分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)答案

（S目的基因能夠表達(dá)的載體。粒有復(fù)雜的構(gòu)成，為的是控制目標(biāo)蛋白的表達(dá)，如各種啟動(dòng)子（7，調(diào)節(jié)子（）等，pET為代表的表達(dá)載體在菌體內(nèi)都是低拷貝的，防止?jié)B漏表達(dá)。----克隆載體一般是原核細(xì)菌將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接在導(dǎo)入原核細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒會(huì)在原核細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制形成大量的基因克隆被克隆的基因不一定會(huì)表達(dá)但一定被大量復(fù)制而表達(dá)載體是一些用于工程生產(chǎn)的細(xì)菌他們被導(dǎo)入目標(biāo)基因這些目標(biāo)基因會(huì)在此類細(xì)菌中得到表達(dá)生產(chǎn)出我們需要的產(chǎn)物導(dǎo)入的基因是有克隆載體產(chǎn)出的.酶切片斷的回收與連接時(shí)有哪些注意事項(xiàng)DNADNA片段是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們就可以用相對(duì)比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點(diǎn)樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減DNA的濃度,DNA濃度不夠,想膠小點(diǎn)DNADNADNADNA回收效率pHpH結(jié)合DNApH太高，應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整；漂洗液中未pHNaOHpH值，以增加洗脫得率。⑥洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會(huì)影響后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見回收效率低的解決方案。⑦不可以使用更小洗脫體積（小于說明書提供的最小洗脫體積）進(jìn)行洗脫以提高濃度，因?yàn)檎f明書提供的最少洗DNA⑨瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質(zhì)量不好；含目的片段的凝膠再空氣中放置過久，使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保存在4℃或-20的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。雙酶切連接反應(yīng)的注意要點(diǎn)雙酶切12必否則就可能造成酶切失敗。PCRPCR=1100.03pmol0.3pmolpmolDNA?gDNAXbp×650/1,000,000bp×650DNA?g,也可以直接用.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如載體是5380bp則0.03pmol為0.03×5.38×0.66=0.106524?g。3、雙酶切時(shí)間及其體系其實(shí)完一般酶切3對(duì)于PCR產(chǎn)物不宜過大會(huì)影響質(zhì)粒和酶的碰撞機(jī)會(huì)效果降低質(zhì)粒量不應(yīng)該超過酶切要求的最大量1U15-20ul1ugDNA。、兩種酶切的條件不同時(shí)分別進(jìn)行兩次酶切切完一個(gè)純化后再切溫度要求不同先酶切低溫要求的再酶切高溫要求的若鹽濃度要求不同先酶切低鹽濃度要求的再酶切高鹽濃度要求的。5TETEEDTA影響酶可放大酶切體積或重新濃縮質(zhì)粒。6、限制酶的選擇非常重要提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER公用BUFFER在各個(gè)酶的兩邊加上保護(hù)堿基。7、純化問題純化PCR影PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。、酶量的問題以TAKARA150μl301小時(shí)1μg的λDNA1(U)15/微升15μg的DNA1-4ml菌液提出的DNA3μgPCR503μg只要純化的質(zhì)量好酶切完全切得動(dòng)。9、酶切、回收后的PCR摩爾比PCR=1100.03pmol0.3pmol。pmol為單位的DNA?gDNAXbp×650/1,000,000bp×650是該雙鏈DNA的分子量所得數(shù)值即為?g,.1pmol1000bpDNA=0.66μg,5380bp0.03pmol0.03×5.38×0.66=0.106524?gDNA濃度OD1.8-2.0.另外MARKER進(jìn)MARKER20005微升的MARKER10TAKARA的連接酶上的說明寫的過夜在20μl的連接反應(yīng)體系中6μgλDNA-HindIII1630DNA片段被連1U350U/μl3個(gè)小時(shí)足已。11、雙酶切時(shí)如果兩種酶反應(yīng)溫度一致而buffer可查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer如果有一種buffer能同時(shí)使2種酶的活力都超過就可以用這種buffer作為反應(yīng)buffer如果兩種酶廠家不同無法查時(shí)可比較其buffer任何時(shí)候2種酶的總量不能超過反應(yīng)體系而且最大反應(yīng)體系最好不要小于20ul。如果2buffer成份相差較大或2種酶的反應(yīng)溫度不同則必須分別做酶切。第1熱等方法使酶失活后再進(jìn)行下一次酶切反應(yīng)CIAP有的則不行。12、第一次酶切后通過電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA后直接用PCR加入適量再加幾ddH2OeppendorfDNA片段離下來做下一次酶切。注意事項(xiàng)1、做轉(zhuǎn)化的時(shí)候,進(jìn)行酶連接反應(yīng)時(shí),注意保持低溫狀態(tài),LIGASE,3,16AMP-RESISTENCE注意加AMP,,我的方法是培基高烤箱一般溫度為55-60度鋪板前后注意用吹風(fēng)機(jī)吹干。3、對(duì)照的設(shè)立,:酶兩管用同一種BUFFER,,.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.做轉(zhuǎn)化時(shí),也要進(jìn)行對(duì)照。1)即拿雙酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物也進(jìn)行連接反應(yīng),這個(gè)對(duì)照可進(jìn)一步看雙酶切是否成功,如果長出克隆,說明很有可能只進(jìn)行了單酶切,如沒長出克隆,則證明雙酶切成功,當(dāng)然要保證感受態(tài),培基,連接酶都'正常'的情況下。2)酶,的原始質(zhì)粒。3)4)AMP陰性板上20.一步一個(gè)腳印.不要偷懶,圖省事最后卻更費(fèi)事.注意設(shè)立對(duì)照。4、同步雙酶切是一種省時(shí)省力的NEB每一種酶都隨酶NEBuffer100%NEBuffer的組成及內(nèi)切酶在不同緩沖液因此使用時(shí)可根據(jù)每種酶在非最優(yōu)緩沖液中的具體活性相應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時(shí)間。5、如果找不到一種可以同時(shí)適合兩種酶的緩沖液鹽濃度低的酶開始酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求然后加入第二種酶完成雙酶切反應(yīng)。采用標(biāo)準(zhǔn)緩沖