DB51∕T 2910-2022 鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術(shù)規(guī)程

DB51ICS65.150CCSB52四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB51/T2910—2022鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術(shù)規(guī)程TechnicalspecificationforthediagnosisofPlesiomonasshigelloidesforsturgeon2022-05-20發(fā)布2022-07-01實(shí)施DB51/T2910-2022目次前言.................................................................................II1范圍.................................................................................12規(guī)范性引用文件......................................................................13術(shù)語和定義..........................................................................14試劑和材料..........................................................................15設(shè)備與器械..........................................................................26臨床檢查............................................................................27實(shí)驗(yàn)室樣品采集......................................................................28細(xì)菌分離與純化......................................................................29細(xì)菌鑒定............................................................................210結(jié)果判定...........................................................................411綜合判定...........................................................................4附錄A（規(guī)范性）試劑配方.............................................................5附錄B（資料性）類志賀鄰單胞菌16SrRNA基因參考序列..................................6I

DB51/T2910-2022前言文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——本次為首次發(fā)布。IIDB51/T2910—2022鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷的術(shù)語和定義、試劑和材料、設(shè)備和器材、臨床檢查、實(shí)驗(yàn)室樣品采集、細(xì)菌分離與純化、細(xì)菌鑒定、結(jié)果判定和綜合判定等技術(shù)規(guī)程。本文件適用于達(dá)氏鱘（Acipenserdabryanus）和西伯利亞鱘（Acipenserbaerii）的類志賀鄰單胞菌（Plesiomonasshigelloides）的診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.28-2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB/T18652-2002致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法SC/T7013-2008水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T7014-2006水生動物檢疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范SC/T7201.1-2006魚類細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1鱘魚類志賀鄰單胞菌病Plesiomonasshigelloidesforsturgeon指由類志賀鄰單胞菌（Plesiomonasshigelloides）感染引起達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘發(fā)病或死亡的一種細(xì)菌性疾病。4試劑和材料4.1試劑、染色液和培養(yǎng)基檢驗(yàn)中所需試劑、染色液與培養(yǎng)基的配制按照GB/T4789.28、GB/T18652和SC/T7014規(guī)定執(zhí)行，Taq酶、dNTPs、10×PCR緩沖液（無Mg），DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物選用專業(yè)試劑公司提供的商品化2+試劑；微生物生化鑒定管可替代相應(yīng)鑒定培養(yǎng)基或鑒定試劑，上述未提及的見附錄A。4.2水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。4.3引物16SrRNA基因DNA序列擴(kuò)增引物，P-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，-20℃保存。1

DB51/T2910—20225設(shè)備與器械超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、水平電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、普通光學(xué)顯微鏡、PCR擴(kuò)增儀、電子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盤、剪刀、鑷子、手術(shù)刀、培養(yǎng)皿、鉑耳絲、酒精燈等。6臨床檢查6.1臨床癥狀病魚共同特征為反應(yīng)遲鈍，離群獨(dú)游，游動遲緩或側(cè)翻，攝食減少或停止攝食。體表檢查6.2體表外部檢查參照SC/T7201.1中6.2執(zhí)行。病魚鰭條基部不同程度的充血、出血；部分病魚腹部膨大；極少病魚無明顯外部病變。6.3剖檢肝臟腫大充血，出血；部分病魚腸道腸腔內(nèi)有少量淡黃色的粘液，部分病魚腸道無明顯的變化。7實(shí)驗(yàn)室樣品采集樣品采集按SC/T7013執(zhí)行。8細(xì)菌分離與純化在無菌的環(huán)境中，用滅菌鉑耳分別勾取病魚的肝、腎，劃線接種至LB固體培養(yǎng)基，28℃培育24-48小時(shí)，從中挑取圓形、隆起、光滑、邊緣整齊的單個(gè)菌落在LB平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基的配制方法見附錄A.1。9細(xì)菌鑒定9.1革蘭氏染色參考GB/T18652-2002中2.2.5規(guī)定執(zhí)行。生理生化試驗(yàn)9.2采用細(xì)菌生化鑒定管進(jìn)行試驗(yàn)，也可利用全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定。9.2.1乙酰甲基甲醇（V-P）試驗(yàn)按SC/T7014中表2的規(guī)定執(zhí)行。有氣泡產(chǎn)生為陽性；無氣泡產(chǎn)生為陰性。9.2.2氧化酶試驗(yàn)以毛細(xì)管吸取四甲基對二苯胺的1%水溶液滴在細(xì)菌的菌落上。菌落呈玫瑰紅色、深紫色為陽性，不變色為陰性。2

DB51/T2910—20229.2.3吲哚試驗(yàn)按SC/T7014表2的吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)的規(guī)定執(zhí)行。培養(yǎng)基變紅為陽性；不變紅為陰性。9.2.4糖、醇類（葡萄糖、甘露醇）發(fā)酵試驗(yàn)將待檢菌穿刺接種于糖、醇類發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基（A.2），28℃培養(yǎng)24h后觀察。培養(yǎng)基變黃色為陽性，不變黃色為陰性。9.2.5運(yùn)動性試驗(yàn)按GB/T4789.28中2.8的方法配制半固體培養(yǎng)基。把待檢菌穿刺接種于半固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)36h-48h。若待檢菌由穿刺線向四周擴(kuò)散，其邊緣呈云霧狀，為運(yùn)動性陽性；若待檢菌只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，為運(yùn)動性陰性。9.316SrRNA基因序列測定與同源性分析9.3.1細(xì)菌基因組DNA抽提酚氯仿法、高鹽法或采用商用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。9.3.216SrRNA基因擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液（無Mg）5.0μL，MgCl2（25mmol/L）5.0μL，dNTPs（10mmol/L）2+1.0μL，引物(20μmol/L)P-F和P-R各1.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足至50μL?；靹蚝?，3000r/min離心30s。設(shè)空白對照，空白對照取等體積的雙蒸水代替DNA模板。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫。9.3.3瓊脂糖凝膠電泳用TAE電泳緩沖液（A.3）配制1％的瓊脂糖平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍(lán)指示劑溶液（A.4）混合后加入樣品孔，使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對照。120V電泳約20min-40min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。于紫外光下觀察，并在長波紫外燈下用刀片切下含目的條帶（約1500bp）的膠塊，放入無菌離心管中稱重。9.3.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測序、序列比對9.3.4.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化按每0.1g瓊脂糖凝膠加0.1mL酚，將酚加入9.3.3含有目的條帶膠塊的離心管中。經(jīng)漩渦震蕩儀震蕩1min-2min，將離心管在-70℃放置1h，使凝膠完全凍結(jié)。37℃水浴將凍結(jié)的凝膠融化后，在漩渦震蕩儀上震蕩1min-2min；14000r/min離心5min。取上層水相轉(zhuǎn)入另一個(gè)離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25﹕24﹕1）（A.5），混勻，12000r/min離心5min。取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）（A.6），混勻，12000r/min離心5min。向收集的水溶液中加入1/10體積的3mol/L的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，置-20℃過夜或-70℃放置1h-2h。14000r/min離心10min，棄上清。將沉淀的DNA溶于適當(dāng)體積的TE緩沖液中，置-20℃保存，待測。9.3.4.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序與同源性分析將上述純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，并與參考序列（附錄B）進(jìn)行比對分析。3

DB51/T2910—202210結(jié)果判定10.1菌落形態(tài)28℃培養(yǎng)24h-48h，形成圓形、隆起、光滑、邊緣整齊的菌落。10.2細(xì)菌染色革蘭氏染色為陰性短桿菌。10.3生理生化試驗(yàn)生理生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1類志賀鄰單胞菌的生理生化反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)項(xiàng)目氧化酶吲哚結(jié)果反應(yīng)項(xiàng)目甘露醇結(jié)果反應(yīng)項(xiàng)目V-P結(jié)果++-+-+葡萄糖運(yùn)動性注：“+”為陽性，“-”為陰性10.416SrRNA基因序列測定與同源性分析測定的16SrRNA基因序列與附錄B所列的基因序列比較，同源性達(dá)98%以上。11綜合判定符合以下所有特征者判定為類志賀鄰單胞菌病a)臨床癥狀與6相符；b)菌落形態(tài)和染色觀察與10.1和10.2相符；c)生理生化反應(yīng)結(jié)果與10.3相符；d)16SrRNA基因序列同源性分析結(jié)果與10.4相符。4DB51/T2910—2022附錄A（規(guī)范性）試劑配方A.1LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5g瓊脂或者瓊脂糖15g蒸餾水1000mLpH7.0-7.2，115℃滅菌20min。A.2糖、醇類發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨2gNaCl5gK2HPO40.2g被測糖或醇類10g瓊脂6g溴百里酚藍(lán)1％水溶液3mL（溴百里酚藍(lán)先用少量95％乙醇溶解后，再加水配制1％的水溶液）蒸餾水1000mLpH7.0-7.2，分裝試管，培養(yǎng)基高度約4.5cm，115℃滅菌20min。A.350×TAE電泳緩沖液在800mL雙蒸水中溶解242gTris堿，加入57.1mL冰乙酸和37.2gEDTA，充分混勻后，加雙蒸水定容至1L，室溫保存。使用時(shí)，配成1×TAE電泳緩沖液。A.4溴酚藍(lán)指示劑溶液6×上樣緩沖液將溴酚藍(lán)100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中，搖勻后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，調(diào)至藍(lán)色。A.5酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE緩沖液，4℃保存。A.6氯仿：異戊醇（24:1）將24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中。5DB51/T2910—2022附錄B（資料性）類志賀鄰單胞菌16SrRNA基因參考序列AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCCGCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGG