毛細(xì)管電泳原理及分析策略課件

毛細(xì)管電泳分離原理及分析策略

毛細(xì)管電泳分離原理及分析策略

貝克曼高效毛細(xì)管電泳儀貝克曼高效毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細(xì)管電泳(CapillaryElectrophoresis,CE)。

毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或和

毛細(xì)管電泳的原理

1裝置

毛細(xì)管數(shù)據(jù)處理電極檢測(cè)器電極試樣緩沖液高壓電源

（可高至30KV）

毛細(xì)管電泳的原理

1裝置

2電泳和電滲

電泳是指在電場(chǎng)作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動(dòng)的現(xiàn)象。電滲是指在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動(dòng)的現(xiàn)象。

2電泳和電滲電泳

2電泳和電滲

電泳行為與特性使用淌度描述

即單位場(chǎng)強(qiáng)(E)下離子的平均電泳速度υ

μep=υ/E實(shí)驗(yàn)中，只發(fā)生電泳時(shí)有效淌度μef=υef﹒

(L/V)=(

l/tm)﹒(L/V)

毛細(xì)管有效長(zhǎng)度遷移時(shí)間毛細(xì)管總長(zhǎng)度電壓

2電泳和電滲電泳

2電泳和電滲

電滲與固液界面的雙電層有著密切的關(guān)系在毛細(xì)管壁雙電層的擴(kuò)散層中的陽離子，相對(duì)于毛細(xì)管壁的負(fù)電荷表面，形成一個(gè)圓筒形的陽離子鞘，在電場(chǎng)作用下，溶劑化了的陽離子，沿滑動(dòng)面與緊密層作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，攜帶著溶劑一起向陰極遷移，便形成了電滲流（electroosmoticflow,EOF）。

2電泳和電滲電滲固液兩相間的總電勢(shì)-熱力學(xué)電勢(shì)-φ0Zeta電勢(shì)-ζ

固液兩相間的總電勢(shì)-熱力學(xué)電勢(shì)-φ0Zeta電勢(shì)-ζ

2電泳和電滲

電滲流的流型特點(diǎn)電滲流HPLC塞流層流

2電泳和電滲電滲流的流型特點(diǎn)

2電泳和電滲

電滲流的表示電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數(shù)表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)電滲流速度毛細(xì)管有效長(zhǎng)度

電滲流流出時(shí)間

電場(chǎng)強(qiáng)度

2電泳和電滲電滲流的表示第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的意義電泳過程中，伴隨著電滲現(xiàn)象電滲流的速度比電泳速度快5－7倍利用電滲流可將正、負(fù)離子或中性分子一起向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時(shí)完成正、負(fù)離子的分離分析電滲流是毛細(xì)管電泳分離的重要參數(shù)控制電滲流的大小和方向，可提高毛細(xì)管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度。

分情況而論第22章毛細(xì)管電泳

2電泳和電滲

改變電滲流的方法改變外加徑向電場(chǎng)改變緩沖液成分和濃度Zeta電勢(shì)改變緩沖液pH加入添加劑改變溫度

粘度

鹽-離子強(qiáng)度表面活性劑μeo正比于Zeta電勢(shì)和介質(zhì)的介電常數(shù)反比于介質(zhì)的黏度Zeta電勢(shì)正比于雙電層厚度和界面有效電荷密度反比于介質(zhì)的介電常數(shù)

2電泳和電滲改變電滲流的方法鹽-離子強(qiáng)度表面活性劑表觀電泳淌度

μap

μap=υap/E

υap為離子的表觀遷移速度

υap=υef+υeo

μap=μef+μeo

2電泳和電滲

表觀電泳淌度μap

μap=υap/E

2電

3分離效率和分離度

分離效率柱效可以用理論塔板數(shù)n表示

n=(μep+μeo)Vl/(2DL)

毛細(xì)管電泳分離的柱效方程

理論塔板高

H=L/n

n=5.54(χ/W?)2實(shí)驗(yàn)上可按上式求出理論塔板數(shù)χ為電泳圖上從起點(diǎn)至電泳峰最大值之間的距離W?為電泳峰的半高峰寬

3分離效率和分離度分離效率

3分離效率和分離度

分離度電泳中兩峰的分離度（Rs），也稱為分辨率，它表示了淌度相近的組分分開的能力，可表達(dá)為

Rs=（n

1/2/4）×（Δυ/υ平）Δυ相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差υ平為兩者的平均速度Δυ/υ平表示分離選擇性n為柱效

3分離效率和分離度分離度分離度計(jì)算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)tm1、tm2分別為兩個(gè)組份的遷移時(shí)間W

為峰底的寬度

3分離效率和分離度

分離度計(jì)算式

3分離效率和分離度

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

區(qū)帶寬度展寬因素

焦耳熱進(jìn)樣電泳擴(kuò)散毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

4區(qū)帶寬度及其展寬因素區(qū)帶寬度展寬因素焦耳熱

細(xì)內(nèi)徑（<100μm），粗外徑的毛細(xì)管柱

溫度輪廓----黏度輪廓----速度輪廓

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

焦耳熱溫度輪廓----黏度輪廓----速度輪廓進(jìn)樣

試樣導(dǎo)入毛細(xì)管柱時(shí)，總有一定的試樣區(qū)帶長(zhǎng)度。細(xì)內(nèi)徑的毛細(xì)管柱時(shí)，進(jìn)樣操作的要求更為嚴(yán)格。一般進(jìn)樣區(qū)帶控制在柱長(zhǎng)的1%電泳擴(kuò)散

試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細(xì)管其它地方的濃度或電阻率不相等時(shí)，因兩個(gè)區(qū)域電場(chǎng)強(qiáng)度的差異，而引起區(qū)帶電分散。μs---μb

峰前展或拖尾？

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

進(jìn)樣峰前展或拖尾？

4區(qū)帶寬度及其展寬因素毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

電泳峰拖尾或變形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用極端pH條件●加入中性鹽或兩性離子化合物●對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理

需要注意：方法也會(huì)抑制或改變電滲流

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

4區(qū)帶寬度及其展寬因素CE分離原理-與模式有關(guān)毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC/MCKC）毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）毛細(xì)管等電聚焦（cIEF）親和毛細(xì)管電泳（ACE）毛細(xì)管電色譜（CEC）CE分離原理-與模式有關(guān)毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）第一章毛細(xì)管區(qū)帶電泳樣品在電解液中泳動(dòng),根據(jù)物質(zhì)的荷/質(zhì)比差異來進(jìn)行分離，比值愈大,跑得愈快第一章毛細(xì)管區(qū)帶電泳樣品在電解液中泳動(dòng),根據(jù)物質(zhì)的荷/質(zhì)比進(jìn)樣方式壓力進(jìn)樣電動(dòng)進(jìn)樣濃縮進(jìn)樣進(jìn)樣方式壓力進(jìn)樣毛細(xì)管種類非涂層毛細(xì)管（裸管）內(nèi)壁涂層毛細(xì)管（涂層管）毛細(xì)管種類非涂層毛細(xì)管（裸管）非涂層毛細(xì)管-電滲流的概念非涂層毛細(xì)管-電滲流的概念-H+高pH低pH-H+高pH低pH電滲流的特點(diǎn)EOF電滲流的特點(diǎn)EOF-+純電泳狀態(tài)-+純電泳狀態(tài)-+EOF電泳+電滲流0tm(min)-+EOF電泳+電滲流0tm(min)電滲流的作用電滲流的作用電滲流的活塞流特點(diǎn)HydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone電滲流的活塞流特點(diǎn)HydrodynamicflowEOFHydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone電滲流的活塞流特點(diǎn)HydrodynamicflowEOFgivesplu電滲流是CE中最大的驅(qū)動(dòng)力來源之一電滲流是CE中最大的驅(qū)動(dòng)力來源之一電滲流的正面及負(fù)面作用正面作用增加分離速度使得正、負(fù)電荷物質(zhì)同時(shí)分離負(fù)面作用減少分離時(shí)間和分離有效距離電滲流的波動(dòng)極大的影響了遷移時(shí)間的重復(fù)性電滲流的正面及負(fù)面作用正面作用負(fù)面作用影響電滲流的因素pH值

pH越高，電滲流越大離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越高，電滲流越小緩沖溶液添加劑離子型表面活性劑、有機(jī)溶劑、環(huán)糊精影響電滲流的因素pH值電滲流隨pH的變化情況電滲流隨pH的變化情況控制電滲流的三個(gè)重要手段采用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響改變pH，從而調(diào)整電滲流的大小。pH<3時(shí)電滲流很低；當(dāng)pH>10以后，電滲流基本不增加添加劑：有機(jī)溶劑可以降低電滲流的大小，從而增加分離的有效距離；表面活性劑可以徹底改變電滲流的方向和大小，主要是在陰離子分析時(shí)使用控制電滲流的三個(gè)重要手段采用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響緩沖溶液的影響和選擇在CE中應(yīng)該根據(jù)以下性質(zhì)來選擇緩沖溶液：在所選的pH范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力；在檢測(cè)波長(zhǎng)處有低的紫外吸收；小的淌度（即大體積、低電荷離子）以降低所產(chǎn)生的電流。那些被稱為生物“優(yōu)良緩沖液”的，如Tris,borate,CAPS等特別有用，因?yàn)檫@些緩沖溶液中的離子一般較大，能夠在較高濃度下使用而不會(huì)產(chǎn)生大的電流，但一個(gè)潛在的缺點(diǎn)是這些大的緩沖離子有強(qiáng)的紫外吸收。緩沖溶液的影響和選擇在CE中應(yīng)該根據(jù)以下性質(zhì)來選擇緩沖溶液：常用的CE緩沖體系磷酸鈉體系寬緩沖范圍硼酸鈉體系高pH范圍Tris-HCl體系低pH范圍醋酸-醋酸銨體系CE/MS常用體系常用的CE緩沖體系磷酸鈉體系寬緩沖范圍CZE分離條件的選擇毛細(xì)管類型--涂層還是非涂層？毛細(xì)管長(zhǎng)度--長(zhǎng)毛細(xì)管還是短毛細(xì)管？緩沖液體系--種類和pH值添加劑類型--甲醇|環(huán)糊精|乙腈檢測(cè)器選擇--紫外|二極管陣列|激光誘導(dǎo)熒光CZE分離條件的選擇毛細(xì)管類型--涂層還是非涂層？緩沖溶液的選擇

可先用磷酸緩沖體系為搜尋基礎(chǔ)，初步確定（最佳）pH范圍后，再進(jìn)一步細(xì)選出更好pH和緩沖試劑。磷酸鹽是毛細(xì)管電泳中最常用的緩沖體系之一，它的紫外吸收低，pH緩沖范圍比較寬（pH=1.5～13），但電導(dǎo)也比較大。緩沖溶液的選擇可先用磷酸緩沖體系為搜尋基礎(chǔ)，初步確定（緩沖溶液及pH值的選擇

研究經(jīng)驗(yàn)表明：對(duì)于蛋白質(zhì)、肽和氨基酸等兩性樣品，采用酸性（pH2）或堿性（pH＞9）分離條件，比較容易得到好的分離結(jié)果；糖類樣品通常在pH=9～11之間能獲得最佳分離；羧酸或其他樣品多在pH=5～9之間選擇分離條件。緩沖溶液及pH值的選擇研究經(jīng)驗(yàn)表明：對(duì)于蛋白質(zhì)、肽和緩沖溶液及pH值的選擇pH的選擇也和所用的毛細(xì)管種類有關(guān)，許多涂層毛細(xì)管只能在一定的pH范圍內(nèi)工作，例如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管，在3＜pH＜8的范圍以外工作，其涂層容易水解失效。緩沖溶液及pH值的選擇pH的選擇也和所用的毛細(xì)管種類緩沖溶液及pH值的選擇在相同的pH下，不同緩沖體系的分離效果不盡相同，有的可能相差甚遠(yuǎn)。一般的經(jīng)驗(yàn)是，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑，有可能就是最好的試劑。一個(gè)典型的例子是，在分離糖類和DNA等分子時(shí)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸緩沖試劑也適用于其他含鄰位羥基或多羥基化合物的分離。緩沖溶液及pH值的選擇在相同的pH下，不同緩沖體系的緩沖溶液及pH值的選擇

緩沖試劑及pH調(diào)節(jié)劑的濃度也需要優(yōu)化。緩沖試劑的濃度一般控制在10～200mmol/L之間。電導(dǎo)率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼砂等，其濃度多控制在20mmol/L附近，而電導(dǎo)小的試劑如硼酸及HEPES等，其濃度可在100mmol/L以上。有時(shí)為了抑制蛋白質(zhì)吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的試劑濃度，此時(shí)要注意減少分離電壓，分析速度自然也將隨之降低。緩沖溶液及pH值的選擇緩沖試劑及pH調(diào)節(jié)劑的濃度也需添加劑的選擇目的：改善分離抑制分析物在毛細(xì)管上的吸附添加劑的選擇目的：添加劑的選擇甲醇|乙腈（5-50%）降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果增加非極性物質(zhì)的水溶性環(huán)糊精|SDS等表面活性劑增加分離選擇性，提高分析效果降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果非極性高分子聚合物掩蔽毛細(xì)管內(nèi)壁電荷，抑制分子吸附降低電滲流形成一定的分子篩，提高分子大小選擇性添加劑的選擇甲醇|乙腈（5-50%）第二章毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜電解質(zhì)中加入表面活性劑(surfactant，例如SDS)，使之形成膠束（Micelle），樣品根據(jù)其疏水性(Hydrophobicity)強(qiáng)弱的差異，在膠束與電解質(zhì)的分配系數(shù)有所不同來進(jìn)行分離

，樣品疏水性愈強(qiáng)，則進(jìn)入膠束的機(jī)會(huì)愈大。通常物質(zhì)進(jìn)入膠束后，泳動(dòng)的速度會(huì)變慢，因此疏水性愈強(qiáng)的物質(zhì)則愈慢出來。第二章毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜電解質(zhì)中加入表面活性劑(su毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜原理毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜原理SDSSDS-+EOFMicellarElectrokineticChromatography(MEKC)-+EOFMicellarElectrokineticC七種青霉素的分離CZE:20mM

Pi-Borate,pH8.5(B)MEKC:0.1MSDSin(A)soln.七種青霉素的分離CZE:20mMPi-Borate,膠束電動(dòng)色譜的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)增加對(duì)弱極性物質(zhì)分離的分離度在中藥分析、天然產(chǎn)物分析、農(nóng)藥分析中經(jīng)常使用缺點(diǎn)穩(wěn)定性不佳，達(dá)到好的重復(fù)性比較困難膠束電動(dòng)色譜的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)第三章毛細(xì)管凝膠電泳

毛細(xì)管內(nèi)先填充凝膠(例如polyacrylamide或cellulose)，此時(shí)凝膠會(huì)在毛細(xì)管內(nèi)形成分子篩，樣品依分子量的大小在毛細(xì)管內(nèi)移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離。主要用于核酸片斷及蛋白分子量分析第三章毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管內(nèi)先填充凝膠(例如poly毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳CE雙鏈及單鏈核酸分析45-寡核苷酸質(zhì)控1.02.03.0123456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS2110.015.0RelativeFluorescenceIntensitydsDNA片段

(72bp-12Kbp)CE雙鏈及單鏈核酸分析45-寡核苷酸質(zhì)控1.02CE-SDS蛋白分子量分析CE-SDS蛋白分子量分析第四章毛細(xì)管等電聚焦第四章毛細(xì)管等電聚焦第五章親和毛細(xì)管電泳

-分離條件基于CZE當(dāng)在CZE樣品或緩沖液中引入抗原或抗體時(shí)，便可以用于研究和分析抗體或抗原，也可以利用這種方法對(duì)電泳峰進(jìn)行特異性定性。顯然除抗原與抗體的選擇需要應(yīng)用生化知識(shí)外，其他方面的選擇與CZE等相同。用于研究分子間相互作用測(cè)定，分子構(gòu)型變化特定物質(zhì)檢測(cè)活性物質(zhì)篩選第五章親和毛細(xì)管電泳

-分離條件基于CZE當(dāng)在CZACE測(cè)定分子間結(jié)合常數(shù)與解離速率JAK2與SH2-B之間的相互作用研究ACE測(cè)定分子間結(jié)合常數(shù)與解離速率JAK2與SH2-B之間的CE藥物篩選CE藥物篩選ACE用于相互作用篩選適體Aptamer類似于抗體，但可以體外合成，結(jié)合常數(shù)比抗體更高，有廣泛的藥物篩選和臨床診斷應(yīng)用潛力目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法篩選得到的IgEHIVtype1reversetranscriptaseThrombinAnti-thrombinIIITaqDNApolymeraseACE用于相互作用篩選適體Aptamer類似于抗體，但可以體ACE用于相互作用篩選傳統(tǒng)篩選方法如親和色譜或者CEC篩選一個(gè)Aptamer需要4-6周而CE只需要幾天就可以了，大大提高了篩選速度--MicroScaleBioseparations2006ACE用于相互作用篩選傳統(tǒng)篩選方法如親和色譜或者CEC篩選一第六章檢測(cè)器選擇小分子檢測(cè)大分子檢測(cè)第六章檢測(cè)器選擇小分子檢測(cè)CE檢測(cè)器種類及性能CE檢測(cè)器種類及性能小分子檢測(cè)有紫外吸收首先選擇二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器無紫外吸收可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，如氨基酸、還原性糖等不可以衍生化的，可采用間接紫外法用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，也可以嘗試電化學(xué)檢測(cè)器有熒光或需要高靈敏度檢測(cè)的可采用LIF檢測(cè)器需要測(cè)定結(jié)構(gòu)或者難以用光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)的，可以考慮質(zhì)譜檢測(cè)小分子檢測(cè)有紫外吸收大分子檢測(cè)蛋白、核酸可以首先選擇紫外檢測(cè)器如果需要高靈敏度檢測(cè)可以采用柱前或者柱上衍生的方法標(biāo)記熒光，然后用LIF檢測(cè)如果需要特異性檢測(cè)，可使用特異性熒光探針，標(biāo)記后再LIF檢測(cè)需要測(cè)定分子量或氨基酸序列，可采用質(zhì)譜檢測(cè)多糖含量較高的多糖可以采用末端吸收法以紫外檢測(cè)器檢測(cè)含量較低的還原性多糖可用衍生試劑標(biāo)記后以LIF、UV的方式檢測(cè)大分子檢測(cè)蛋白、核酸第七章分離條件選擇流程

分離條件的選擇是毛細(xì)管電泳中最重要但也是最難之處。不同的專業(yè)研究工作者可能會(huì)有各自不同的選擇策略和流程，我們提出如下九步選擇流程，僅供參考：第一步，盡可能多地了解分離樣品的類型、來源、組成及其性質(zhì)；第二步，根據(jù)樣品的可能性質(zhì)和來源，選擇分離模式，若無樣品信息可先選CZE；第七章分離條件選擇流程分離條件的選擇是毛條件選擇流程

第三步，根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測(cè)方法，一般先選直接紫外吸收；第四步，確定樣品處理方式，包括衍生方案以及離心過濾除蛋白等；第五步，根據(jù)樣品解離常數(shù)計(jì)算最佳pH，或利用75μmID毛細(xì)管和磷酸緩沖體系確定pH范圍;條件選擇流程第三步，根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測(cè)方法，一條件選擇流程

第六步，根據(jù)所需pH構(gòu)建緩沖體系，包括進(jìn)一步優(yōu)化pH、緩沖試劑濃度等；第七步，優(yōu)化其他操作參數(shù)，如毛細(xì)管尺寸、分離電壓和溫度等；第八步，確定是否需要使用添加劑和使用非水溶劑；第九步，確定是否需要換用其他分離模式。條件選擇流程第六步，根據(jù)所需pH構(gòu)建緩沖體系，包條件選擇流程

在毛細(xì)管電泳條件選擇中，還應(yīng)充分注意下列操作事項(xiàng)：①最好對(duì)樣品和緩沖液進(jìn)行過濾或離心處理。②毛細(xì)管的洗滌或平衡，與緩沖體系、pH以及柱子有關(guān)。磷酸根與石英和玻璃之間存在慢相互作用，需要延長(zhǎng)平衡或沖洗時(shí)間，處理的時(shí)間應(yīng)由分離重現(xiàn)性決定。條件選擇流程在毛細(xì)管電泳條件選擇中，還應(yīng)充分注意下條件選擇流程

③欲降低緩沖液的電導(dǎo)，應(yīng)盡量使用所謂的“生物緩沖試劑”；欲降低檢測(cè)背景，則應(yīng)盡量使用無機(jī)緩沖試劑。④欲保持分離重現(xiàn)，要盡量采用相同的條件，包括毛細(xì)管、緩沖液、溫度、電壓、洗滌等。條件選擇流程③欲降低緩沖液的電導(dǎo)，應(yīng)盡量使用所謂第八章各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)陰離子及有機(jī)酸此類物質(zhì)沒有紫外吸收，要采用間接檢測(cè)法間接紫外法一般以鉻酸鈉等物質(zhì)作為背景吸收物CTAB通常用作電滲流反向劑，以加速出峰，提高峰的尖銳度要使用反向極性分離第八章各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)陰離子及有機(jī)酸各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)陽離子及金屬離子的分離此類物質(zhì)沒有紫外吸收，要采用間接檢測(cè)法間接紫外法一般以氨基吡啶等物質(zhì)作為背景吸收物與陰離子不同的是陽離子的分析不需要在緩沖溶液中添加電滲流反向試劑也不需要使用反向極性分離各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)陽離子及金屬離子的分離各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)易電離有極性的化合物一般采用長(zhǎng)60cm的毛細(xì)管分離的最佳pH在分析物pKa+/-1左右通常不需要添加劑各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)易電離有極性的化合物各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)弱極性物質(zhì)和水溶性差的物質(zhì)（一些中藥成分、農(nóng)藥等）要注意分析物的溶解性，防止在毛細(xì)管中的沉淀通過有機(jī)溶劑的添加，提高分析物在buffer中的溶解度添加SDS，增加溶解度降低樣品中分析物的濃度，延長(zhǎng)ramptime也可以防止分析物的析出各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)弱極性物質(zhì)和水溶性差的物質(zhì)（一些中藥成分、各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)還原性的單糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及其聚合物）通常無紫外和熒光，注意檢測(cè)問題可用APTS等衍生試劑衍生，使其帶上電荷和紫外/熒光基團(tuán)多糖也可以采用末端吸收來檢測(cè)（180-200nm），不需要衍生化處理，但是要盡量采用高pH使得羥基部分電離帶電各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)還原性的單糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)非還原性的單糖、寡糖和多糖很難采用衍生的方法檢測(cè)，通常對(duì)單糖和寡糖采用間接檢測(cè)法對(duì)多糖采用末端吸收的方法來檢測(cè)通常采用高pH使得羥基部分電離帶電高pH緩沖液還有防止多糖在毛細(xì)管內(nèi)壁吸附的作用各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)非還原性的單糖、寡糖和多糖各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)單鏈核苷酸、雙鏈核苷酸片斷及PCR產(chǎn)物容易在毛細(xì)管內(nèi)壁吸附，通常需要使用涂層管或者對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行動(dòng)態(tài)涂層分子篩原理，凝膠的種類和濃度決定了分辨率的最佳范圍和大小各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)單鏈核苷酸、雙鏈核苷酸片斷及PCR產(chǎn)物各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)多肽及蛋白質(zhì)一般來說小的肽段不需要考慮在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附問題對(duì)于大的肽段和蛋白質(zhì)一定要考慮在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附，可采用極端pH和涂層毛細(xì)管的方法來避免吸附在使用極端pH條件的時(shí)候，通常都是用正向電壓分離在使用涂層毛細(xì)管時(shí)通常沒有電滲流，而蛋白是兩性物質(zhì)，需要仔細(xì)考慮使用涂層管時(shí)的分離極性各類物質(zhì)的分離要點(diǎn)多肽及蛋白質(zhì)毛細(xì)管電泳分離原理及分析策略

毛細(xì)管電泳分離原理及分析策略

貝克曼高效毛細(xì)管電泳儀貝克曼高效毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細(xì)管電泳(CapillaryElectrophoresis,CE)。

毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或和

毛細(xì)管電泳的原理

1裝置

毛細(xì)管數(shù)據(jù)處理電極檢測(cè)器電極試樣緩沖液高壓電源

（可高至30KV）

毛細(xì)管電泳的原理

1裝置

2電泳和電滲

電泳是指在電場(chǎng)作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動(dòng)的現(xiàn)象。電滲是指在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動(dòng)的現(xiàn)象。

2電泳和電滲電泳

2電泳和電滲

電泳行為與特性使用淌度描述

即單位場(chǎng)強(qiáng)(E)下離子的平均電泳速度υ

μep=υ/E實(shí)驗(yàn)中，只發(fā)生電泳時(shí)有效淌度μef=υef﹒

(L/V)=(

l/tm)﹒(L/V)

毛細(xì)管有效長(zhǎng)度遷移時(shí)間毛細(xì)管總長(zhǎng)度電壓

2電泳和電滲電泳

2電泳和電滲

電滲與固液界面的雙電層有著密切的關(guān)系在毛細(xì)管壁雙電層的擴(kuò)散層中的陽離子，相對(duì)于毛細(xì)管壁的負(fù)電荷表面，形成一個(gè)圓筒形的陽離子鞘，在電場(chǎng)作用下，溶劑化了的陽離子，沿滑動(dòng)面與緊密層作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，攜帶著溶劑一起向陰極遷移，便形成了電滲流（electroosmoticflow,EOF）。

2電泳和電滲電滲固液兩相間的總電勢(shì)-熱力學(xué)電勢(shì)-φ0Zeta電勢(shì)-ζ

固液兩相間的總電勢(shì)-熱力學(xué)電勢(shì)-φ0Zeta電勢(shì)-ζ

2電泳和電滲

電滲流的流型特點(diǎn)電滲流HPLC塞流層流

2電泳和電滲電滲流的流型特點(diǎn)

2電泳和電滲

電滲流的表示電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數(shù)表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)電滲流速度毛細(xì)管有效長(zhǎng)度

電滲流流出時(shí)間

電場(chǎng)強(qiáng)度

2電泳和電滲電滲流的表示第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的意義電泳過程中，伴隨著電滲現(xiàn)象電滲流的速度比電泳速度快5－7倍利用電滲流可將正、負(fù)離子或中性分子一起向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時(shí)完成正、負(fù)離子的分離分析電滲流是毛細(xì)管電泳分離的重要參數(shù)控制電滲流的大小和方向，可提高毛細(xì)管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度。

分情況而論第22章毛細(xì)管電泳

2電泳和電滲

改變電滲流的方法改變外加徑向電場(chǎng)改變緩沖液成分和濃度Zeta電勢(shì)改變緩沖液pH加入添加劑改變溫度

粘度

鹽-離子強(qiáng)度表面活性劑μeo正比于Zeta電勢(shì)和介質(zhì)的介電常數(shù)反比于介質(zhì)的黏度Zeta電勢(shì)正比于雙電層厚度和界面有效電荷密度反比于介質(zhì)的介電常數(shù)

2電泳和電滲改變電滲流的方法鹽-離子強(qiáng)度表面活性劑表觀電泳淌度

μap

μap=υap/E

υap為離子的表觀遷移速度

υap=υef+υeo

μap=μef+μeo

2電泳和電滲

表觀電泳淌度μap

μap=υap/E

2電

3分離效率和分離度

分離效率柱效可以用理論塔板數(shù)n表示

n=(μep+μeo)Vl/(2DL)

毛細(xì)管電泳分離的柱效方程

理論塔板高

H=L/n

n=5.54(χ/W?)2實(shí)驗(yàn)上可按上式求出理論塔板數(shù)χ為電泳圖上從起點(diǎn)至電泳峰最大值之間的距離W?為電泳峰的半高峰寬

3分離效率和分離度分離效率

3分離效率和分離度

分離度電泳中兩峰的分離度（Rs），也稱為分辨率，它表示了淌度相近的組分分開的能力，可表達(dá)為

Rs=（n

1/2/4）×（Δυ/υ平）Δυ相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差υ平為兩者的平均速度Δυ/υ平表示分離選擇性n為柱效

3分離效率和分離度分離度分離度計(jì)算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)tm1、tm2分別為兩個(gè)組份的遷移時(shí)間W

為峰底的寬度

3分離效率和分離度

分離度計(jì)算式

3分離效率和分離度

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

區(qū)帶寬度展寬因素

焦耳熱進(jìn)樣電泳擴(kuò)散毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

4區(qū)帶寬度及其展寬因素區(qū)帶寬度展寬因素焦耳熱

細(xì)內(nèi)徑（<100μm），粗外徑的毛細(xì)管柱

溫度輪廓----黏度輪廓----速度輪廓

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

焦耳熱溫度輪廓----黏度輪廓----速度輪廓進(jìn)樣

試樣導(dǎo)入毛細(xì)管柱時(shí)，總有一定的試樣區(qū)帶長(zhǎng)度。細(xì)內(nèi)徑的毛細(xì)管柱時(shí)，進(jìn)樣操作的要求更為嚴(yán)格。一般進(jìn)樣區(qū)帶控制在柱長(zhǎng)的1%電泳擴(kuò)散

試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細(xì)管其它地方的濃度或電阻率不相等時(shí)，因兩個(gè)區(qū)域電場(chǎng)強(qiáng)度的差異，而引起區(qū)帶電分散。μs---μb

峰前展或拖尾？

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

進(jìn)樣峰前展或拖尾？

4區(qū)帶寬度及其展寬因素毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

電泳峰拖尾或變形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用極端pH條件●加入中性鹽或兩性離子化合物●對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理

需要注意：方法也會(huì)抑制或改變電滲流

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

4區(qū)帶寬度及其展寬因素CE分離原理-與模式有關(guān)毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC/MCKC）毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）毛細(xì)管等電聚焦（cIEF）親和毛細(xì)管電泳（ACE）毛細(xì)管電色譜（CEC）CE分離原理-與模式有關(guān)毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）第一章毛細(xì)管區(qū)帶電泳樣品在電解液中泳動(dòng),根據(jù)物質(zhì)的荷/質(zhì)比差異來進(jìn)行分離，比值愈大,跑得愈快第一章毛細(xì)管區(qū)帶電泳樣品在電解液中泳動(dòng),根據(jù)物質(zhì)的荷/質(zhì)比進(jìn)樣方式壓力進(jìn)樣電動(dòng)進(jìn)樣濃縮進(jìn)樣進(jìn)樣方式壓力進(jìn)樣毛細(xì)管種類非涂層毛細(xì)管（裸管）內(nèi)壁涂層毛細(xì)管（涂層管）毛細(xì)管種類非涂層毛細(xì)管（裸管）非涂層毛細(xì)管-電滲流的概念非涂層毛細(xì)管-電滲流的概念-H+高pH低pH-H+高pH低pH電滲流的特點(diǎn)EOF電滲流的特點(diǎn)EOF-+純電泳狀態(tài)-+純電泳狀態(tài)-+EOF電泳+電滲流0tm(min)-+EOF電泳+電滲流0tm(min)電滲流的作用電滲流的作用電滲流的活塞流特點(diǎn)HydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone電滲流的活塞流特點(diǎn)HydrodynamicflowEOFHydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone電滲流的活塞流特點(diǎn)HydrodynamicflowEOFgivesplu電滲流是CE中最大的驅(qū)動(dòng)力來源之一電滲流是CE中最大的驅(qū)動(dòng)力來源之一電滲流的正面及負(fù)面作用正面作用增加分離速度使得正、負(fù)電荷物質(zhì)同時(shí)分離負(fù)面作用減少分離時(shí)間和分離有效距離電滲流的波動(dòng)極大的影響了遷移時(shí)間的重復(fù)性電滲流的正面及負(fù)面作用正面作用負(fù)面作用影響電滲流的因素pH值

pH越高，電滲流越大離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越高，電滲流越小緩沖溶液添加劑離子型表面活性劑、有機(jī)溶劑、環(huán)糊精影響電滲流的因素pH值電滲流隨pH的變化情況電滲流隨pH的變化情況控制電滲流的三個(gè)重要手段采用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響改變pH，從而調(diào)整電滲流的大小。pH<3時(shí)電滲流很低；當(dāng)pH>10以后，電滲流基本不增加添加劑：有機(jī)溶劑可以降低電滲流的大小，從而增加分離的有效距離；表面活性劑可以徹底改變電滲流的方向和大小，主要是在陰離子分析時(shí)使用控制電滲流的三個(gè)重要手段采用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響緩沖溶液的影響和選擇在CE中應(yīng)該根據(jù)以下性質(zhì)來選擇緩沖溶液：在所選的pH范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力；在檢測(cè)波長(zhǎng)處有低的紫外吸收；小的淌度（即大體積、低電荷離子）以降低所產(chǎn)生的電流。那些被稱為生物“優(yōu)良緩沖液”的，如Tris,borate,CAPS等特別有用，因?yàn)檫@些緩沖溶液中的離子一般較大，能夠在較高濃度下使用而不會(huì)產(chǎn)生大的電流，但一個(gè)潛在的缺點(diǎn)是這些大的緩沖離子有強(qiáng)的紫外吸收。緩沖溶液的影響和選擇在CE中應(yīng)該根據(jù)以下性質(zhì)來選擇緩沖溶液：常用的CE緩沖體系磷酸鈉體系寬緩沖范圍硼酸鈉體系高pH范圍Tris-HCl體系低pH范圍醋酸-醋酸銨體系CE/MS常用體系常用的CE緩沖體系磷酸鈉體系寬緩沖范圍CZE分離條件的選擇毛細(xì)管類型--涂層還是非涂層？毛細(xì)管長(zhǎng)度--長(zhǎng)毛細(xì)管還是短毛細(xì)管？緩沖液體系--種類和pH值添加劑類型--甲醇|環(huán)糊精|乙腈檢測(cè)器選擇--紫外|二極管陣列|激光誘導(dǎo)熒光CZE分離條件的選擇毛細(xì)管類型--涂層還是非涂層？緩沖溶液的選擇

可先用磷酸緩沖體系為搜尋基礎(chǔ)，初步確定（最佳）pH范圍后，再進(jìn)一步細(xì)選出更好pH和緩沖試劑。磷酸鹽是毛細(xì)管電泳中最常用的緩沖體系之一，它的紫外吸收低，pH緩沖范圍比較寬（pH=1.5～13），但電導(dǎo)也比較大。緩沖溶液的選擇可先用磷酸緩沖體系為搜尋基礎(chǔ)，初步確定（緩沖溶液及pH值的選擇

研究經(jīng)驗(yàn)表明：對(duì)于蛋白質(zhì)、肽和氨基酸等兩性樣品，采用酸性（pH2）或堿性（pH＞9）分離條件，比較容易得到好的分離結(jié)果；糖類樣品通常在pH=9～11之間能獲得最佳分離；羧酸或其他樣品多在pH=5～9之間選擇分離條件。緩沖溶液及pH值的選擇研究經(jīng)驗(yàn)表明：對(duì)于蛋白質(zhì)、肽和緩沖溶液及pH值的選擇pH的選擇也和所用的毛細(xì)管種類有關(guān)，許多涂層毛細(xì)管只能在一定的pH范圍內(nèi)工作，例如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管，在3＜pH＜8的范圍以外工作，其涂層容易水解失效。緩沖溶液及pH值的選擇pH的選擇也和所用的毛細(xì)管種類緩沖溶液及pH值的選擇在相同的pH下，不同緩沖體系的分離效果不盡相同，有的可能相差甚遠(yuǎn)。一般的經(jīng)驗(yàn)是，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑，有可能就是最好的試劑。一個(gè)典型的例子是，在分離糖類和DNA等分子時(shí)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸緩沖試劑也適用于其他含鄰位羥基或多羥基化合物的分離。緩沖溶液及pH值的選擇在相同的pH下，不同緩沖體系的緩沖溶液及pH值的選擇

緩沖試劑及pH調(diào)節(jié)劑的濃度也需要優(yōu)化。緩沖試劑的濃度一般控制在10～200mmol/L之間。電導(dǎo)率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼砂等，其濃度多控制在20mmol/L附近，而電導(dǎo)小的試劑如硼酸及HEPES等，其濃度可在100mmol/L以上。有時(shí)為了抑制蛋白質(zhì)吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的試劑濃度，此時(shí)要注意減少分離電壓，分析速度自然也將隨之降低。緩沖溶液及pH值的選擇緩沖試劑及pH調(diào)節(jié)劑的濃度也需添加劑的選擇目的：改善分離抑制分析物在毛細(xì)管上的吸附添加劑的選擇目的：添加劑的選擇甲醇|乙腈（5-50%）降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果增加非極性物質(zhì)的水溶性環(huán)糊精|SDS等表面活性劑增加分離選擇性，提高分析效果降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果非極性高分子聚合物掩蔽毛細(xì)管內(nèi)壁電荷，抑制分子吸附降低電滲流形成一定的分子篩，提高分子大小選擇性添加劑的選擇甲醇|乙腈（5-50%）第二章毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜電解質(zhì)中加入表面活性劑(surfactant，例如SDS)，使之形成膠束（Micelle），樣品根據(jù)其疏水性(Hydrophobicity)強(qiáng)弱的差異，在膠束與電解質(zhì)的分配系數(shù)有所不同來進(jìn)行分離

，樣品疏水性愈強(qiáng)，則進(jìn)入膠束的機(jī)會(huì)愈大。通常物質(zhì)進(jìn)入膠束后，泳動(dòng)的速度會(huì)變慢，因此疏水性愈強(qiáng)的物質(zhì)則愈慢出來。第二章毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜電解質(zhì)中加入表面活性劑(su毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜原理毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜原理SDSSDS-+EOFMicellarElectrokineticChromatography(MEKC)-+EOFMicellarElectrokineticC七種青霉素的分離CZE:20mM

Pi-Borate,pH8.5(B)MEKC:0.1MSDSin(A)soln.七種青霉素的分離CZE:20mMPi-Borate,膠束電動(dòng)色譜的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)增加對(duì)弱極性物質(zhì)分離的分離度在中藥分析、天然產(chǎn)物分析、農(nóng)藥分析中經(jīng)常使用缺點(diǎn)穩(wěn)定性不佳，達(dá)到好的重復(fù)性比較困難膠束電動(dòng)色譜的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)第三章毛細(xì)管凝膠電泳

毛細(xì)管內(nèi)先填充凝膠(例如polyacrylamide或cellulose)，此時(shí)凝膠會(huì)在毛細(xì)管內(nèi)形成分子篩，樣品依分子量的大小在毛細(xì)管內(nèi)移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離。主要用于核酸片斷及蛋白分子量分析第三章毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管內(nèi)先填充凝膠(例如poly毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳CE雙鏈及單鏈核酸分析45-寡核苷酸質(zhì)控1.02.03.0123456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS2110.015.0RelativeFluorescenceIntensitydsDNA片段

(72bp-12Kbp)CE雙鏈及單鏈核酸分析45-寡核苷酸質(zhì)控1.02CE-SDS蛋白分子量分析CE-SDS蛋白分子量分析第四章毛細(xì)管等電聚焦第四章毛細(xì)管等電聚焦第五章親和毛細(xì)管電泳

-分離條件基于CZE當(dāng)在CZE樣品或緩沖液中引入抗原或抗體時(shí)，便可以用于研究和分析抗體或抗原，也可以利用這種方法對(duì)電泳峰進(jìn)行特異性定性。顯然除抗原與抗體的選擇需要應(yīng)用生化知識(shí)外，其他方面的選擇與CZE等相同。用于研究分子間相互作用測(cè)定，分子構(gòu)型變化特定物質(zhì)檢測(cè)活性物質(zhì)篩選第五章親和毛細(xì)管電泳

-分離條件基于CZE當(dāng)在CZACE測(cè)定分子間結(jié)合常數(shù)與解離速率JAK2與SH2-B之間的相互作用研究ACE測(cè)定分子間結(jié)合常數(shù)與解離速率JAK2與SH2-B之間的CE藥物篩選CE藥物篩選ACE用于相互作用篩選適體Aptamer類似于抗體，但可以體外合成，結(jié)合常數(shù)比抗體更高，有廣泛的藥物篩選和臨床診斷應(yīng)用潛力目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法篩選得到的IgEHIVtype1reversetranscriptaseThrombinAnti-thrombinIIITaqDNApolymeraseACE用于相互作用篩選適體Aptamer類似于抗體，但可以體ACE用于相互作用篩選傳統(tǒng)篩選方法如親和色譜或者CEC篩選一個(gè)Aptamer需要4-6周而CE只需要幾天就可以了，大大提高了篩選速度--MicroScaleBioseparations2006ACE用于相互作用篩選傳統(tǒng)篩選方法如親和色譜或者CEC篩選一第六章檢測(cè)器選擇小分子檢測(cè)大分子檢測(cè)第六章檢測(cè)器選擇小分子檢測(cè)CE檢測(cè)器種類及性能CE檢測(cè)器種類及性能小分子檢測(cè)有紫外吸收首先選擇二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器無紫外吸收可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，如氨基酸、還原性糖等不可以衍生化的，可采用間接紫外法用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，也可以嘗試電化學(xué)檢測(cè)器有熒光或需要高靈敏度檢測(cè)的可采用LIF檢測(cè)器需要測(cè)定結(jié)構(gòu)或者難以用光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)的，可以考慮質(zhì)譜檢測(cè)小分子檢測(cè)有紫外吸收大分子檢測(cè)蛋白、核酸可以首先選擇紫外檢測(cè)器如果需要高靈敏度檢測(cè)可以采用柱前或者柱上衍生的方法標(biāo)記熒光，然后用LIF檢測(cè)如果需要特異性檢測(cè)，可使用特異性熒光探針，標(biāo)記后再LIF檢測(cè)需要測(cè)定分子