病毒學(xué)檢驗(yàn) 第二章 雞胚和動(dòng)物接種技術(shù)-2015課件

第二章雞胚和動(dòng)物接種技術(shù)

Chapter2Inoculation

technologyofembryoandanimal2本章內(nèi)容第一節(jié)雞胚接種技術(shù)第二節(jié)動(dòng)物接種技術(shù)第三節(jié)雞胚和動(dòng)物接種技術(shù)在

病毒檢驗(yàn)中的應(yīng)用掌握雞胚接種途徑及方法、病毒的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種途徑和接種方法熟悉雞胚孵育與檢查、雞胚接種所需實(shí)驗(yàn)材料與器械實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)和分組、接種后的觀察等問題了解雞胚的解剖與生理；雞胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種技術(shù)在病毒檢驗(yàn)中的應(yīng)用教學(xué)要求3第一節(jié)雞胚接種技術(shù)

6概況1911年Rous和Murphy首先應(yīng)用雞胚培養(yǎng)研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。1938年Goodpasture和Burnet等應(yīng)用雞胚繁殖病毒、Cox應(yīng)用卵黃囊培養(yǎng)立克次氏體。7雞胚接種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)雞胚為一整體，有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造；雞胚的組織分化程度低，可選擇適當(dāng)途徑接種，病毒易復(fù)制，感染病毒的膜和液體含大量病毒；來源充足，操作簡(jiǎn)單，通常是無菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體。8雞胚接種技術(shù)的缺點(diǎn)通常不產(chǎn)生特異性的感染指征；食入的抗生素會(huì)傳遞給雞胚，使病原體在雞胚中的繁殖受到抑制；某些細(xì)菌和病毒能夠從感染的雞傳遞到雞胚。1012尿囊腔位于絨毛尿囊腔和羊膜之間，胚胎排泄器官；含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸鹽卵黃囊主要營養(yǎng)的儲(chǔ)藏場(chǎng)所，為胚胎提供營養(yǎng)卵白外于卵的銳端，為胚胎發(fā)育晚期提供營養(yǎng)14二、雞胚的孵育和檢查一、受精雞卵的選擇沒有受到病毒和細(xì)菌的污染如新城雞瘟病毒、布氏桿菌等；

培養(yǎng)立克次體和衣原體，不能來自食用抗生素的雞群。二、雞胚的孵育孵育的溫度38℃～39℃孵育的濕度40％～70％翻卵每天180°轉(zhuǎn)動(dòng)雞胚1～2次通風(fēng)排出CO2，吸入O2

雞卵發(fā)育中的胚胎發(fā)育中的胚胎破殼而出的小雞卵白卵黃系帶胚盤1617三、檢卵目的了解雞胚的存活情況，標(biāo)記氣室邊界和胚胎位置；觀察接種后胚胎的狀況觀察內(nèi)容血管是否明顯有無胎動(dòng)絨毛尿囊膜發(fā)育之界線1820二、接種途徑與方法羊膜腔接種：主要用于臨床材料（如患者咽漱液等）分離流感病毒。絨毛尿囊膜接種：常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離；病毒滴定、中和試驗(yàn)。尿囊腔接種：廣泛應(yīng)用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒、新城雞瘟病毒的適應(yīng)和傳代。卵黃囊接種：主要用于蟲媒病毒、衣原體、立克次體等分離和繁殖；抗流感病毒藥物實(shí)驗(yàn)。211、羊膜腔接種分離流感病毒，收獲羊水和尿囊液。羊膜腔接種示意圖解剖與收獲收獲前雞胚須置4℃冰箱6h或過夜，但不能放置時(shí)間過長(zhǎng)(過長(zhǎng)會(huì)引起散黃)。如急于收獲亦可置-20℃冰箱lh左右。預(yù)冷的目的是，將雞胚凍死，使血液凝固，避免收獲時(shí)流出紅細(xì)胞，并同尿囊液的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度下降。病毒通過胚胎機(jī)體后被排泄入尿囊腔，因此當(dāng)羊水過少時(shí)，可用同胚少量尿囊液沖洗羊膜腔并吸取該洗液。242、絨毛尿囊膜接種牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離，可在膜上可形成斑點(diǎn)狀或痘皰狀病灶。病毒滴定，感染性病毒顆粒的數(shù)目可以通過產(chǎn)生的斑和痘的數(shù)目來計(jì)算?？贵w滴定，即在有抗體存在的情況下，痘皰形成受到抑制。26絨毛尿囊膜接種示意圖取卵殼；造人工氣室；接種；消毒；培養(yǎng)。用2.5％的碘酒和75％的酒精分別消毒人工氣室上的卵殼，去除窗孔上的膠布。用剪刀沿人工氣室邊緣將膜剪下，放入加有滅菌生理鹽水的培養(yǎng)皿內(nèi)，觀察病灶形狀或用于傳代，或用50％甘油保存。同時(shí)作無菌培養(yǎng)。27解剖與收獲283.尿囊腔接種流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的傳代。尿囊腔接種示意圖30標(biāo)記氣室和胚胎位置31消毒氣室向上放置雞胚于卵架上；先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋殼所標(biāo)記的位置。打孔在所標(biāo)記注射部位用剪刀尖端打孔；注意用力要穩(wěn)，恰好使蛋殼打通而不傷及殼膜。距氣室底邊0.5cm32接種部位消毒33注入病毒材料用1mL注射器抽取接種物；針頭垂直刺入注射部位1-1.2cm即達(dá)尿囊腔內(nèi)；注入待接種的病毒液：接種量為0.1~0.2mL。34封孔用熔好的石蠟或消毒膠布封閉注射孔。孵育與觀察氣室朝上于37℃溫箱中孵育；以后每天檢卵1~2次。棄去24h內(nèi)的死亡雞胚：機(jī)械損傷、細(xì)菌或霉菌污染等引起。35收集24h后死亡雞胚，置4℃冰箱過夜，以免收獲時(shí)流血;取出冷卻的雞胚，消毒氣室端卵殼表面；用鑷子擊破氣室部卵殼并去除殼膜，撕破絨毛尿囊膜；以眼科鑷鑷住絨毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊液，置無菌容器中保存?zhèn)溆?。一般能尿囊?-10mL。取出雞胚胎，于平皿內(nèi)觀察胚胎有無病理變化，如出血、蜷縮、侏儒胚等。解剖與收獲36收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml374.卵黃囊接種用于蟲媒病毒、衣原體及立克次體等的分離和繁殖。卵黃囊接種示意圖38四、病毒的檢測(cè)（一）無菌試驗(yàn)?zāi)康模鹤C實(shí)雞胚收獲物是否受到細(xì)菌的污染。方法：將雞胚組織或收獲的第一滴液體接種無菌肉湯；

37℃培養(yǎng)36h。結(jié)果判定肉湯清亮透明，說明沒有污染；肉湯混濁，或有菌落出現(xiàn)，說明雞胚被細(xì)菌污染。39（二）檢測(cè)方法直接觀察法絨毛尿囊膜上形成損害或痘皰：如痘類病毒和皰疹病毒。引起雞胚死亡：如新城疫病毒、流行性乙型腦炎病毒。造成雞胚特殊損害和胚胎生長(zhǎng)遲緩，如馬流感病毒。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法血凝和血凝抑制試驗(yàn)：流感病毒補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：腮腺炎病毒其他：PCR等40第二節(jié)動(dòng)物接種技術(shù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（experimentalanimals）是指經(jīng)人工飼養(yǎng)，遺傳背景明確、來源清楚，控制其攜帶的微生物，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、鑒定以及其它科學(xué)實(shí)驗(yàn)的所有動(dòng)物。4243發(fā)現(xiàn)年份發(fā)現(xiàn)人所用動(dòng)物血液循環(huán)1628哈維蛙、蛇、魚、蟹、其他醚麻醉1846瑪?shù)区B類、其他細(xì)菌與疾病的關(guān)系1878科赫牛、羊、其他細(xì)菌致弱用免疫1880巴斯德鳥類狂犬病免疫1885巴斯德鳥類、家兔蟲媒傳播疾病1898史密斯等牛蚊傳播瘧疾1898羅斯鳥類醫(yī)學(xué)科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的關(guān)系44發(fā)現(xiàn)年份發(fā)現(xiàn)人所用動(dòng)物腫瘤的病毒病原1910洛斯雞胰島素1921班定狗休克治療1927博萊羅克狗抗細(xì)菌藥物（百浪多息）1935多麥克小鼠心肺旁道器1953葛明貓小兒麻痹癥疫苗1954索爾克恒河猴變性腦病的病毒病原1965格但斯克猩猩心臟移植1967伯納德狗醫(yī)學(xué)科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的關(guān)系45

登革病毒對(duì)新生乳鼠的致病作用

1-3日齡乳鼠接種病毒6日后，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)體弱、弓背、行動(dòng)遲緩等癥狀。46一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類和基本操作方法（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類按微生物控制分類普通動(dòng)物（CV）、清潔動(dòng)物（CL）、無特定病原體動(dòng)物（SPF）、無菌動(dòng)物（GF）和悉生動(dòng)物（GN）按遺傳學(xué)控制分類近交系、封閉群、突變系、雜交群、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物47按微生物學(xué)控制分類1、普通動(dòng)物一級(jí)動(dòng)物，指不攜帶主要人獸共患病病原和動(dòng)物烈性傳染病病原的動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定；僅供教學(xué)示范及作為預(yù)備試驗(yàn)。482、清潔動(dòng)物二級(jí)動(dòng)物，除不攜帶普通動(dòng)物病原體外，要求不攜帶對(duì)動(dòng)物危害大、對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原體。適用于大多數(shù)教學(xué)和科研實(shí)驗(yàn)。493、無特定病原體動(dòng)物(SPF)三級(jí)動(dòng)物，除普通動(dòng)物、清潔動(dòng)物不得攜帶的病原體外，還要求排除潛在感染或條件致病的病原體。目前國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。50飼養(yǎng)管理：SPF動(dòng)物必須飼養(yǎng)在溫濕度衡定的空氣凈化的屏障系統(tǒng)中，實(shí)行嚴(yán)格的微生物控制。514、無菌動(dòng)物和悉生動(dòng)物四級(jí)動(dòng)物。無菌動(dòng)物要求現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)外的任何部位均檢不出任何微生物和寄生蟲。悉生動(dòng)物又稱已知菌動(dòng)物，是指在無菌動(dòng)物體內(nèi)植入已知微生物的動(dòng)物，必須飼養(yǎng)于隔離系統(tǒng)。52無菌動(dòng)物飼養(yǎng)條件：無菌隔離器。第一代通過無菌手術(shù)剖腹取胎,飼養(yǎng)在無菌隔離器內(nèi)，人工喂乳或保姆代養(yǎng)培育而成。53悉生動(dòng)物飼養(yǎng)條件：無菌隔離器。來源：人為將已知的微生物投給無菌動(dòng)物，使其體內(nèi)帶有已知菌，可分為單菌動(dòng)物、雙菌動(dòng)物和多菌動(dòng)物。54按遺傳學(xué)控制分類1、近交系(inbredstrain)概念：又叫純系，經(jīng)過連續(xù)20代以上全同胞或親子交配培育的動(dòng)物品系。特點(diǎn)基因型相同，表現(xiàn)型一致；對(duì)外來刺激反應(yīng)一致；實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，可比性強(qiáng)。5556

常用近交系小鼠名稱縮寫

品系名縮寫品系名縮寫AKRAKC57BL/10B10BALB/cCC57BRBRCBACBDBA/1D1C3HC3DBA/2D2C57LLHRS/JHRC57BL/6B6STSS57C3H/He系BALB/c系C57BL

582、封閉群(closedcolony)概念：也稱遠(yuǎn)交群，在不從其外部引入新個(gè)體的條件下，以非近親交配方式至少連續(xù)繁殖4代以上生產(chǎn)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群。特點(diǎn)群體遺傳特異性相對(duì)穩(wěn)定；個(gè)體間具有雜合性，存在一定差異。

59常用封閉群的嚙齒類的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明（KM）小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、ICR小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、Hartley豚鼠、大耳白兔和青紫藍(lán)兔等。KM小鼠青紫藍(lán)兔Wistar大鼠603、突變系(mutantstrain)概念：由于遺傳基因發(fā)生突變而具有某些特殊性狀的動(dòng)物，如肥胖癥小鼠、糖尿病小鼠等。BALB/cA-nu1973年丹麥的C.W.Friis在BALB/cA近交系小鼠中發(fā)現(xiàn)自發(fā)性突變的無毛小鼠，該突變小鼠胸腺發(fā)育不良，免疫T細(xì)胞缺失，而培育成了BALB/cA-nu。

61突變系小鼠SCID小鼠裸小鼠624、雜交群概念：又稱異系雜交，是由不同的品系雜交所產(chǎn)生的后代。由兩個(gè)近交系之間交配產(chǎn)生的動(dòng)物稱為雜交一代。特點(diǎn)：雜交一代動(dòng)物遺傳和表型均一性好；生命力、適應(yīng)力和抗病力較近交系動(dòng)物強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)范圍更大。63繁殖方法：將兩個(gè)用于生產(chǎn)雜交一代的親本品系或種群進(jìn)行交配，所得第一代即為F1動(dòng)物。

645、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與基因缺陷動(dòng)物將外源性基因插入生殖細(xì)胞基因組并能正常繁衍的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。采用基因剔除技術(shù)構(gòu)建基因缺陷動(dòng)物，通過刪減單一基因或相關(guān)基因組，研究基因的功能。65二、常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物66（一）小鼠近交系BALB/c、C3H、DBA、C57BL、615、129等。突變系nude、scid、dw、hr等。封閉群KM、ICR、NIH、CFW等。67

1、昆明小鼠(KM)

遠(yuǎn)交群，基因庫大，基因雜合率高。682、BALB/c小鼠

近交系，白化小鼠，血壓較高。易患慢性肺炎。BALB/c白化693、裸鼠

先天性無胸腺的突變系小鼠。

裸鼠是腫瘤研究的常用模型，也可研究病毒感染與特定免疫功能的關(guān)系。704、SCID鼠(severecombinedimmunodeficiency,SCID)

體液免疫和細(xì)胞免疫嚴(yán)重聯(lián)合缺陷的突變系小鼠。缺乏T和B淋巴細(xì)胞免疫功能。目前多用于病毒免疫學(xué)和腫瘤學(xué)的研究。

71（二）豚鼠在免疫學(xué)和病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)中豚鼠可制備補(bǔ)體和抗體及提供紅細(xì)胞做血吸附實(shí)驗(yàn)等。

72（三）家兔免疫學(xué)和病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用動(dòng)物。免疫反應(yīng)靈敏，血清量產(chǎn)生較多；對(duì)許多病毒和致病菌非常敏感，適用于各種微生物學(xué)的研究新西蘭兔青紫藍(lán)兔大耳白兔73三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用基本操作技術(shù)（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的捕捉和固定小鼠74先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠籠或?qū)嶒?yàn)臺(tái)向后拉。75在鼠向前爬行時(shí)，用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚。76將鼠體置于左手心中，把后肢拉直。77以無名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。

7879大鼠80先用右手抓取大鼠尾提起，置于鼠籠或?qū)嶒?yàn)臺(tái)向后拉。81在鼠向前爬行時(shí)，用左手拇指和食指抓住大鼠的兩耳和頸部皮膚。82以無名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。如果大鼠體積太大,可由第二個(gè)人協(xié)助固定后肢。8384豚鼠85先用手掌迅速扣住鼠背。86抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部，

中指和無名指輕輕扣住胸廓。87抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部，

中指和無名指輕輕扣住胸廓。88或像抓取大鼠一樣抓住雙耳和頸背部皮膚。89另一只手托住臀部。90家兔91按住兔子的雙耳和頸背部。92一只手抓住兔子雙耳和頸背部的毛皮提起。93然后另一只手托其臀部，讓其體重的大部分集中在這一只手上。94注意：不能單純抓雙耳或抓提背腹部的毛皮。9596將兔子放入盒式固定器內(nèi)；露出頭部。97（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)和分組1、編號(hào)：區(qū)別實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物打號(hào)法：適用于耳朵較大的動(dòng)物針刺法：適用于大小鼠、豚鼠染色法打孔或剪缺口法98染色法3%-5%苦味酸溶液，可染成黃色。0.5%中性紅或品紅溶液,可染成紅色。99打孔或剪缺口法1002、分組分組應(yīng)按隨機(jī)分配的原則。每組動(dòng)物數(shù)量應(yīng)按實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)短、實(shí)驗(yàn)類型及統(tǒng)計(jì)學(xué)要求而定。為了實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和客觀性，實(shí)驗(yàn)中必須設(shè)置對(duì)照組。101（三）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用的麻醉方法

局部麻醉浸潤麻醉：普魯卡因、利多卡因全身麻醉乙醚吸入、戊巴比妥鈉、氨基甲酸乙酯102（四）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種途徑和接種方法皮下接種103腹腔接種104

以一只手抓取和固定動(dòng)物，使腹部向上，以及使鼠頭稍朝下大約15度角（頭低位）。105用消毒酒精進(jìn)行進(jìn)針部位消毒。106另一只手將注射器針頭于左（或右）小腹部刺入皮下。107靜脈接種108將小鼠放進(jìn)固定器里。109露出尾巴。用45～50℃的溫水浸潤尾部半分鐘或用酒精擦拭使血管擴(kuò)張和使表皮角質(zhì)軟化。110用食指和中指從下面托起尾巴，以無名指和小指夾住尾巴的末梢，大拇指再輕輕按住尾部。111右手持注射器，使針頭與靜脈平行（小于30度角），從尾下四分之一處（約距尾尖2-3厘米）處進(jìn)針。112將兔子放入固定架113先拔去注射部位的被毛；用手指彈動(dòng)或輕揉兔耳，使靜脈充盈；用消毒酒精消毒注射部位。114用一只手的食指和中指托住注射部位的耳緣，

大拇指順勢(shì)按在耳上面固定住兔耳。115另一只手持6號(hào)針頭（連注射器）盡量從靜脈的遠(yuǎn)端刺入。116當(dāng)針頭有回流血時(shí)，移動(dòng)拇指于針頭上以固定針頭。117將藥液以均勻的速度注入；或以均勻的速度抽取血液。118注射（采血）完畢，用消毒棉球（簽）輕輕按住針眼，拔出針頭。119用消毒棉球（棉簽）壓迫針眼片刻止血。120消化道接種121右手持注射器，將灌胃針插入動(dòng)物口中，沿口腔頂壁和咽后壁徐徐插入食道。122鼻腔接種顱內(nèi)接種角膜接種一般性觀察動(dòng)物發(fā)病癥狀情況觀察特殊檢查（一）接種后動(dòng)物觀察123124（二