2種拮抗云杉梢枯病細(xì)菌的抑菌活性研究

2種拮抗云杉梢枯病細(xì)菌的抑菌活性研究

曹娜祝文博黃麒劉雪峰摘要：用平板對(duì)峙法研究貝萊斯芽胞桿菌（Bacillusvelezensis）和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）對(duì)云杉梢枯病病原菌寄生小穴殼（Dothiorellagregaria）的抑菌活性，測(cè)定2種拮抗菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和不同培養(yǎng)時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵液抑菌活性及其穩(wěn)定性，通過(guò)光學(xué)顯微鏡研究抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，2種拮抗菌對(duì)云杉梢枯病病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率分別為57.50%、56.67%。貝萊斯芽胞桿菌發(fā)酵液0～12h對(duì)病原菌菌絲體抑菌率幾乎為0;24h抑菌率達(dá)到最大56.52%;24～72h，抑菌率處于43.48%～47.83%。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液0～12h對(duì)病原菌菌絲體抑菌率幾乎為0;24h抑菌率達(dá)到最大52.17%;24～60h，抑菌率處于47.83%～52.17%;60～72h，抑菌率有所下降，抑菌率最低為43.48%。2種拮抗菌發(fā)酵液的抑菌活性隨著體積分?jǐn)?shù)的升高而上升。2種無(wú)菌濾液對(duì)溫度不敏感，經(jīng)不同酸堿度處理后抑菌活性下降。通過(guò)顯微鏡觀(guān)察，2種拮抗菌發(fā)酵液能使病原菌菌絲發(fā)生變粗彭大、表面粗糙等形態(tài)變化。Key：貝萊斯芽胞桿菌;甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌;青海云杉;云杉梢枯病;抑菌活性：S763.15

：A

：1006-8023（2021）03-0072-07Abstract：TheplateconfrontationmethodwasusedtostudytheantibacterialactivityofBacillusvelezensisandB.methylotrophicusagainstDothiorellagregaria，andthegrowcurveoftwokindsofantagonisticbacteriaandtheantibacterialactivityofdifferentincubationtimeanddifferentconcentrationweremeasured.andantibacterialmechanismwasstudiedbyopticalmicroscope.TheresultsshowedthattwokindsofantagonisticbacteriahadsignificantinhibitioneffectagainstD.gregariawiththeantibacterialrateof57.50%and56.67%，respectively.TheantibacterialrateofsterileculturefiltrateofB.velezensiswasnearly0from0to12h.Themaximumantibacterialratewas56.52%at24h，andtheantibacterialratewas43.48%-47.83%in24-72h.TheantibacterialrateofsterileculturefiltrateofB.methylotrophicuswasnearly0from0to12h.Themaximumantibacterialratewas52.17%at24h，andtheantibacterialratewas47.83%-52.17%in24-60h.In60-72h，theantibacterialratedecreased，andthelowestwas43.48%.Theantibacterialactivityoftwokindsofantagonisticbacteriasterileculturefiltrateincreasedwiththeincreaseofthevolumefraction.TwokindsofsterileculturefiltratewasnotsensitivetotemperatureandtheantibacterialactivitydecreasedafterdifferentpHtreatment.Underthemicroscope，twokindsofantagonisticbacteriasterileculturefiltratecanmakehyphaecoarsen，bentandenlarged.Keywords：Bacillusvelezensis;B.methylotrophicus;P.crassifoliaKom.;shootblightofPiceaasperataMast;antibacterialactivity0引言青海云杉（PiceacrassifoliaKom.）是松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）的一種珍貴樹(shù)種，為喬木，高度可達(dá)23m，是中國(guó)特有的樹(shù)種，主要分布于我國(guó)祁連山區(qū)、青海、甘肅、寧夏以及內(nèi)蒙古大青山等海拔1600～3800m的地帶[1-5]。該樹(shù)種木材性質(zhì)與云杉相似，高大、通直，結(jié)構(gòu)細(xì)致易加工，具有極高的觀(guān)賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，比如可供建筑、橋梁、家具及木纖維工業(yè)原料等用材。云杉梢枯病病原菌為寄生小穴殼（Dothiorellagregaria），主要侵染青海云杉的嫩梢，導(dǎo)致嫩梢枯死，嚴(yán)重情況會(huì)導(dǎo)致整株死亡，給我國(guó)青海云杉帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。大多病害目前都處于物理防治和化學(xué)防治階段，而化學(xué)防治長(zhǎng)久使用會(huì)給環(huán)境造成極大的危害，為解決這一問(wèn)題，尋找低毒或無(wú)毒的生物防治方法成為了大趨勢(shì)[4-10]。生物防治具有無(wú)毒、無(wú)污染和無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，芽孢桿菌近年也越來(lái)越多地應(yīng)用于對(duì)各種病害的防治中。貝萊斯芽胞桿菌（Bacillusvelezensis）和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）是革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，能產(chǎn)生芽孢，能抑制多種病害，是理想的廣譜生防菌[11-16]。張瓊等[17]用貝萊斯芽胞桿菌防治棉花黃萎病，王蕊等[18]從有機(jī)質(zhì)土壤中選育出一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BFWR11拮抗赤霉菌、灰霉菌和黑曲霉菌，均取得較好的抑制效果。本文主要研究2種芽孢桿菌對(duì)云杉梢枯病的抑菌活性，力求為云杉梢枯病的防治提供更多的參考。1材料與方法1.1供試菌株云杉梢枯病病原菌寄生小穴殼，分離自寧夏南華山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的青海云杉枯梢中。貝萊斯芽胞桿菌菌株（以下簡(jiǎn)稱(chēng)BLS）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株（以下簡(jiǎn)稱(chēng)JY）均分離自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山場(chǎng)部的冷杉葉片中。3者均已分離、純化、鑒定，保存于東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室中。1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min。Luria-Bertani固體培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min。1.3拮抗菌BLS、JY的抑菌活性測(cè)定用平板對(duì)峙法進(jìn)行拮抗菌BLS、JY的抑菌活性測(cè)定。用直徑5mm打孔器，于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的寄生小穴殼菌落邊緣打取菌餅，接于PDA平板中央，在其兩側(cè)距中心15mm處劃線(xiàn)接種拮抗菌，以不接種拮抗菌為對(duì)照，置于恒溫培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)，每組3個(gè)重復(fù)。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。η=（d1-d2）/（d1-5）×100%。式中：η為抑菌率;d1為對(duì)照組菌落直徑;d2為試驗(yàn)組菌落直徑。1.4拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液不同發(fā)酵時(shí)間抑菌活性的測(cè)定挑取拮抗菌BLS、JY的單菌落，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，150r/min，37℃搖床震蕩培養(yǎng)。每2h取樣一次，分別測(cè)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)。取發(fā)酵液，用3層濾紙過(guò)濾，再將濾液于超凈工作臺(tái)中過(guò)0.22μm的濾膜，得到2種拮抗菌的無(wú)菌濾液，每12h取樣一次，分別測(cè)2種拮抗菌無(wú)菌濾液對(duì)寄生小穴殼的抑菌活性。分別比較2種拮抗菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和抑菌活性隨時(shí)間變化的關(guān)系，以及抑菌活性物質(zhì)積累的最佳培養(yǎng)時(shí)間，以未接菌的LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照。1.5拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液不同體積分?jǐn)?shù)抑菌活性的測(cè)定取搖培24h的2種無(wú)菌濾液，混于50℃的PDA中，分別制成1%、10%、20%、30%、40%、50%體積分?jǐn)?shù)的帶藥平板，用直徑5mm的打孔器，于培養(yǎng)3d的寄生小穴殼菌落邊緣打取菌餅，接種于帶藥平板的中央，每組3個(gè)重復(fù)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，測(cè)菌絲直徑，計(jì)算抑菌率。1.6拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性的測(cè)定酸堿處理對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響：取5份相同體積的BLS、JY無(wú)菌濾液，分別用1mol/LHCl和1mol/LNaOH將無(wú)菌濾液的pH調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9，靜置2h后再將pH調(diào)至7，過(guò)0.22μm的濾膜[19]，以未處理的無(wú)菌濾液為對(duì)照，測(cè)抑菌活性，每組3個(gè)重復(fù)。熱處理對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響：分別取5份相同體積的BLS、JY無(wú)菌濾液，分別用0、20、40、60、80℃水浴鍋處理30min[19]，以未處理的無(wú)菌濾液為對(duì)照，測(cè)抑菌活性，每組3個(gè)重復(fù)。1.7拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液對(duì)寄生小穴殼菌絲生長(zhǎng)的影響用直徑5mm的打孔器，于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的寄生小穴殼菌落邊緣打取菌餅，接種于分別加入體積分?jǐn)?shù)50%的BLS、JY發(fā)酵液的PDA平板中央，以加入體積分?jǐn)?shù)50%的LB液體培養(yǎng)基的PDA平板為對(duì)照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，挑取菌落邊緣菌絲，制成水載片，在顯微鏡下觀(guān)察菌絲形態(tài)特征。2結(jié)果與分析2.1拮抗菌BLS、JY對(duì)寄生小穴殼的抑制作用通過(guò)平板對(duì)峙的結(jié)果可以觀(guān)察到：2種拮抗菌BLS、JY菌體均對(duì)寄生小穴殼的生長(zhǎng)有抑制作用。抑菌率分別為57.50%±1.44%、56.67%±2.36%。如圖1所示。2.2拮抗菌BLS、JY的生長(zhǎng)曲線(xiàn)及抑菌活性隨時(shí)間的變化對(duì)拮抗菌BLS進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定，以求反映出菌體的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果如圖2所示。拮抗菌BLS在0～4h為遲緩期，4～26h為對(duì)數(shù)期，26h后進(jìn)入穩(wěn)定期，48h后進(jìn)入衰亡期。對(duì)每12h的BLS無(wú)菌濾液進(jìn)行抑菌效果測(cè)定，結(jié)果表明，0～12h時(shí)間段內(nèi)BLS無(wú)菌濾液對(duì)寄生小穴殼幾乎無(wú)抑制作用，抑菌率為0;在24h時(shí)，抑菌率達(dá)到最大;24～72h，抑菌率有所下降;72h時(shí)抑菌率最低。此結(jié)果表示，BLS無(wú)菌濾液在不同時(shí)間段里抑菌效果差異顯著（P<0.05）。對(duì)拮抗菌JY進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。拮抗菌JY在0～4h為遲緩期，4～36h為對(duì)數(shù)期，36h后進(jìn)入穩(wěn)定期，48h后進(jìn)入衰亡期。對(duì)每12h的JY無(wú)菌濾液進(jìn)行抑菌效果測(cè)定，結(jié)果表明，0～12h時(shí)間段內(nèi)JY無(wú)菌濾液對(duì)寄生小穴殼無(wú)抑制作用，抑菌率為0;在24h時(shí)，抑菌率達(dá)到最大;24～72h，抑菌率均有所下降。此結(jié)果表示，JY無(wú)菌濾液在不同時(shí)間段里抑菌效果差異顯著（P<0.05）。2.3拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液不同體積分?jǐn)?shù)的抑菌活性拮抗菌BLS不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液無(wú)菌濾液，對(duì)寄生小穴殼菌絲的抑菌活性如圖4所示。隨著發(fā)酵液無(wú)菌濾液體積分?jǐn)?shù)的上升，對(duì)病原菌的抑菌活性明顯升高。其中體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，抑菌效果最好，抑菌率為70.37%±2.62%。拮抗菌JY不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液無(wú)菌濾液，對(duì)寄生小穴殼菌絲的抑菌活性如圖5所示。隨著發(fā)酵液無(wú)菌濾液體積分?jǐn)?shù)的上升，對(duì)病原菌的抑菌活性明顯升高。其中體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，抑菌效果最好，抑菌率為68.52%±2.62%。2.4拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液抑菌活性的穩(wěn)定性2種拮抗菌的發(fā)酵液，經(jīng)不同酸堿度處理后，對(duì)寄生小穴殼菌絲生長(zhǎng)的抑制作用均有所減弱，差異顯著;經(jīng)0、20、40、60、80℃水浴鍋處理30min后，BLS對(duì)寄生小穴殼菌絲生長(zhǎng)的抑制作用變化顯著，JY對(duì)寄生小穴殼菌絲生長(zhǎng)的抑制作用變化不顯著。如圖6和圖7所示。2.5拮抗菌BLS、JY發(fā)酵液無(wú)菌濾液處理后寄生小穴殼菌絲的變化經(jīng)2種發(fā)酵液處理后，病原菌分別出現(xiàn)菌絲變粗彭大、表面粗糙的變化。說(shuō)明2種拮抗菌發(fā)酵液對(duì)寄生小穴殼菌絲的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。如圖8所示。3結(jié)論與討論在本研究中，2種拮抗菌發(fā)酵液對(duì)云杉梢枯病病原菌寄生小穴殼（D.gregaria）的菌絲均有抑制作用，最大抑菌率分別為57.50%±1.44%、56.67%±2.36%，且在發(fā)酵24h時(shí)抑菌效果最佳。這說(shuō)明了在2種拮抗菌的發(fā)酵過(guò)程中，確實(shí)都產(chǎn)生了能夠抑制寄生小穴殼菌絲生長(zhǎng)的次生代謝產(chǎn)物。由此可得，2種拮抗菌發(fā)酵后，對(duì)于抑制云杉梢枯病病原菌寄生小穴殼具有極高的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)對(duì)2種拮抗菌的拮抗作用和抑菌活性進(jìn)行了研究，體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，2種拮抗菌抑菌效果最好，抑菌率分別為70.37%±2.62%、68.52%±2.62%，這為下一步抑菌活性物質(zhì)的提取鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化和田間防治等提供了良好的基礎(chǔ)。2種拮抗菌的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)酸堿、熱等處理，均具有較好的穩(wěn)定性，這為未來(lái)研發(fā)為生物制劑提供了良好的依據(jù)。通過(guò)顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，分別經(jīng)2種拮抗菌發(fā)酵液處理后的病原菌，菌絲發(fā)生了變粗彭大、表面變粗糙等變化。具體的抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。使用生物防治不僅有無(wú)毒無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)，還具有無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，是未來(lái)病害防治必然要采取的措施之一，貝萊斯芽胞桿菌和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)林木病害的防治具有廣譜性，對(duì)多種病害都有抑制作用，如趙昱榕等[20]用從黃瓜植株體內(nèi)分離鑒定出的貝萊斯芽胞桿菌（B.velezensis）抑制多主棒孢菌（Corynesporacassiicola）。本研究中使用貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）分別拮抗云杉梢枯病的病原菌寄生小穴殼（D.gregaria），均取得較好的抑菌效果。在國(guó)內(nèi)，尚比較少見(jiàn)用這2種拮抗菌拮抗云杉梢枯病的相關(guān)報(bào)道，以期本研究能為云杉梢枯病的防治提供更多的依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]許秀蘭，張巖，楊春琳，等.云杉葉疫病根球殼孢菌的分子檢測(cè)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，42（1）：70-74.XUXL，ZHANGY，YANGCL，etal.RapidmoleculardetectionofspruceneedleblightcausedbyRhizosphaerakalkhoffii[J].JournalofHunanAgriculturalUniversity（NaturalSciences），2016，42（1）：70-74.[2]羅建勛，左林.云杉人工林材性變異的初步研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，29（3）：29-34.LUOJX，ZUOL.ApreliminarystudyonvariationpatternofwoodnatureforPiceaasperataplantationSichuanPiceaasperataPulpwoodCooperationGroup[J].JournalofNorthwestA&FUniversity（NaturalScienceEdition），2001，29（3）：29-34.[3]羅建勛，李曉清，孫鵬，等.云杉天然群體的表型變異[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，31（1）：9-11.LUOJX，LIXQ，SUNP，etal.PhenotypicvariationinnaturalpopulationofPiceaasperata[J].JournalofNortheastForestryUniversity，2003，31（1）：9-11.[4]WUZQ，F(xiàn)ANXL，YANGT，etal.NewrecordofSetomelanommaholmiionPiceacrassifoliainChinabasedonmorphologicalandmoleculardata[J].Mycotaxon，2014，128（1）：105-111.[5]馬艷芳，張永強(qiáng)，馬慧.9種殺菌劑對(duì)青海云杉梢枯病田間防治試驗(yàn)[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2015，58（7）：54-55.MAYF，ZHANGYQ，MAH.FieldexperimentoncontroloftipblightofQinghaisprucewith9kindsoffungicides[J].PracticalForestryTechnology，2015，58（7）：54-55.[6]趙曉陽(yáng)，馬艷芳，常承秀，等.云杉梢枯病的危險(xiǎn)性分析和風(fēng)險(xiǎn)管理[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2017，46（3）：122.ZHAOXY，MAYF，CHANGCX，etal.DangerousnessanalysisandriskmanagementofSetomelanommaholmii[J].XiandaiNongyeKeji，2017，46（3）：122.[7]蘇開(kāi)君，譚松山，鄧群.國(guó)外松枯梢病癥狀和病原的研究[J].森林病蟲(chóng)通訊，1991，10（1）：2-5.SUKJ，TANSS，DENGQ.Studiesonthesymptomsandpathogensofpineshootblightabroad[J].CommunicationofForestDiseasesandInsectPests，1991，10（1）：2-5.[8]姚遠(yuǎn)，郭德軍.云杉枯梢病的初步研究[J].防護(hù)林科技，1997，15（1）：26-27.YAOY，GUODJ.Apreliminarystudyonshootblightofspruce[J].ProtectionForestScienceandTechnology，1997，15（1）：26-27.[9]高智輝，趙龍，王云果，等.白龍江林區(qū)森林病害調(diào)查[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22（5）：124-127.GAOZH，ZHAOL，WANGYG，etal.AsurveyonforestdiseasesintheBailongjiangriver[J].JournalofNorthwestForestryUniversity，2007，22（5）：124-127.[10]楊永禮.小金林區(qū)云杉枯梢原因及防治的研究[J].中國(guó)森林病蟲(chóng)，1988，7（4）：1.YANGYL.StudyonthecauseandcontrolofspruceshootwitheringinXiaojinforestarea[J].ForestPestandDisease，1988，7（4）：1.[11]萬(wàn)丹丹，王雪寧.甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌在植物病害上的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].科技經(jīng)濟(jì)導(dǎo)刊，2020，28（7）：145.WANDD，WANGXN.ResearchprogressontheapplicationofBacillusmethylotrophicusinplantdiseases[J].GuidetoScience，TechnologyandEconomy，2020，28（7）：145.[12]FERNANDOWGD，NAKKEERANS，ZHANGY，etal.BiologicalcontrolofSclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBarybyPseudomonasandBacillusspeciesoncanolapetals[J].CropProtection，2007，26（2）：100-107.[13]GROVERM，NAINL，SINGHSB，etal.MolecularandbiochemicalapproachesforcharacterizationofantifungaltraitofapotentbiocontrolagentBacillussubtilisRP24[J].CurrentMicrobiology，2010，60（2）：99-106.[14]蔡高磊，張凡，歐陽(yáng)友香，等.貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）研究進(jìn)展[J].北方園藝，2018，42（12）：162-167.CAIGL，ZHANGF，OUYANGYX，etal.ResearchprogressonBacillusvelezensis[J].NorthernHorticulture，2018，42（12）：162-167.[15]王雨，譚崢，韋丹丹，等.貝萊斯芽胞桿菌HN-2的鑒定及對(duì)杧果炭疽菌的抑菌活性研究[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2020，36（2）：220-230.WANGY，TANZ，WEIDD，etal.IdentificationofBacillusHN-2andanalysisofitsantifungalproperties[J].ChineseJournalofBiologicalControl，2020，36（2）：220-230.[16]何偉，羅文芳，許建軍，等.貝萊斯芽胞桿菌JTB8—2的篩選、鑒定及其對(duì)瓜列當(dāng)拮抗作用研究[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2020，36（5）：786-794.HEW，LUOWF，XUJJ，etal.Screening，identificationandantagonisticeffectofBacillusvelez