白蛋白的測(cè)定課件

實(shí)驗(yàn)八溴甲酚綠法測(cè)定血清白蛋白

【目的要求】

1.溴甲酚綠法測(cè)定血清白蛋白含量的實(shí)驗(yàn)原理、關(guān)鍵技術(shù)和特點(diǎn)意義。

2.熟悉穩(wěn)定性試驗(yàn)的基本操作及意義【實(shí)驗(yàn)原理】血清白蛋白在PH4.2的緩沖液中帶正電荷，在有非離子型表面活性劑存在時(shí)，可與帶負(fù)電荷的染料溴甲酚綠（BCG）結(jié)合形成藍(lán)綠色復(fù)合物，在波長(zhǎng)630納米處有光吸收峰，其顏色的深淺與白蛋白濃度成正比，與同樣處理的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較，可求得血清白蛋白含量。實(shí)驗(yàn)試劑1.溴甲酚綠（BCG）貯存液取BCG419mg，用10ml0.1mol/LNaOH溶解，加NaN3100mg，定容至1000mL。貯于棕色瓶備用。如用溴甲酚綠鈉鹽應(yīng)稱取432mg.加水溶解。2.0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.2）分別配制0.1mol/L檸檬酸和檸檬酸鈉溶液，然后按12.3：7.7的體積比例混合。每1000ml混合液加入NaN3100mg。3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液取Brij-3530g,加少量水，60℃水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween-20或Tween-80代替)。4.BCG應(yīng)用液BCG貯存液250ml，0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.2)750ml,30%Brij-358ml(也可以用Tween-208ml或Tween-8010ml代替）混合而成。5.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（10mg/ml)稱取人白蛋白1.00g，用生理鹽水各管混勻后，另取5支試管，按下表操作：混合后以空白管校零，立即比色，比色波長(zhǎng)為620nm，以光密度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)管中的白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。01234生理鹽水(ml)0.20————————上述1~4管標(biāo)準(zhǔn)稀釋液（ml)——0.200.200.200.20BCG應(yīng)用液（ml)5.05.05.05.05.02.血清白蛋白測(cè)定用生理鹽水按1：10的比例稀釋血清，取稀釋后的血清0.2ml加入BCG應(yīng)用液5.0ml混勻后立即同上比色，讀取光密度，并從標(biāo)注曲線上查出相應(yīng)的白蛋白濃度。3.白蛋白/球蛋白比值（A/G比值）用雙縮脲法測(cè)定血清標(biāo)本中的總蛋白濃度，用總蛋白濃度減去白蛋白濃度即得球蛋白濃度，并可求的A/G比值：A/G比值=—————————————白蛋白含量總蛋白含量---白蛋白含量參考值：35~50g/L【臨床意義】1．血清白蛋白濃度增高，常見(jiàn)于嚴(yán)生脫水所致的血漿濃縮2．血清白蛋白濃度降低在臨床上比較重要和常見(jiàn)，通常與總蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要見(jiàn)于大出血和嚴(yán)重的燒傷；慢性降低見(jiàn)于腎病蛋白尿，肝功能損傷，腸道腫瘤及結(jié)核病伴慢性出血，營(yíng)養(yǎng)不良和惡性腫瘤等。血清白蛋白低于20g/L。臨床上出現(xiàn)水腫。3．A/G某些病人可同時(shí)出現(xiàn)白蛋白減少和球蛋白升高的現(xiàn)象，嚴(yán)重者比值可＜1。這種情況稱為A/G比值倒置。4．文獻(xiàn)報(bào)道還有極少見(jiàn)的因白蛋白合成障礙，血清中幾乎沒(méi)有白蛋白的先天性白蛋白缺乏癥?！咀⒁馐马?xiàng)】1．BCG是一種PH指示劑，變色域?yàn)镻H3.8（顯黃色）～5.4（顯藍(lán)綠色），因此控制反應(yīng)液的PH是本法測(cè)定的關(guān)鍵。2．配制BCG試劑也可用其他緩沖液如枸椽酸鹽或乳酸鹽緩沖液。但以琥珀酸緩沖液的校正曲線通過(guò)原點(diǎn)，線性好，靈敏度高，成為首選推薦配方。3．試劑中的Brij-35也可用其他表面活性劑代替，如吐溫20或吐溫80，終濃度為2ml，靈敏度和線性范圍不變。4．當(dāng)白蛋白標(biāo)準(zhǔn)與BCG結(jié)合后，溶液光徑1，在630處測(cè)定的吸光度應(yīng)為0.811±0.035，如達(dá)不到此值，表示靈敏度較差。5．蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)證明，BCG不但與白蛋白呈色，而且與血清中多種蛋白質(zhì)成分呈色，其中以球蛋白、運(yùn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白更為顯著，其反應(yīng)速度較白蛋白稍慢。由于30S內(nèi)呈色對(duì)白蛋白特異，故BCG與血清混合后，在30S內(nèi)讀取吸光度，可明顯減少