淀向裂解液中加100μl氯仿4℃,12000g

離心15min吸取上清液200~250μl

至另一新離心管中(切忌吸出白色中間層)向上清中加入等體積異丙醇混勻4℃,12000g

離心10min緩慢沿離心管壁加入500μl75%乙醇4℃,12000g

離心5min小心盡量棄去乙醇加入10μl

RNase-free水溶解沉淀備用室溫靜置5min蓋緊離心管蓋，用手振蕩15s室溫靜置5min上下顛倒離心管充分混勻室溫靜置10min小心棄去上清室溫干燥沉淀2-5min（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）洗滌離心管壁輕輕上下顛倒總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!紫外吸收檢測RNA的濃度RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當于大約40μg/ml的單鏈RNA。用雙蒸水稀釋RNA樣品（1μlRNA+49μl水）倍并以雙蒸水為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度:

RNA(mg/ml)=40×OD260

讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000dsDNA(雙鏈DNA)1OD260=50ug/mlssDNA(單鏈DNA)1OD260=33ug/mlRNA1OD260=40ug/ml總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!常見問題分析RNA得率低：A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。B.RNA沉淀未完全溶解。A260/A280<1.65：A.RNA應使用TEBuffer稀釋后再進行吸光度值的測定。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。B.樣品勻漿時加的試劑量太少。C.勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘。D.吸取水相時混入了有機相。E.RNA沉淀未完全溶解。總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!第二部分逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應

ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。在長時間的逆轉(zhuǎn)錄過程中，不會造成模板的降解，獲得cDNA的幾率大，適用于較長的cDNA鏈的合成。禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH-突變體：商品名為Superscript和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。（一）反轉(zhuǎn)錄酶的選擇

總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!（三）內(nèi)參的設定為了保證實驗結(jié)果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參照基因的特異性引物，同時擴增內(nèi)參DNA，作為對照。常用的內(nèi)參有GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一、各孔間的溫度差等所造成的誤差?？俁NA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!操作步驟采用TaKaRaPrimeScript

RTreagentkit進行cDNA鏈合成：按下列組分配制RT反應液5XPrimeScripBuffer2μl

PrimeScriptRTEnzymeMix0.5μl

OligodTPrimer(50μ

M)0.5μl

Random6mers(100μ

M)0.5μl

RNasefreeH2O1.5ulTotalRNA5μl

反轉(zhuǎn)錄反應條件如下37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應）85℃5sec（反轉(zhuǎn)錄酶失活反應）注：反轉(zhuǎn)錄步驟在PCR儀中進行總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!鏈cDNA2lPerfectShotTaq10l上游引物(10M)1l下游引物(10M)1lRNaseFreeH2O總體積6l20l取0.2mlPCR反應管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑(注意每換一種試劑換一個新吸頭)：

如配好的反應液較多沾到管壁上，可將PCR反應管置臺式離心機中瞬時離心，使反應液集中于管底，然后將反應管放到基因擴增儀(PCR儀)上

.PCR反應體系總RNA提取定量與RTPCR共42頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!PCR反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引