醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求的關(guān)鍵控制點(diǎn)pcr專業(yè)-課件

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求

PCR專業(yè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)沈佐君shenzuojun163醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求

PCR專業(yè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)沈佐君1《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2019]10號(hào)）《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2019]73號(hào)）《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2019〕194號(hào)）《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》

ISO15189準(zhǔn)則（CL02）CNAS-GL26醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的指南CNAS醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明參考依據(jù)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2019]12概述基因體外擴(kuò)增檢驗(yàn)通常稱為PCR檢驗(yàn)；該檢驗(yàn)項(xiàng)目是目前我國臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目中唯一一項(xiàng)需要通過衛(wèi)生部或省級(jí)臨床檢驗(yàn)中心現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)驗(yàn)收合格方可開展臨床檢驗(yàn)的技術(shù)準(zhǔn)入項(xiàng)目。概述基因體外擴(kuò)增檢驗(yàn)通常稱為PCR檢驗(yàn)；3概述對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求：實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收合格證書人員上崗證書實(shí)驗(yàn)室的布局儀器設(shè)備要求質(zhì)量手冊(cè)、管理程序文件、操作程序文件、作業(yè)指導(dǎo)書、記錄表格等概述對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求：41范圍本文件規(guī)定了CNAS對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的認(rèn)可要求，包括病原體核酸擴(kuò)增檢驗(yàn)和病理學(xué)檢查等領(lǐng)域涉及的人體基因擴(kuò)增檢驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改單）適用于本文件。GB/T20468-2019《臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)量控制指南》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2019〕194號(hào)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》1范圍54管理要求4.1.1從事基于組織/細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)項(xiàng)目檢測(cè)的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)具有病理學(xué)診斷資質(zhì)。4管理要求4.1.1從事基于組織/細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)項(xiàng)目65技術(shù)要求5.1人員5.1.2基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱實(shí)驗(yàn)室）操作人員應(yīng)經(jīng)過有資質(zhì)的培訓(xùn)機(jī)構(gòu)培訓(xùn)合格取得上崗證后方可上崗。5.1.4實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人至少應(yīng)具有以下資格：中級(jí)職稱，醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)背景，二年以上基因擴(kuò)增工作經(jīng)驗(yàn)。5.1.11實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定員工能力評(píng)審的內(nèi)容和方法，每年評(píng)審員工的工作能力；至少每半年評(píng)審新員工工作能力，并保存勝任的證據(jù)。當(dāng)職責(zé)變更時(shí)，應(yīng)有政策規(guī)定對(duì)員工進(jìn)行再培訓(xùn)和再評(píng)審。沒有通過評(píng)審的人員應(yīng)經(jīng)再培訓(xùn)和再評(píng)審，合格后才可繼續(xù)上崗，并記錄。5.1.13實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供工作人員對(duì)患者隱私及結(jié)果保密的聲明及簽字。5技術(shù)要求5.1人員75.1人員操作人員考核的主要內(nèi)容：

1.標(biāo)本接收與處理：流程和標(biāo)本是否合格的要點(diǎn)

2.試劑耗材質(zhì)檢：為何要質(zhì)檢、如何做

3.核酸提?。涸砗筒僮骷夹g(shù)要領(lǐng)

4.防污染：措施和意識(shí)

5.質(zhì)量控制：程序和實(shí)際運(yùn)行情況、失控的分析處理

6.結(jié)果分析與判斷：結(jié)果審核、報(bào)告發(fā)放5.1人員操作人員考核的主要內(nèi)容：85.1人員在現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審時(shí)要求安排人員比對(duì)：

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的操作主要是標(biāo)本處理中的核酸提取步驟，這其中所涉及的又主要是加樣器的使用，盡管操作簡單，但由于均為微量操作，最后擴(kuò)增放大，因此要獲得穩(wěn)定可靠的測(cè)定結(jié)果，操作人員需要一定的專業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。5.1人員在現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審時(shí)要求安排人員比對(duì)：95.1人員

在現(xiàn)場(chǎng)安排實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮到的問題：標(biāo)本數(shù)量：一般5個(gè)；標(biāo)本要求：一份陰性，其余4份一般要盡可能涵蓋高、中、低、臨界等濃度差，了解線性范圍。5.1人員在現(xiàn)場(chǎng)安排實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮到的問題：105.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-1)5.2.1實(shí)驗(yàn)室原則上分四個(gè)分隔開的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用自動(dòng)分析儀（擴(kuò)增產(chǎn)物閉管檢測(cè)），（c）和（d）區(qū)可合并。上述每個(gè)區(qū)域應(yīng)有充分空間以保證：

樣本處置符合分析前、后樣本分區(qū)放置；

儀器放置符合維修和操作要求；

標(biāo)本制備區(qū)放置生物安全柜、離心機(jī)和冰箱等儀器設(shè)備；

打印檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)交叉污染的控制。5.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-1)5.2.1實(shí)驗(yàn)室原則上分四個(gè)115.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-2)5.2.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)實(shí)施安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，應(yīng)針對(duì)各工作區(qū)制定針對(duì)性的防護(hù)措施及合適的警告。5.2.4實(shí)驗(yàn)室各分區(qū)應(yīng)配置固定和移動(dòng)紫外線燈，波長為254nm，照射時(shí)離實(shí)驗(yàn)臺(tái)的高度為60～90cm。標(biāo)本處理區(qū)應(yīng)配置二級(jí)生物安全柜。5.2.5實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)所用分析設(shè)備和實(shí)驗(yàn)過程對(duì)環(huán)境溫、濕度的要求，制定實(shí)驗(yàn)室溫、濕度控制的目標(biāo)，有效地實(shí)施控制，并提供溫、濕度監(jiān)控記錄。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)用途（如：RNA檢測(cè)用水），制定適

宜的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（如：應(yīng)除RNase），并定期檢測(cè)。5.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-2)5.2.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)實(shí)施安全125.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-3)5.2.6基因擴(kuò)增檢驗(yàn)各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不能混用。進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)按照單一方向進(jìn)行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不能將工作服帶出。5.2.7實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有限制進(jìn)入的標(biāo)志和措施。5.2.9實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有足夠的、溫度適宜的儲(chǔ)存空間（如冰箱），用以保存臨床樣品和試劑，設(shè)置目標(biāo)溫度和允許范圍，并記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有溫度失控時(shí)的處理措施，并記錄。5.2.10實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有經(jīng)過培訓(xùn)的內(nèi)務(wù)管理人員（如保潔人員），實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有地面、臺(tái)面的維護(hù)、清潔和消毒計(jì)劃及相關(guān)的記錄。

危險(xiǎn)物品的存放及處置應(yīng)遵守相關(guān)法規(guī)，并應(yīng)有相關(guān)的使用記錄。5.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-3)5.2.6基因擴(kuò)增檢驗(yàn)各工135.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-1)5.3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定設(shè)備、試劑和耗材的采購、驗(yàn)收等管理程序，應(yīng)有根據(jù)工作量保證實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行的試劑/耗材訂購計(jì)劃，以及試劑/耗材最低貯存量要求?；驍U(kuò)增實(shí)驗(yàn)室如從事RNA的檢測(cè)，應(yīng)具有高速冷凍離心機(jī)。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)配置洗板機(jī)并使用洗板機(jī)洗板。一次性的加樣器吸頭應(yīng)帶有濾芯。5.3.2強(qiáng)檢設(shè)備按國家相關(guān)要求執(zhí)行，應(yīng)進(jìn)行外部校準(zhǔn)的設(shè)備，可按制造商校準(zhǔn)程序進(jìn)行。對(duì)分析設(shè)備校準(zhǔn)的基本項(xiàng)目至少應(yīng)包括：加樣系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)。應(yīng)內(nèi)部校準(zhǔn)的輔助設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定內(nèi)部校準(zhǔn)程序。應(yīng)定期對(duì)PCR儀、加樣器、溫度計(jì)和恒溫設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)。5.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-1)5.3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定設(shè)備、試14校準(zhǔn)與檢定校準(zhǔn)： 在規(guī)定條件下，為確定測(cè)量儀器或測(cè)量系統(tǒng)所指示的量值，或?qū)嵨锪烤呋騾⒖嘉镔|(zhì)所代表的量值，與對(duì)應(yīng)的由標(biāo)準(zhǔn)所復(fù)現(xiàn)的量值之間關(guān)系的一組操作。檢定：查明和確認(rèn)計(jì)量器具是否符合法定要求的程序，它包括檢查、加標(biāo)記和（或）出具檢定證書。校準(zhǔn)與檢定校準(zhǔn)： 在規(guī)定條件下，為確定測(cè)量儀器或測(cè)量系統(tǒng)155.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-2)5.3.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存與檢驗(yàn)質(zhì)量有關(guān)的設(shè)備管理記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供對(duì)試劑和耗材檢查、接收或拒絕、貯存和使用的記錄，包括批號(hào)、效期、實(shí)驗(yàn)室接收日期、接收人和使用日期等。試劑耗材的質(zhì)檢記錄至少包括：外觀檢查：肉眼可看出的，如包裝完整性；性能檢測(cè)：通過實(shí)驗(yàn)才能判斷的，如耗材的抑制物、試劑批間的差異（應(yīng)涵蓋低濃度和高濃度，如安排過去檢測(cè)過的臨界陽性的患者標(biāo)本加上病理定性檢查的部分）。對(duì)于試劑性能質(zhì)檢記錄，應(yīng)能反映該批試劑：1）核酸提取效率，2）核酸擴(kuò)增效率。商品試劑記錄包括：使用效期和啟用日期。自配試劑記錄包括：試劑名稱或成分；規(guī)格；儲(chǔ)存要求；制備或復(fù)融的日期；有效期；配制人。5.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-2)5.3.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存與檢驗(yàn)質(zhì)16試劑質(zhì)檢

強(qiáng)調(diào)采用患者標(biāo)本進(jìn)行試劑質(zhì)檢的意義：PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)兩個(gè)關(guān)鍵步驟：（1）從標(biāo)本中提取核酸；（2）提取核酸的擴(kuò)增。商品化的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果良好，并非能反映提取試劑的質(zhì)量。試劑質(zhì)檢強(qiáng)調(diào)采用患者標(biāo)本進(jìn)行試劑質(zhì)檢的意義：17樣品序號(hào)結(jié)果1（老試劑）結(jié)果2（新試劑）偏差判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)論對(duì)數(shù)值對(duì)數(shù)值偏倚%偏倚%

符合/不符合1000%7.5%

符合23.023.12+3.3%7.5%

符合34.584.32—5.7%7.5%

符合46.245.96—4.5%7.5%

符合

58.568.87+3.6%7.5%

符合樣品序號(hào)結(jié)果1（老試劑）結(jié)果2（新試劑）偏差判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)論對(duì)數(shù)185.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-3)5.3.6PCR擴(kuò)增儀應(yīng)配備穩(wěn)壓電源。5.3.7設(shè)備故障修復(fù)后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)該設(shè)備性能進(jìn)行驗(yàn)證，必要時(shí)需進(jìn)行校準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)首先分析故障原因，如果設(shè)備故障影響了方法學(xué)性能，可通過以下合適的方式進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)、驗(yàn)證（適用于定量項(xiàng)目）：可校準(zhǔn)的項(xiàng)目結(jié)果超出允許范圍時(shí)，實(shí)施校準(zhǔn)；質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)在質(zhì)控范圍內(nèi)；與其他儀器的檢測(cè)結(jié)果比較，偏差符合附錄A的要求；使用留樣再測(cè)結(jié)果進(jìn)行判別，偏差符合附錄A的要求。

特別注意的是：評(píng)價(jià)故障對(duì)之前檢驗(yàn)結(jié)果的影響。5.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-3)5.3.6PCR擴(kuò)增儀應(yīng)配備19基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)

A.1應(yīng)不低于國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方法規(guī)要求。A.2自建檢測(cè)系統(tǒng)分析性能標(biāo)準(zhǔn)：以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限作為允許總誤差（TEa），重復(fù)性精密度<1/4TEa；中間精密度<1/3TEa。A.3設(shè)備故障修復(fù)后，分析系統(tǒng)比對(duì)：5份樣本，覆蓋測(cè)量范圍，包括醫(yī)學(xué)決定水平，至少4份樣本測(cè)量結(jié)果偏倚<1/2TEa。A.4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析系統(tǒng)定期比對(duì)：樣本數(shù)n≥20，濃度應(yīng)覆蓋測(cè)量范圍，包括醫(yī)學(xué)決定水平，計(jì)算回歸方程，計(jì)算在醫(yī)學(xué)決定性水平下的系統(tǒng)誤差（偏倚%），應(yīng)<1/2TEa。A.5留樣再測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照項(xiàng)目穩(wěn)定性要求選取最長期限樣本，5個(gè)樣本，覆蓋測(cè)量范圍，考慮醫(yī)學(xué)決定水平，至少4個(gè)樣本測(cè)量結(jié)果偏倚<1/2TEa。A.6沒有標(biāo)準(zhǔn)和室間質(zhì)評(píng)要求時(shí)，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比對(duì)合格標(biāo)準(zhǔn)可依據(jù)制造商聲明的性能標(biāo)準(zhǔn)而制定?；驍U(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)20附錄A:

基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)A.1應(yīng)不低于國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方法規(guī)要求。A.2自建檢測(cè)系統(tǒng)不精密度要求：以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限（靶值0.4對(duì)數(shù)值）作為允許總誤差（TEa），重復(fù)性精密度<3/5TEa；中間精密度<4/5TEa。A.3設(shè)備故障修復(fù)后，分析系統(tǒng)比對(duì)：5份樣本，覆蓋測(cè)量范圍，至少4份樣本測(cè)量結(jié)果偏倚<7.5%。A.4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析系統(tǒng)定期比對(duì)：樣本數(shù)n≥20，濃度應(yīng)覆蓋測(cè)量范圍，計(jì)算回歸方程，計(jì)算系統(tǒng)誤差應(yīng)<7.5%。A.5留樣再測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照項(xiàng)目穩(wěn)定性要求選取最長期限樣本，5個(gè)樣本，覆蓋測(cè)量范圍，至少4個(gè)樣本測(cè)量結(jié)果偏倚<7.5%。A.6沒有標(biāo)準(zhǔn)和室間質(zhì)評(píng)要求時(shí)，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比對(duì)合格標(biāo)準(zhǔn)可依據(jù)制造商聲明的性能標(biāo)準(zhǔn)而制定。附錄A:

基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)211X103

取對(duì)數(shù)＝3；30.4；0.4/3＝13.33%；1X108

取對(duì)數(shù)＝8；80.4；0.4/8＝5%。1X10322項(xiàng)目CLIA’88基于生物學(xué)變異合適性能(%)最佳性能(%)最低性能(%)鉀T±0.5mmol/L5.82.98.7鈉T±4mmol/L0.90.41.3氯T±5%1.50.72.2鈣T±0.25mmol/L2.41.23.6磷T±20%10.25.115.3葡萄糖T±10%6.93.510.4總蛋白T±10%3.41.75.2白蛋白T±10%3.91.95.8肌酐T±15%8.24.112.2尿素T±9%15.77.823.5尿酸T±17%12.46.218.6丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶T±20%32.116.048.1門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶T±20%15.27.622.8γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶T±20%22.211.133.3乳酸脫氫酶T±20%11.45.717.0堿性磷酸酶T±30%11.75.817.5肌酸激酶T±30%30.315.245.5淀粉酶T±30%14.67.321.9總膽紅素T±20%31.115.546.6三酰甘油T±25%27.914.041.9總膽固醇T±10%8.54.212.7高密度脂蛋白膽固醇T±30%11.15.516.6低密度脂蛋白膽固醇T±30%13.66.820.4載脂蛋白A1T±30%9.14.513.6載脂蛋白BT±30%11.65.817.5pO2T±3sN/AN/AN/ApCO2T±8%5.72.98.6pHT±0.04N/AN/AN/A糖化血紅蛋白N/A4.32.26.5糖化白蛋白N/A7.23.610.8前白蛋白N/A14.57.221.7項(xiàng)目CLIA’88基于生物學(xué)變異合適性能(%)最佳性能(%)235.4檢驗(yàn)前程序5.4.3b)樣品采集手冊(cè)中應(yīng)規(guī)定基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本留取的具體要求：如高壓或Rnase滅活的潔凈試管、抗凝管正確使用等。一般全血和骨髓標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行抗凝處理，EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干擾時(shí)除外）；用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本宜進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解；如未作抗凝處理，則宜在抽血后1小時(shí)內(nèi)分離血清；分泌物、拭子、腫瘤組織等標(biāo)本留取的注意事項(xiàng)等。5.4.10基于組織/細(xì)胞學(xué)形態(tài)基礎(chǔ)的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)由具有病理診斷資質(zhì)的醫(yī)師確認(rèn)標(biāo)本是否滿足檢測(cè)要求。5.4檢驗(yàn)前程序5.4.3b)樣品采集手冊(cè)中應(yīng)規(guī)定基24如何正確采集患者標(biāo)本，確保分子診斷檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠？1、規(guī)定標(biāo)本采集的時(shí)間此項(xiàng)規(guī)定一方面應(yīng)便于病人與檢驗(yàn)人員做好準(zhǔn)備，集中收集標(biāo)本及時(shí)檢測(cè)，尤其是RNA標(biāo)本應(yīng)在采集后及時(shí)處理以防RNA的降解。人的汗液，甚至空氣中，都可能含有RNA酶，當(dāng)RNA遇到RNA酶時(shí)會(huì)降解，造成檢測(cè)結(jié)果誤差。另一方面應(yīng)考慮疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早過晚都可能給出假陰性結(jié)果。比如，獲得性梅毒分三期Ⅰ期（初期）梅毒：外生殖器潰瘍滲出物中有大量的TP；Ⅱ期（中期）在梅毒疹與淋巴結(jié)中存在大量的TP；Ⅲ期（晚期）病變波及全身組織器官，病損處TP少。2、標(biāo)本的類型和采集量標(biāo)本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所檢測(cè)的病原體而定，并且重視和考慮同一病原體感染部位不同所采集的標(biāo)本類型亦不同。比如，肺部結(jié)核應(yīng)取深部晨痰；神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核應(yīng)取腦脊液；泌尿系統(tǒng)結(jié)核應(yīng)取尿液（清晨一次全部尿量或24小時(shí)尿沉渣）；胸腔腹腔結(jié)核可取胸水、腹水；另外對(duì)于病變部位不明的病人亦可采取血液抗凝。如何正確采集患者標(biāo)本，確保分子診斷檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠？253、標(biāo)本采集中的防污染措施（1）標(biāo)本采集采用一次性材料。（2）標(biāo)本應(yīng)裝在封閉的無菌一次性容器中。（3）標(biāo)本應(yīng)收集在專用的容器內(nèi)，而不能與其他檢測(cè)項(xiàng)目共用同一份標(biāo)本，因?yàn)檫@樣做大大增加了標(biāo)本間污染的可能，若是進(jìn)行RNA檢測(cè)的標(biāo)本易受RNA酶污染。4、標(biāo)本的抗凝要求一般全血和骨髓標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行抗凝處理，EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干擾時(shí)除外）；用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本宜進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解；如未作抗凝處理，則宜在抽血后1小時(shí)內(nèi)分離血清；分泌物、拭子、腫瘤組織等標(biāo)本留取的注意事項(xiàng)等?；诮M織/細(xì)胞學(xué)形態(tài)基礎(chǔ)的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)由具有病理診斷資質(zhì)的醫(yī)師確認(rèn)標(biāo)本是否滿足檢測(cè)要求。5、其它注意事項(xiàng)對(duì)于取材來自男性尿道或女性生殖道的分泌物或拭子等標(biāo)本，要特別注意是否取到病變的樣本，否則容易出現(xiàn)假陰性。對(duì)這類樣本，臨床上往往存在一個(gè)誤區(qū)，即臨床醫(yī)生希望檢驗(yàn)科能報(bào)告定量的結(jié)果，如性病的治療、優(yōu)生優(yōu)育檢查。雖然PCR方法本身是可以準(zhǔn)確定量的，但因取材無法定量，故此這類檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)際上無法準(zhǔn)確定量。3、標(biāo)本采集中的防污染措施265.5檢驗(yàn)程序5.5.1如果使用內(nèi)部程序，如自建檢測(cè)系統(tǒng)，應(yīng)有程序評(píng)估并確認(rèn)分析性能符合預(yù)期用途。對(duì)于定量檢測(cè)項(xiàng)目內(nèi)容應(yīng)至少包括正確度、精密度、可報(bào)告范圍、生物參考區(qū)間等。5.5.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)之前驗(yàn)證所使用的檢驗(yàn)方法和程序的分析性能，對(duì)于定量檢測(cè)項(xiàng)目內(nèi)容至少包括正確度、精密度、可報(bào)告（或線性）范圍等。對(duì)于定性檢測(cè)項(xiàng)目內(nèi)容應(yīng)包括靈敏度、特異性或符合率及重復(fù)性。5.5檢驗(yàn)程序5.5.1如果使用內(nèi)部程序，如自建檢測(cè)系統(tǒng)275.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-1)5.6.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制程序，可參照GB/T20468-2019《臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)量控制指南》。質(zhì)量控制程序中應(yīng)有針對(duì)核酸檢測(cè)中防污染的具體措施。質(zhì)控圖應(yīng)包括質(zhì)控結(jié)果、質(zhì)控品名稱、濃度、批號(hào)和有效期、質(zhì)控圖的中心線和控制界線、分析儀器名稱和唯一標(biāo)識(shí)、方法學(xué)名稱、檢驗(yàn)項(xiàng)目名稱、試劑和校準(zhǔn)品批號(hào)、每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的日期和時(shí)間、干擾行為的記錄、質(zhì)控人員及審核人員的簽字、失控時(shí)的分析處理程序和糾正措施等。對(duì)于定性檢測(cè)項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和陽性質(zhì)控。質(zhì)控規(guī)則應(yīng)確保試驗(yàn)的穩(wěn)定性和檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢查失控對(duì)之前檢驗(yàn)的影響。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-1)5.6.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定285.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-2)5.6.3對(duì)于定量檢測(cè)項(xiàng)目，使用配套分析系統(tǒng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室可使用制造商提供的溯源性文件。使用非配套分析系統(tǒng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用有證參考物質(zhì)、正確度控制品等進(jìn)行正確度驗(yàn)證或與經(jīng)確認(rèn)的參考方法進(jìn)行結(jié)果比對(duì)以證明實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果的正確度。如以上無法實(shí)現(xiàn)，則通過如下方式提供結(jié)果可信度的證明：參加適宜的能力驗(yàn)證計(jì)劃（PT）、室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃（EQA），且在近期一個(gè)完整的周期內(nèi)成績合格，或與已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室或其它使用相同檢測(cè)方法的配套系統(tǒng)的同級(jí)別或高級(jí)別醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-2)5.6.3對(duì)于定量檢測(cè)295.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-3)5.6.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》的要求參加相應(yīng)的能力驗(yàn)證活動(dòng)。應(yīng)采用相同的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)質(zhì)控樣本與患者樣本；室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)需由從事常規(guī)檢驗(yàn)工作的人員執(zhí)行；應(yīng)有禁止與其他實(shí)驗(yàn)室之間核對(duì)上報(bào)PT、EQA結(jié)果的規(guī)定；應(yīng)能提供參加PT、EQA活動(dòng)的結(jié)果和證書。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)“不滿意”和“不合格”的PT、EQA結(jié)果建立分析和糾正措施，并記錄。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或指定負(fù)責(zé)人應(yīng)監(jiān)控室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)的結(jié)果，并在結(jié)果報(bào)告上簽字。5.6.5對(duì)沒有開展PT或EQA的檢測(cè)項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過與其他實(shí)驗(yàn)室（如已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室或其它使用相同檢測(cè)方法的配套系統(tǒng)的同級(jí)別或高級(jí)別實(shí)驗(yàn)室）比對(duì)的方式，判斷檢驗(yàn)結(jié)果的可接受性。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-3)5.6.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照C305.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-4)5.6.6實(shí)驗(yàn)室用兩套及以上檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)同一項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)有比對(duì)數(shù)據(jù)表明其檢測(cè)結(jié)果的一致性，比對(duì)頻次每年至少2次，每次不少于5份樣本，濃度水平覆蓋測(cè)量范圍；比對(duì)結(jié)果的系統(tǒng)偏倚應(yīng)符合附錄A的要求。使用不同生物參考區(qū)間的檢測(cè)系統(tǒng)間不宜進(jìn)行比對(duì)。5.6.7實(shí)驗(yàn)室管理層應(yīng)定期檢查室內(nèi)質(zhì)量控制記錄（最少每月一次）和能力驗(yàn)證結(jié)果。應(yīng)有針對(duì)內(nèi)部質(zhì)量控制和外部質(zhì)量評(píng)價(jià)“不滿意”結(jié)果采取糾正措施的記錄。質(zhì)量控制記錄至少應(yīng)保留2年。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-4)5.6.6實(shí)驗(yàn)室用兩套315.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理核酸的分離純化靶核酸提取的質(zhì)量臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì)核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)控產(chǎn)物檢測(cè)的質(zhì)控核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測(cè)及其質(zhì)量控制5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)325.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測(cè)定的是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)335.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證核酸的分離純化核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。經(jīng)典方法硅吸附法對(duì)于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對(duì)其核酸提取純度和效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證核酸的分離純化核酸的分離純化就是要345.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證靶核酸提取的質(zhì)量純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定。核酸提取的產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測(cè)定。核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用已知病原體含量的溶血和/或脂血標(biāo)本用待評(píng)價(jià)試劑提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，比較所得到的結(jié)果。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證靶核酸提取的質(zhì)量純化的靶核酸的完整35●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之間●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1uL醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求的關(guān)鍵控制點(diǎn)pcr專業(yè)-課件365.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì)臨床標(biāo)本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制375.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有室內(nèi)質(zhì)控方案和室間質(zhì)評(píng)計(jì)1.室內(nèi)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序；

陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、試劑空白對(duì)照、

陽性（臨界值）對(duì)照

2.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加EQA。失控結(jié)果的分析，糾正措施及其效果評(píng)價(jià)等。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有室內(nèi)質(zhì)控方案和室間質(zhì)評(píng)計(jì)385.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證無商品化質(zhì)控物時(shí)，可采用自制的質(zhì)控物。質(zhì)控物的評(píng)價(jià)：均一性、瓶間差、穩(wěn)定性等。理想質(zhì)控物：基質(zhì)與待測(cè)樣本一致；所含待測(cè)物濃度接近試驗(yàn)的決定性水平；穩(wěn)定；靶值或預(yù)期結(jié)果已定；無已知的生物傳染危險(xiǎn)性；單批可大量獲得；價(jià)廉。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證無商品化質(zhì)控物時(shí)，可采用自制的質(zhì)控395.7檢驗(yàn)后程序檢驗(yàn)結(jié)果的審核；原始樣品及其他實(shí)驗(yàn)室樣品的保存應(yīng)符合經(jīng)批準(zhǔn)的政策；不再用于檢驗(yàn)樣品的安全處置應(yīng)符合廢棄物處置的法規(guī)或有關(guān)廢棄物管理的規(guī)定。5.7檢驗(yàn)后程序檢驗(yàn)結(jié)果的審核；405.8結(jié)果報(bào)告(2-1)檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、明確和客觀；定性測(cè)定報(bào)告“陰性”或“陽性”，定量測(cè)定則以拷貝數(shù)/ml或IU/ml報(bào)告，避免二者的混淆；每份報(bào)告應(yīng)包括以下信息：標(biāo)題，如“檢測(cè)報(bào)告”、報(bào)告的唯一標(biāo)識(shí)（如序號(hào)）、被檢測(cè)標(biāo)本的說明、檢測(cè)標(biāo)本的特性和狀態(tài)、檢測(cè)標(biāo)本的接收日期和進(jìn)行檢測(cè)的日期、采用的檢測(cè)方法、實(shí)驗(yàn)操作及校核人員的簽字及簽發(fā)日期、檢測(cè)報(bào)告中應(yīng)給出參考結(jié)果或范圍（檢測(cè)下限）；5.8結(jié)果報(bào)告(2-1)檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、明確和415.8結(jié)果報(bào)告(2-2)由于任何原因?qū)е聢?bào)告的有效性發(fā)生疑問時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)立即通知臨床相關(guān)科室予以改正；當(dāng)臨床科室或患者要求用電話、圖文傳真或其它電子和電磁設(shè)備傳送結(jié)果時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保證工作人員遵循文件化的程序，并為對(duì)方保密。5.8結(jié)果報(bào)告(2-2)由于任何原因?qū)е聢?bào)告的有效性發(fā)生疑42定量PCR試驗(yàn)HCV-RNA使用GBW09151標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證準(zhǔn)確性，定值1.09±0.27×105IU/ml,實(shí)測(cè)0.79×105IU/ml，偏差27.5%，超出定值范圍，未進(jìn)行處理（5.6.3）。（0.79－1.09）/1.09*100%=27.5%假定一個(gè)靶值為1*104;如果檢測(cè)結(jié)果為1*103，則（1*103-1*104）/1*104=0.9=90%;如果檢測(cè)結(jié)果為1*105，則（1*105-1*104）/1*104=9=900%。不符合項(xiàng)案例定量PCR試驗(yàn)HCV-RNA使用GBW09151標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證43HBV-DNA可報(bào)告范圍為103－108，HCV-RNA可報(bào)告范圍為103－107，標(biāo)準(zhǔn)曲線和室內(nèi)質(zhì)控的濃度設(shè)定都在104以上，建議觀察103低濃度值。（5.6.1）。觀察項(xiàng)案例HBV-DNA可報(bào)告范圍為103－108，HCV-RNA可報(bào)44醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求的關(guān)鍵控制點(diǎn)pcr專業(yè)-課件45醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求的關(guān)鍵控制點(diǎn)pcr專業(yè)-課件46

擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)（3區(qū)）實(shí)驗(yàn)前打開通風(fēng)設(shè)備實(shí)驗(yàn)臺(tái)面清潔（水或70%酒精擦拭）實(shí)驗(yàn)室溫度：

℃（允許范圍：10~30℃）；相對(duì)濕度：

（允許范圍：30%~70%）擴(kuò)增儀操作：開機(jī)自檢及運(yùn)行正常按XXX（列出編號(hào)）SOP進(jìn)行編程、參數(shù)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算值：Slope值：（）Intercept值：（）r值：（）室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果：結(jié)果：

□填寫室內(nèi)質(zhì)控記錄、描質(zhì)控圖是否失控：□否□是實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見所附擴(kuò)增儀打印結(jié)果實(shí)驗(yàn)后：按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP清潔實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、地面及儀器設(shè)備。按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP處理實(shí)驗(yàn)廢棄物。

操作者：

失控原因及分析：（失控判斷標(biāo)準(zhǔn)及原因分析按XXXSOP進(jìn)行）擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)47常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義符號(hào)定義12S一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出±2s控制限。13S一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出±3s控制限。22S兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+2s或－2s控制限。R4S同一批測(cè)定中，兩個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的差值超出4s控制限。41S四個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+1s或－1s控制限。7T七個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值呈現(xiàn)一個(gè)向上或向下的趨勢(shì)變化。10X十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（X）的同一側(cè)。常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義符號(hào)定義12S一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值48謝謝！謝謝！49醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求

PCR專業(yè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)沈佐君shenzuojun163醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求

PCR專業(yè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)沈佐君50《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2019]10號(hào)）《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2019]73號(hào)）《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2019〕194號(hào)）《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》

ISO15189準(zhǔn)則（CL02）CNAS-GL26醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的指南CNAS醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明參考依據(jù)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2019]151概述基因體外擴(kuò)增檢驗(yàn)通常稱為PCR檢驗(yàn)；該檢驗(yàn)項(xiàng)目是目前我國臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目中唯一一項(xiàng)需要通過衛(wèi)生部或省級(jí)臨床檢驗(yàn)中心現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)驗(yàn)收合格方可開展臨床檢驗(yàn)的技術(shù)準(zhǔn)入項(xiàng)目。概述基因體外擴(kuò)增檢驗(yàn)通常稱為PCR檢驗(yàn)；52概述對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求：實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收合格證書人員上崗證書實(shí)驗(yàn)室的布局儀器設(shè)備要求質(zhì)量手冊(cè)、管理程序文件、操作程序文件、作業(yè)指導(dǎo)書、記錄表格等概述對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求：531范圍本文件規(guī)定了CNAS對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的認(rèn)可要求，包括病原體核酸擴(kuò)增檢驗(yàn)和病理學(xué)檢查等領(lǐng)域涉及的人體基因擴(kuò)增檢驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改單）適用于本文件。GB/T20468-2019《臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)量控制指南》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2019〕194號(hào)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》1范圍544管理要求4.1.1從事基于組織/細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)項(xiàng)目檢測(cè)的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)具有病理學(xué)診斷資質(zhì)。4管理要求4.1.1從事基于組織/細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)項(xiàng)目555技術(shù)要求5.1人員5.1.2基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱實(shí)驗(yàn)室）操作人員應(yīng)經(jīng)過有資質(zhì)的培訓(xùn)機(jī)構(gòu)培訓(xùn)合格取得上崗證后方可上崗。5.1.4實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人至少應(yīng)具有以下資格：中級(jí)職稱，醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)背景，二年以上基因擴(kuò)增工作經(jīng)驗(yàn)。5.1.11實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定員工能力評(píng)審的內(nèi)容和方法，每年評(píng)審員工的工作能力；至少每半年評(píng)審新員工工作能力，并保存勝任的證據(jù)。當(dāng)職責(zé)變更時(shí)，應(yīng)有政策規(guī)定對(duì)員工進(jìn)行再培訓(xùn)和再評(píng)審。沒有通過評(píng)審的人員應(yīng)經(jīng)再培訓(xùn)和再評(píng)審，合格后才可繼續(xù)上崗，并記錄。5.1.13實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供工作人員對(duì)患者隱私及結(jié)果保密的聲明及簽字。5技術(shù)要求5.1人員565.1人員操作人員考核的主要內(nèi)容：

1.標(biāo)本接收與處理：流程和標(biāo)本是否合格的要點(diǎn)

2.試劑耗材質(zhì)檢：為何要質(zhì)檢、如何做

3.核酸提?。涸砗筒僮骷夹g(shù)要領(lǐng)

4.防污染：措施和意識(shí)

5.質(zhì)量控制：程序和實(shí)際運(yùn)行情況、失控的分析處理

6.結(jié)果分析與判斷：結(jié)果審核、報(bào)告發(fā)放5.1人員操作人員考核的主要內(nèi)容：575.1人員在現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審時(shí)要求安排人員比對(duì)：

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的操作主要是標(biāo)本處理中的核酸提取步驟，這其中所涉及的又主要是加樣器的使用，盡管操作簡單，但由于均為微量操作，最后擴(kuò)增放大，因此要獲得穩(wěn)定可靠的測(cè)定結(jié)果，操作人員需要一定的專業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。5.1人員在現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審時(shí)要求安排人員比對(duì)：585.1人員

在現(xiàn)場(chǎng)安排實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮到的問題：標(biāo)本數(shù)量：一般5個(gè)；標(biāo)本要求：一份陰性，其余4份一般要盡可能涵蓋高、中、低、臨界等濃度差，了解線性范圍。5.1人員在現(xiàn)場(chǎng)安排實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮到的問題：595.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-1)5.2.1實(shí)驗(yàn)室原則上分四個(gè)分隔開的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用自動(dòng)分析儀（擴(kuò)增產(chǎn)物閉管檢測(cè)），（c）和（d）區(qū)可合并。上述每個(gè)區(qū)域應(yīng)有充分空間以保證：

樣本處置符合分析前、后樣本分區(qū)放置；

儀器放置符合維修和操作要求；

標(biāo)本制備區(qū)放置生物安全柜、離心機(jī)和冰箱等儀器設(shè)備；

打印檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)交叉污染的控制。5.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-1)5.2.1實(shí)驗(yàn)室原則上分四個(gè)605.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-2)5.2.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)實(shí)施安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，應(yīng)針對(duì)各工作區(qū)制定針對(duì)性的防護(hù)措施及合適的警告。5.2.4實(shí)驗(yàn)室各分區(qū)應(yīng)配置固定和移動(dòng)紫外線燈，波長為254nm，照射時(shí)離實(shí)驗(yàn)臺(tái)的高度為60～90cm。標(biāo)本處理區(qū)應(yīng)配置二級(jí)生物安全柜。5.2.5實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)所用分析設(shè)備和實(shí)驗(yàn)過程對(duì)環(huán)境溫、濕度的要求，制定實(shí)驗(yàn)室溫、濕度控制的目標(biāo)，有效地實(shí)施控制，并提供溫、濕度監(jiān)控記錄。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)用途（如：RNA檢測(cè)用水），制定適

宜的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（如：應(yīng)除RNase），并定期檢測(cè)。5.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-2)5.2.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)實(shí)施安全615.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-3)5.2.6基因擴(kuò)增檢驗(yàn)各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不能混用。進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)按照單一方向進(jìn)行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不能將工作服帶出。5.2.7實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有限制進(jìn)入的標(biāo)志和措施。5.2.9實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有足夠的、溫度適宜的儲(chǔ)存空間（如冰箱），用以保存臨床樣品和試劑，設(shè)置目標(biāo)溫度和允許范圍，并記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有溫度失控時(shí)的處理措施，并記錄。5.2.10實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有經(jīng)過培訓(xùn)的內(nèi)務(wù)管理人員（如保潔人員），實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有地面、臺(tái)面的維護(hù)、清潔和消毒計(jì)劃及相關(guān)的記錄。

危險(xiǎn)物品的存放及處置應(yīng)遵守相關(guān)法規(guī)，并應(yīng)有相關(guān)的使用記錄。5.2設(shè)施和環(huán)境條件(3-3)5.2.6基因擴(kuò)增檢驗(yàn)各工625.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-1)5.3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定設(shè)備、試劑和耗材的采購、驗(yàn)收等管理程序，應(yīng)有根據(jù)工作量保證實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行的試劑/耗材訂購計(jì)劃，以及試劑/耗材最低貯存量要求?；驍U(kuò)增實(shí)驗(yàn)室如從事RNA的檢測(cè)，應(yīng)具有高速冷凍離心機(jī)。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)配置洗板機(jī)并使用洗板機(jī)洗板。一次性的加樣器吸頭應(yīng)帶有濾芯。5.3.2強(qiáng)檢設(shè)備按國家相關(guān)要求執(zhí)行，應(yīng)進(jìn)行外部校準(zhǔn)的設(shè)備，可按制造商校準(zhǔn)程序進(jìn)行。對(duì)分析設(shè)備校準(zhǔn)的基本項(xiàng)目至少應(yīng)包括：加樣系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)。應(yīng)內(nèi)部校準(zhǔn)的輔助設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定內(nèi)部校準(zhǔn)程序。應(yīng)定期對(duì)PCR儀、加樣器、溫度計(jì)和恒溫設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)。5.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-1)5.3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定設(shè)備、試63校準(zhǔn)與檢定校準(zhǔn)： 在規(guī)定條件下，為確定測(cè)量儀器或測(cè)量系統(tǒng)所指示的量值，或?qū)嵨锪烤呋騾⒖嘉镔|(zhì)所代表的量值，與對(duì)應(yīng)的由標(biāo)準(zhǔn)所復(fù)現(xiàn)的量值之間關(guān)系的一組操作。檢定：查明和確認(rèn)計(jì)量器具是否符合法定要求的程序，它包括檢查、加標(biāo)記和（或）出具檢定證書。校準(zhǔn)與檢定校準(zhǔn)： 在規(guī)定條件下，為確定測(cè)量儀器或測(cè)量系統(tǒng)645.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-2)5.3.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存與檢驗(yàn)質(zhì)量有關(guān)的設(shè)備管理記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供對(duì)試劑和耗材檢查、接收或拒絕、貯存和使用的記錄，包括批號(hào)、效期、實(shí)驗(yàn)室接收日期、接收人和使用日期等。試劑耗材的質(zhì)檢記錄至少包括：外觀檢查：肉眼可看出的，如包裝完整性；性能檢測(cè)：通過實(shí)驗(yàn)才能判斷的，如耗材的抑制物、試劑批間的差異（應(yīng)涵蓋低濃度和高濃度，如安排過去檢測(cè)過的臨界陽性的患者標(biāo)本加上病理定性檢查的部分）。對(duì)于試劑性能質(zhì)檢記錄，應(yīng)能反映該批試劑：1）核酸提取效率，2）核酸擴(kuò)增效率。商品試劑記錄包括：使用效期和啟用日期。自配試劑記錄包括：試劑名稱或成分；規(guī)格；儲(chǔ)存要求；制備或復(fù)融的日期；有效期；配制人。5.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-2)5.3.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存與檢驗(yàn)質(zhì)65試劑質(zhì)檢

強(qiáng)調(diào)采用患者標(biāo)本進(jìn)行試劑質(zhì)檢的意義：PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)兩個(gè)關(guān)鍵步驟：（1）從標(biāo)本中提取核酸；（2）提取核酸的擴(kuò)增。商品化的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果良好，并非能反映提取試劑的質(zhì)量。試劑質(zhì)檢強(qiáng)調(diào)采用患者標(biāo)本進(jìn)行試劑質(zhì)檢的意義：66樣品序號(hào)結(jié)果1（老試劑）結(jié)果2（新試劑）偏差判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)論對(duì)數(shù)值對(duì)數(shù)值偏倚%偏倚%

符合/不符合1000%7.5%

符合23.023.12+3.3%7.5%

符合34.584.32—5.7%7.5%

符合46.245.96—4.5%7.5%

符合

58.568.87+3.6%7.5%

符合樣品序號(hào)結(jié)果1（老試劑）結(jié)果2（新試劑）偏差判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)論對(duì)數(shù)675.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-3)5.3.6PCR擴(kuò)增儀應(yīng)配備穩(wěn)壓電源。5.3.7設(shè)備故障修復(fù)后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)該設(shè)備性能進(jìn)行驗(yàn)證，必要時(shí)需進(jìn)行校準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)首先分析故障原因，如果設(shè)備故障影響了方法學(xué)性能，可通過以下合適的方式進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)、驗(yàn)證（適用于定量項(xiàng)目）：可校準(zhǔn)的項(xiàng)目結(jié)果超出允許范圍時(shí)，實(shí)施校準(zhǔn)；質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)在質(zhì)控范圍內(nèi)；與其他儀器的檢測(cè)結(jié)果比較，偏差符合附錄A的要求；使用留樣再測(cè)結(jié)果進(jìn)行判別，偏差符合附錄A的要求。

特別注意的是：評(píng)價(jià)故障對(duì)之前檢驗(yàn)結(jié)果的影響。5.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(3-3)5.3.6PCR擴(kuò)增儀應(yīng)配備68基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)

A.1應(yīng)不低于國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方法規(guī)要求。A.2自建檢測(cè)系統(tǒng)分析性能標(biāo)準(zhǔn)：以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限作為允許總誤差（TEa），重復(fù)性精密度<1/4TEa；中間精密度<1/3TEa。A.3設(shè)備故障修復(fù)后，分析系統(tǒng)比對(duì)：5份樣本，覆蓋測(cè)量范圍，包括醫(yī)學(xué)決定水平，至少4份樣本測(cè)量結(jié)果偏倚<1/2TEa。A.4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析系統(tǒng)定期比對(duì)：樣本數(shù)n≥20，濃度應(yīng)覆蓋測(cè)量范圍，包括醫(yī)學(xué)決定水平，計(jì)算回歸方程，計(jì)算在醫(yī)學(xué)決定性水平下的系統(tǒng)誤差（偏倚%），應(yīng)<1/2TEa。A.5留樣再測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照項(xiàng)目穩(wěn)定性要求選取最長期限樣本，5個(gè)樣本，覆蓋測(cè)量范圍，考慮醫(yī)學(xué)決定水平，至少4個(gè)樣本測(cè)量結(jié)果偏倚<1/2TEa。A.6沒有標(biāo)準(zhǔn)和室間質(zhì)評(píng)要求時(shí)，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比對(duì)合格標(biāo)準(zhǔn)可依據(jù)制造商聲明的性能標(biāo)準(zhǔn)而制定?；驍U(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)69附錄A:

基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)A.1應(yīng)不低于國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方法規(guī)要求。A.2自建檢測(cè)系統(tǒng)不精密度要求：以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限（靶值0.4對(duì)數(shù)值）作為允許總誤差（TEa），重復(fù)性精密度<3/5TEa；中間精密度<4/5TEa。A.3設(shè)備故障修復(fù)后，分析系統(tǒng)比對(duì)：5份樣本，覆蓋測(cè)量范圍，至少4份樣本測(cè)量結(jié)果偏倚<7.5%。A.4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析系統(tǒng)定期比對(duì)：樣本數(shù)n≥20，濃度應(yīng)覆蓋測(cè)量范圍，計(jì)算回歸方程，計(jì)算系統(tǒng)誤差應(yīng)<7.5%。A.5留樣再測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照項(xiàng)目穩(wěn)定性要求選取最長期限樣本，5個(gè)樣本，覆蓋測(cè)量范圍，至少4個(gè)樣本測(cè)量結(jié)果偏倚<7.5%。A.6沒有標(biāo)準(zhǔn)和室間質(zhì)評(píng)要求時(shí)，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比對(duì)合格標(biāo)準(zhǔn)可依據(jù)制造商聲明的性能標(biāo)準(zhǔn)而制定。附錄A:

基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)701X103

取對(duì)數(shù)＝3；30.4；0.4/3＝13.33%；1X108

取對(duì)數(shù)＝8；80.4；0.4/8＝5%。1X10371項(xiàng)目CLIA’88基于生物學(xué)變異合適性能(%)最佳性能(%)最低性能(%)鉀T±0.5mmol/L5.82.98.7鈉T±4mmol/L0.90.41.3氯T±5%1.50.72.2鈣T±0.25mmol/L2.41.23.6磷T±20%10.25.115.3葡萄糖T±10%6.93.510.4總蛋白T±10%3.41.75.2白蛋白T±10%3.91.95.8肌酐T±15%8.24.112.2尿素T±9%15.77.823.5尿酸T±17%12.46.218.6丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶T±20%32.116.048.1門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶T±20%15.27.622.8γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶T±20%22.211.133.3乳酸脫氫酶T±20%11.45.717.0堿性磷酸酶T±30%11.75.817.5肌酸激酶T±30%30.315.245.5淀粉酶T±30%14.67.321.9總膽紅素T±20%31.115.546.6三酰甘油T±25%27.914.041.9總膽固醇T±10%8.54.212.7高密度脂蛋白膽固醇T±30%11.15.516.6低密度脂蛋白膽固醇T±30%13.66.820.4載脂蛋白A1T±30%9.14.513.6載脂蛋白BT±30%11.65.817.5pO2T±3sN/AN/AN/ApCO2T±8%5.72.98.6pHT±0.04N/AN/AN/A糖化血紅蛋白N/A4.32.26.5糖化白蛋白N/A7.23.610.8前白蛋白N/A14.57.221.7項(xiàng)目CLIA’88基于生物學(xué)變異合適性能(%)最佳性能(%)725.4檢驗(yàn)前程序5.4.3b)樣品采集手冊(cè)中應(yīng)規(guī)定基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本留取的具體要求：如高壓或Rnase滅活的潔凈試管、抗凝管正確使用等。一般全血和骨髓標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行抗凝處理，EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干擾時(shí)除外）；用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本宜進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解；如未作抗凝處理，則宜在抽血后1小時(shí)內(nèi)分離血清；分泌物、拭子、腫瘤組織等標(biāo)本留取的注意事項(xiàng)等。5.4.10基于組織/細(xì)胞學(xué)形態(tài)基礎(chǔ)的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)由具有病理診斷資質(zhì)的醫(yī)師確認(rèn)標(biāo)本是否滿足檢測(cè)要求。5.4檢驗(yàn)前程序5.4.3b)樣品采集手冊(cè)中應(yīng)規(guī)定基73如何正確采集患者標(biāo)本，確保分子診斷檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠？1、規(guī)定標(biāo)本采集的時(shí)間此項(xiàng)規(guī)定一方面應(yīng)便于病人與檢驗(yàn)人員做好準(zhǔn)備，集中收集標(biāo)本及時(shí)檢測(cè)，尤其是RNA標(biāo)本應(yīng)在采集后及時(shí)處理以防RNA的降解。人的汗液，甚至空氣中，都可能含有RNA酶，當(dāng)RNA遇到RNA酶時(shí)會(huì)降解，造成檢測(cè)結(jié)果誤差。另一方面應(yīng)考慮疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早過晚都可能給出假陰性結(jié)果。比如，獲得性梅毒分三期Ⅰ期（初期）梅毒：外生殖器潰瘍滲出物中有大量的TP；Ⅱ期（中期）在梅毒疹與淋巴結(jié)中存在大量的TP；Ⅲ期（晚期）病變波及全身組織器官，病損處TP少。2、標(biāo)本的類型和采集量標(biāo)本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所檢測(cè)的病原體而定，并且重視和考慮同一病原體感染部位不同所采集的標(biāo)本類型亦不同。比如，肺部結(jié)核應(yīng)取深部晨痰；神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核應(yīng)取腦脊液；泌尿系統(tǒng)結(jié)核應(yīng)取尿液（清晨一次全部尿量或24小時(shí)尿沉渣）；胸腔腹腔結(jié)核可取胸水、腹水；另外對(duì)于病變部位不明的病人亦可采取血液抗凝。如何正確采集患者標(biāo)本，確保分子診斷檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠？743、標(biāo)本采集中的防污染措施（1）標(biāo)本采集采用一次性材料。（2）標(biāo)本應(yīng)裝在封閉的無菌一次性容器中。（3）標(biāo)本應(yīng)收集在專用的容器內(nèi)，而不能與其他檢測(cè)項(xiàng)目共用同一份標(biāo)本，因?yàn)檫@樣做大大增加了標(biāo)本間污染的可能，若是進(jìn)行RNA檢測(cè)的標(biāo)本易受RNA酶污染。4、標(biāo)本的抗凝要求一般全血和骨髓標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行抗凝處理，EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干擾時(shí)除外）；用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本宜進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解；如未作抗凝處理，則宜在抽血后1小時(shí)內(nèi)分離血清；分泌物、拭子、腫瘤組織等標(biāo)本留取的注意事項(xiàng)等?；诮M織/細(xì)胞學(xué)形態(tài)基礎(chǔ)的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)由具有病理診斷資質(zhì)的醫(yī)師確認(rèn)標(biāo)本是否滿足檢測(cè)要求。5、其它注意事項(xiàng)對(duì)于取材來自男性尿道或女性生殖道的分泌物或拭子等標(biāo)本，要特別注意是否取到病變的樣本，否則容易出現(xiàn)假陰性。對(duì)這類樣本，臨床上往往存在一個(gè)誤區(qū)，即臨床醫(yī)生希望檢驗(yàn)科能報(bào)告定量的結(jié)果，如性病的治療、優(yōu)生優(yōu)育檢查。雖然PCR方法本身是可以準(zhǔn)確定量的，但因取材無法定量，故此這類檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)際上無法準(zhǔn)確定量。3、標(biāo)本采集中的防污染措施755.5檢驗(yàn)程序5.5.1如果使用內(nèi)部程序，如自建檢測(cè)系統(tǒng)，應(yīng)有程序評(píng)估并確認(rèn)分析性能符合預(yù)期用途。對(duì)于定量檢測(cè)項(xiàng)目內(nèi)容應(yīng)至少包括正確度、精密度、可報(bào)告范圍、生物參考區(qū)間等。5.5.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)之前驗(yàn)證所使用的檢驗(yàn)方法和程序的分析性能，對(duì)于定量檢測(cè)項(xiàng)目內(nèi)容至少包括正確度、精密度、可報(bào)告（或線性）范圍等。對(duì)于定性檢測(cè)項(xiàng)目內(nèi)容應(yīng)包括靈敏度、特異性或符合率及重復(fù)性。5.5檢驗(yàn)程序5.5.1如果使用內(nèi)部程序，如自建檢測(cè)系統(tǒng)765.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-1)5.6.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制程序，可參照GB/T20468-2019《臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)量控制指南》。質(zhì)量控制程序中應(yīng)有針對(duì)核酸檢測(cè)中防污染的具體措施。質(zhì)控圖應(yīng)包括質(zhì)控結(jié)果、質(zhì)控品名稱、濃度、批號(hào)和有效期、質(zhì)控圖的中心線和控制界線、分析儀器名稱和唯一標(biāo)識(shí)、方法學(xué)名稱、檢驗(yàn)項(xiàng)目名稱、試劑和校準(zhǔn)品批號(hào)、每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的日期和時(shí)間、干擾行為的記錄、質(zhì)控人員及審核人員的簽字、失控時(shí)的分析處理程序和糾正措施等。對(duì)于定性檢測(cè)項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和陽性質(zhì)控。質(zhì)控規(guī)則應(yīng)確保試驗(yàn)的穩(wěn)定性和檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢查失控對(duì)之前檢驗(yàn)的影響。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-1)5.6.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定775.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-2)5.6.3對(duì)于定量檢測(cè)項(xiàng)目，使用配套分析系統(tǒng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室可使用制造商提供的溯源性文件。使用非配套分析系統(tǒng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用有證參考物質(zhì)、正確度控制品等進(jìn)行正確度驗(yàn)證或與經(jīng)確認(rèn)的參考方法進(jìn)行結(jié)果比對(duì)以證明實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果的正確度。如以上無法實(shí)現(xiàn)，則通過如下方式提供結(jié)果可信度的證明：參加適宜的能力驗(yàn)證計(jì)劃（PT）、室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃（EQA），且在近期一個(gè)完整的周期內(nèi)成績合格，或與已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室或其它使用相同檢測(cè)方法的配套系統(tǒng)的同級(jí)別或高級(jí)別醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-2)5.6.3對(duì)于定量檢測(cè)785.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-3)5.6.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》的要求參加相應(yīng)的能力驗(yàn)證活動(dòng)。應(yīng)采用相同的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)質(zhì)控樣本與患者樣本；室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)需由從事常規(guī)檢驗(yàn)工作的人員執(zhí)行；應(yīng)有禁止與其他實(shí)驗(yàn)室之間核對(duì)上報(bào)PT、EQA結(jié)果的規(guī)定；應(yīng)能提供參加PT、EQA活動(dòng)的結(jié)果和證書。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)“不滿意”和“不合格”的PT、EQA結(jié)果建立分析和糾正措施，并記錄。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或指定負(fù)責(zé)人應(yīng)監(jiān)控室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)的結(jié)果，并在結(jié)果報(bào)告上簽字。5.6.5對(duì)沒有開展PT或EQA的檢測(cè)項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過與其他實(shí)驗(yàn)室（如已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室或其它使用相同檢測(cè)方法的配套系統(tǒng)的同級(jí)別或高級(jí)別實(shí)驗(yàn)室）比對(duì)的方式，判斷檢驗(yàn)結(jié)果的可接受性。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-3)5.6.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照C795.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-4)5.6.6實(shí)驗(yàn)室用兩套及以上檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)同一項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)有比對(duì)數(shù)據(jù)表明其檢測(cè)結(jié)果的一致性，比對(duì)頻次每年至少2次，每次不少于5份樣本，濃度水平覆蓋測(cè)量范圍；比對(duì)結(jié)果的系統(tǒng)偏倚應(yīng)符合附錄A的要求。使用不同生物參考區(qū)間的檢測(cè)系統(tǒng)間不宜進(jìn)行比對(duì)。5.6.7實(shí)驗(yàn)室管理層應(yīng)定期檢查室內(nèi)質(zhì)量控制記錄（最少每月一次）和能力驗(yàn)證結(jié)果。應(yīng)有針對(duì)內(nèi)部質(zhì)量控制和外部質(zhì)量評(píng)價(jià)“不滿意”結(jié)果采取糾正措施的記錄。質(zhì)量控制記錄至少應(yīng)保留2年。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證(4-4)5.6.6實(shí)驗(yàn)室用兩套805.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理核酸的分離純化靶核酸提取的質(zhì)量臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì)核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)控產(chǎn)物檢測(cè)的質(zhì)控核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測(cè)及其質(zhì)量控制5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)815.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測(cè)定的是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)825.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證核酸的分離純化核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。經(jīng)典方法硅吸附法對(duì)于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對(duì)其核酸提取純度和效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證核酸的分離純化核酸的分離純化就是要835.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證靶核酸提取的質(zhì)量純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定。核酸提取的產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測(cè)定。核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用已知病原體含量的溶血和/或脂血標(biāo)本用待評(píng)價(jià)試劑提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，比較所得到的結(jié)果。5.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保證靶核酸提取的質(zhì)量純化的靶核酸的完整84●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之間●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1uL醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)要求的關(guān)鍵控制點(diǎn)pcr專業(yè)-課件855.6檢驗(yàn)程序的質(zhì)量保