胎鼠原代細(xì)胞培養(yǎng)課件

實(shí)驗(yàn)九：細(xì)胞原代培養(yǎng)1、理解細(xì)胞原代培養(yǎng)原理；2、熟悉細(xì)胞原代培養(yǎng)方法與過程，以小鼠胎兒為材料，學(xué)習(xí)細(xì)胞原代培養(yǎng)中常用組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法；3、掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作技術(shù)，并為細(xì)胞傳代培養(yǎng)、細(xì)胞純化和冷凍保存等實(shí)驗(yàn)鑒定基礎(chǔ)。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緦?shí)驗(yàn)原理】

細(xì)胞培養(yǎng)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中最常用的手段之一。可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種。原代培養(yǎng)：將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖。材料：胎鼠或新生鼠試劑：1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清），0.25%胰酶，PBS液，75%酒精?！緝x器、材料與試劑】【實(shí)驗(yàn)步驟】實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1、超凈臺(tái)紫外消毒2、實(shí)驗(yàn)者操作前準(zhǔn)備3、各種所需物品就位A【實(shí)驗(yàn)步驟】

（一）胰酶消化法1、將孕鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡全身浸泡2—3秒鐘（時(shí)間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)。A【實(shí)驗(yàn)步驟】2、超凈臺(tái)內(nèi)，將孕鼠外皮剪開，再將內(nèi)皮剪開，露出子宮，將胚胎和胎膜、胎盤剝離,分離子宮系膜，剪斷子宮角，將子宮小心取出，置于盛有PBS或未添加血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，洗滌3次，棄除表面殘余血跡。【實(shí)驗(yàn)步驟】5、將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有PBS的平皿中，用手術(shù)剪將其剪成小塊（1mm3），再用PBS液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。

F11、加入培養(yǎng)液l—2ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

12、將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。

上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同。

【實(shí)驗(yàn)步驟】【注意事項(xiàng)】1、自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。2、在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。3、凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。常見的錯(cuò)誤操作:明確指出常見的錯(cuò)誤操作禁止在開蓋的滅菌物品上方活動(dòng)禁止兩手在臺(tái)面上交叉取物拿吸管的位置不能過低禁止將打開的滅菌物品拿出超凈臺(tái)吸管頭不能碰到臺(tái)面、培養(yǎng)瓶口外壁等吸管不能混用過早開蓋明確指出常見的錯(cuò)誤操作禁止在開蓋的滅菌物品上方活動(dòng)禁止兩手在臺(tái)