血清球蛋白的分離純化與鑒定詳解演示文稿

血清球蛋白的分離純化與鑒定詳解演示文稿第一頁，共二十二頁。（優(yōu)選）血清球蛋白的分離純化與鑒定第二頁，共二十二頁。二、原理（一）鹽析1.概念和原理鹽析是指溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程。

蛋白質(zhì)在純水中溶解度較低，若稍加一些無機(jī)鹽則溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”(saltin)。而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時(shí)，蛋白質(zhì)又變得不溶而自動(dòng)析出，這種現(xiàn)象稱為“鹽析”(saltout)。

第三頁，共二十二頁?！胞}析”破壞了蛋白質(zhì)作為親水膠體的兩個(gè)穩(wěn)定因素但當(dāng)鹽濃度增加到一定濃度時(shí)，一方面大量的水同鹽分子結(jié)合，使得蛋白質(zhì)沒有足夠的水維持溶解狀態(tài)，破壞了維持蛋白質(zhì)親水膠的水化膜另一方面加入的鹽離子中和了蛋白質(zhì)分子相互排斥的電荷相互聚集沉淀出來表面電荷水化膜第四頁，共二十二頁。2.常用中性鹽：鹽析可用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽，其中運(yùn)用最廣的是硫酸銨。硫酸銨的優(yōu)點(diǎn)

1.在水中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，2.溶解度大，3.溶解度的溫度系數(shù)變化較小，4.硫酸銨價(jià)廉易得，分離效果好，5.性質(zhì)溫和，高濃度時(shí)也不會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。第五頁，共二十二頁。3.鹽濃度計(jì)算各種蛋白質(zhì)“鹽析”出來所需的鹽濃度各異，所需的最小鹽量稱做鹽析濃度。A，GAG↓半飽和(NH4)2SO4飽和(NH4)2SO4A↓血清中清蛋白和球蛋白的分離按體積：

12（50%）；14（25%）第六頁，共二十二頁。(1)飽和硫酸銨溶液法

將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100%或1按體積：

12（50%）；14（25%）(2)固體硫酸銨法可采用直接加入固體硫酸銨的方法。硫酸銨飽和度的計(jì)算第七頁，共二十二頁。離心力(F)等于被離心的物體質(zhì)量與向心加速度的乘積向心加速度=4π2V2r（其中V為每秒的轉(zhuǎn)數(shù)，r為離心半徑，單位cm）F=m

4π2V2r相對(duì)向心加速度=4π2V2rg多少個(gè)g（二）離心(centrifugation)----分離1.離心力第八頁，共二十二頁。2.離心機(jī)分類根據(jù)離心機(jī)的轉(zhuǎn)數(shù)分類可以分為三類

①<5000rpm普通離心機(jī)②5,000-25,000rpm高速離心機(jī)③25,000-10,000rpm超速離心機(jī)因離心時(shí)與空氣摩擦產(chǎn)熱很多，所以高速離心機(jī)有制冷裝置超速離心機(jī)不但有制冷裝置，而且離心室密封真空第九頁，共二十二頁。3.離心機(jī)的使用0.1g50g2000rpmr=12cm配平在對(duì)稱位置重量一致Balancedloadingpatternsfora12-positoncentrifugerotor第十頁，共二十二頁。三、操作2ml血清+2mlPBS逐滴加入飽和(NH4)2SO42ml2→6ml33%棄上清，2mlPBS+1ml飽和(NH4)2SO4

1→3ml33%棄上清，1mlPBS+0.5ml飽和(NH4)2SO4

0.5→1.5ml33%棄上清，洗滌0.5mlPBS溶解↓搖勻

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混勻靜置30min，離心3000rpm10min↓

↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min第十一頁，共二十二頁。層析利用物質(zhì)在固定相（stationaryphase）與流動(dòng)相（mobilephase）之間不同的分配比例，達(dá)到分離待測物質(zhì)的技術(shù)。

(三)層析(chromatography)---純化凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）離子交換層析法（ionexchangechromatography）親和層析法（affinitychromatography）第十二頁，共二十二頁。凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）第十三頁，共二十二頁。葡聚糖凝膠（Sephadex）第十四頁，共二十二頁。離子交換層析法（ionexchangechromatography）第十五頁，共二十二頁。親和層析法（affinitychromatography）第十六頁，共二十二頁。脫鹽常用透析法和凝膠過濾層析法前者的優(yōu)點(diǎn)是透析后樣品終體積較小，但所需時(shí)間較長，且鹽不易除盡凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時(shí)間也明顯縮短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。本實(shí)驗(yàn)中樣品體積較小，凝膠過濾后樣品體積不會(huì)太增加，所以選用凝膠過濾法。第十七頁，共二十二頁。透析(dialysis)第十八頁，共二十二頁。凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）第十九頁，共二十二頁。按流出的時(shí)間收集不同組分第二十頁，共二十二頁。結(jié)果12345678910proteinNH4+11121314151617181920proteinNH4+-

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±++

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第二十一頁，共二十二頁。(四)電泳(electrophoresis)---鑒定帶電粒子在電場中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳血