實(shí)驗(yàn)3 凝膠等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)

PAGEPAGE3實(shí)驗(yàn)3凝膠等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)一、原理等電聚焦(isoelectricfocusing)又稱電聚焦(electrofocusing)、聚焦電泳(focusingelectropboresis)等。蛋白質(zhì)(酶)、多肽等兩性電解質(zhì)，其所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量，隨所處環(huán)境的pH而變化環(huán)境pH低于其等電點(diǎn)時(shí)，帶正電荷，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)；環(huán)境pH高于其等電點(diǎn)時(shí)，帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)；當(dāng)環(huán)境的pH等于其等電點(diǎn)時(shí)，則不帶電荷，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。據(jù)此，在電泳系統(tǒng)中創(chuàng)造一個(gè)由陽極至陰極，pH由低到高(即環(huán)境由酸變堿)的連續(xù)而穩(wěn)定pH梯度環(huán)境，那么處在這種系統(tǒng)中具有不同等電點(diǎn)的各種蛋白質(zhì)，將根據(jù)所處環(huán)境pH與其自身等電點(diǎn)的差別，分別帶上正電荷或負(fù)電荷，并向與它們各自的等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H環(huán)境位置處移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)該位置時(shí)即停止移動(dòng)，從而各自焦聚(聚焦)，分別形成一條集中的蛋白質(zhì)區(qū)帶(圖—1)。這種根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同而將它們分離開的電泳方法稱為等電聚焦電泳。電泳后測(cè)定其各種蛋白質(zhì)“聚焦”部位的pH，即可得知它們的等電點(diǎn)。在等電聚焦電泳中，造成環(huán)境由酸至堿逐步變化所用的物質(zhì)是一類兩性電解質(zhì)。它具有依次遞變但相差不大的等電點(diǎn)(p1)，在電場(chǎng)中可以形成逐漸遞變而又連續(xù)的pH梯度。此類物質(zhì)在等電點(diǎn)處具有足夠的緩沖能力，以保證不致受蛋白質(zhì)樣品等兩性物質(zhì)對(duì)pH梯度的影響；在等電點(diǎn)處還具有足夠高的電導(dǎo)，保證電流通過，而且整個(gè)體系的電導(dǎo)均勻，使樣品遷移不受影響，達(dá)到聚焦；這類物質(zhì)還具有不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性，自身化學(xué)性質(zhì)不同于被分離物質(zhì)，分子量也小，當(dāng)電泳后經(jīng)透析等可與被分離物質(zhì)分開。1969年瑞典Vesterberg首先合成這種物質(zhì)，隨即由瑞典LKB公司以Ampholine為商品名供應(yīng)于市。Ampholine是由多乙烯多胺(如三乙烯四胺、五乙烯六胺等)與丙烯酸(不飽酸)進(jìn)行加成反應(yīng)而生成．是一系列含不同比例氨基和羧基的氨基羧酸的混合物。為無色水溶液，含量為40％，分子量300～1000范圍。它的水溶性很好，1％水溶液中的紫外吸收(260nm)很低。商品Ampholine的pH有各種范圍，最寬的為PH3—10，測(cè)定未知樣品的等電點(diǎn)時(shí)，首先用Ampho1ine進(jìn)行初步測(cè)定，根據(jù)測(cè)得的結(jié)果，再選擇合適的pH范圍較窄的Ampho1ine進(jìn)行精確測(cè)定。為防止電泳過程中，因?yàn)閷?duì)流現(xiàn)象使已經(jīng)聚焦的蛋白質(zhì)區(qū)帶再混合，需要一種能抗對(duì)流的介質(zhì)作為電泳支持物。目前常用的有蔗糖、甘油或乙二醇形成的密度梯度；用瓊脂糖、聚丙烯酰胺形成的凝膠及利用親水惰性顆粒，如葡聚糖凝膠、淀粉、濾紙等為支持劑，以凝膠作支持物的稱為凝膠聚焦電泳，這種方法適用于分析分離。其他支持劑適用于制備。等電聚焦電泳的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)分辨率高，可將等電點(diǎn)相差0.0l—0.02pH單位的蛋白質(zhì)分開。(2)不像一般電泳易受擴(kuò)散作用影響，使區(qū)帶越走越寬；聚焦電泳則能抵消擴(kuò)散作用使區(qū)帶越走越窄。(3)由于等電聚焦的作用，很稀的樣品也可以聚焦而濃縮。(4)因?yàn)槭歉鶕?jù)等電點(diǎn)特性分離，所以重復(fù)性好，精確度高，可達(dá)0.01pH單位。其不足之處在于：(1)要求樣品溶液無鹽；因?yàn)辂}會(huì)增大電流量，產(chǎn)生熱量；鹽分子移至兩極時(shí)，將產(chǎn)生酸或堿，中和兩性電解質(zhì)。(2)要求樣品成分在等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定，不適宜用于在等電點(diǎn)時(shí)不溶解或變性的蛋白質(zhì)。等電聚焦電泳具有分離、制備及鑒定蛋白質(zhì)、多肽的多種功能。本實(shí)驗(yàn)以柱狀凝膠等電聚膠等電泳法測(cè)定牛血清清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，以掌握等電聚焦電泳的操作方法。二、試劑及器材(1)兩性電解質(zhì)Ampholine(瑞典Pharmacia公司新產(chǎn)品，稱為Pharmalyte)，pH3-10，濃度40%。(2)丙烯酰胺溶液：稱取丙烯酰胺(Acr)30g，甲叉雙丙烯酰胺(Bis)1.0g，用蒸餾水溶解后定容至l00mL，過濾，4℃貯存。(3)TEMED。(4)1.0％過硫酸銨溶液：臨用時(shí)配制。(5)正極緩沖液：0.2％(V／V)硫酸或磷酸。(6)負(fù)極緩沖液:0.5%(V／V)乙二胺水溶液。(7)固定液：10％（W/V）三氯乙酸。(8)染色液：考馬期亮藍(lán)2.0g以50％甲醇1000m1溶解。使用時(shí)取93m1，加入7.0m1冰醋酸，搖勻即可使用；(9)脫色液：按5份甲醇、5份水和l份冰醋酸混合即可。(10)牛血清清蛋白(生化試劑)，配成10mg／ml的水溶液。(11)電泳儀：100mA，600V。(12)圓盤電泳槽。(13)玻璃管：內(nèi)徑5cm，長(zhǎng)80—100cm。(14)微量進(jìn)樣器(100μL)。(15)7號(hào)(長(zhǎng)10cm)針頭和注射器。三、操作1凝膠制備按表1—l的比例配制7.5％凝膠。吸取丙烯酰胺貯備溶液，過硫酸銨和水于50m1的小燒杯內(nèi)混勻，在真空干燥器中抽氣10min(本實(shí)驗(yàn)將此步省略，并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。然后加入0.3的Ampho1ine、0.1mL牛血清清蛋白待測(cè)樣品和0.1mLTEMED溶液，混勻后立即注入到已準(zhǔn)備好的凝膠管中，膠液加至離管頂部5mm處，在膠面上再覆蓋3mm厚的水層，應(yīng)注意不要讓水破壞膠的表面，室溫下放置20—30min即可聚合。表3-1凝膠工作液配比30%凝膠貯液2.0mL1%過硫酸銨水pH3～10Ampho1ine樣品液TEMED0.4mL5.1mL0.3mL0.1mL0.1mL凝膠一般選用3%～7.5%的濃度。7.5%濃度的凝膠具有較好的機(jī)械強(qiáng)度，又允許15萬以下的球蛋白分子有足夠的遷移率,應(yīng)用較廣。若使用較低濃度的凝膠時(shí)，可在膠中加入0.5%的瓊脂糖，以增加凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。2．點(diǎn)樣根據(jù)等電聚焦的特點(diǎn)，對(duì)樣品的體積和加樣的位置不需嚴(yán)格要求。本實(shí)驗(yàn)采用將樣品直接混入凝膠的加樣方法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單(具體操作見凝膠制備)。樣品的體積可以很大，如每管可加樣0.5mL以上。比較稀的樣品可以不需濃縮，直接加樣。若采用專用等電聚焦電泳槽水平板方法電泳(水平板凝膠做法與板狀聚丙烯酰胺凝膠做法一樣，做好的凝膠板水平放在特制電泳槽中進(jìn)行電泳)，樣品可以點(diǎn)在濾紙片上，把濾紙片放在凝膠表面離陰極端l／3處。等電聚焦的點(diǎn)樣量范圍比較大。柱狀電泳點(diǎn)樣量一般在5一100μg，都能得到滿意的結(jié)果。要提高點(diǎn)樣量應(yīng)該考慮到兩性電解質(zhì)載體的緩沖能力，隨著點(diǎn)樣量的增加，應(yīng)該適當(dāng)提高兩性電解質(zhì)的含量。為觀察聚焦?fàn)顩r，可在樣品中加入聚焦指示劑，如帶紅顏色的肌紅蛋白(pI＝6.7)、細(xì)胞色素C(pI＝10.25)或甲基紅染料(pI＝3.75)，以指示聚焦的進(jìn)展情況。3．電泳吸去凝膠柱表面上的水層，將凝膠管垂直固定于圓盤電泳槽中。于電泳槽下槽加入0.2％的硫酸(或磷酸)作正極；上槽加入0.5％的乙醇胺(或乙二胺)作負(fù)極。打開電源，將電壓恒定為160V，因?yàn)榫劢惯^程是電阻不斷加大的過程，故聚焦電泳過程中，電流將不斷下降，降至穩(wěn)定時(shí)，即表明聚焦已完成，繼續(xù)電泳約30min后，停止電泳，全程約需3-4h。4．剝膠電泳結(jié)束后，取下凝膠管，用水洗去膠管兩端的電極液，按照柱狀電泳剝膠的方法取出膠條，以膠條的正極為“頭”，負(fù)極為“尾’，若膠條的正、負(fù)端不易分清，可用廣泛pH試紙測(cè)定，正極端呈酸性，負(fù)極端呈堿性。剝離后，量出并記錄凝膠的長(zhǎng)度。5．固定、染色和脫色取凝膠條3根，放在固定液中固定3h(或過夜)，然后轉(zhuǎn)移到脫色液中浸泡，換3次溶液；每次10min，浸泡過程中不斷搖動(dòng)，以除去Ampho1ine。量取并記錄漂洗后的膠條長(zhǎng)度。此時(shí)應(yīng)注意不要把膠條折斷或正、負(fù)端弄混。而后把膠條放到染色液中，在室溫下染色45min，取出膠條，用水沖去表面附著的染料，放在脫色液中脫色，不斷搖動(dòng)，并更換3～5次脫色液，待本底顏色脫去，蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰時(shí)，量取并記錄凝膠長(zhǎng)度。以及蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至正極端的距離。6．pH梯度的測(cè)量常用的測(cè)定pH梯度的方法有三種：(1)切段法：將未經(jīng)固定的膠條兩根，按照從正極端(酸性端)到負(fù)極端(堿性端)的順序切成0.5cm長(zhǎng)的區(qū)段，按次放入有標(biāo)號(hào)的、裝有1m1蒸餾水的試管中，浸泡過夜。然后用精密pH試紙測(cè)出每管浸泡液的pH并記錄。有條件的，最好用精密pH計(jì)測(cè)定，可提高測(cè)定的精確度，本實(shí)驗(yàn)采用切段法測(cè)定pH梯度。(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白法：即選擇一系列已知等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚焦電泳，經(jīng)固定、染色、脫色后，測(cè)定各條區(qū)帶到陽極端的距離，各種蛋白質(zhì)所在位置的pH，就是它們各自的等電點(diǎn)。以此為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)知待測(cè)樣品的等電點(diǎn)。(3)表面微電極法：即用表面微電極在膠表面上定點(diǎn)測(cè)定pH。7．結(jié)果測(cè)定(1)pH梯度曲線的制作：以膠條長(zhǎng)度(mm)為橫坐標(biāo)，各區(qū)段對(duì)應(yīng)的pH的平均值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條近似直線的pH梯度曲線。由于測(cè)得的每一管的pH是5mm長(zhǎng)一段凝膠各點(diǎn)pH的平均值，因此作圖時(shí)可把此pH視為5mm小段中心區(qū)的pH，于是第l小段的pH所對(duì)應(yīng)的凝膠條長(zhǎng)度應(yīng)為2.5mm；第2小段的pH所對(duì)應(yīng)的凝膠條長(zhǎng)度應(yīng)為(5×2—2.5)mm；由此類推，第n小段的pH所對(duì)應(yīng)的凝膠條長(zhǎng)度應(yīng)為(5n一2．5)mm。(2)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品等電點(diǎn)的計(jì)算：按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)聚焦部位距凝破柱