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文檔簡介
第六章
一般毒性作用
Generaltoxiceffects
一.概述二.急性毒性作用三.局部毒性作用四.短期、亞慢性和慢性毒性作用(蓄積性與耐受性)第六章
一般毒性作用
Generaltoxiceffec
一般毒性:
1.急性毒性
(acutetoxicity)
2.局部毒性
(localtoxicity)
3.亞急性毒性
(subacutetoxicity)
4.亞慢性毒性
(subchronictoxicity)
5.慢性毒性
(chronictoxicity)重復(fù)暴露毒性一般毒性:
1.急性毒性
特殊毒性:
1.致癌
(carcinogenicity)
2.致突變
(mutation)
如:小鼠微核試驗(yàn)(mousemicronucleustest)
小鼠顯性致死試驗(yàn)(mousedominantlethaltest)
大鼠染色體畸變試驗(yàn)(ratchromosomeaberrationtest)
3.致畸
(teratogenesis)
4.生殖發(fā)育毒性
(reproductiveand
developmentaltoxicity)
5.
藥物依賴性
(drugdependence)特殊毒性:
1.致癌
(ca一、一般毒性作用概念和意義
一般毒性評價(jià)主要目的:
1.確定受試物毒作用表現(xiàn)與性質(zhì);
2.確定受試物毒作用的劑量與反應(yīng)關(guān)系;獲得的參數(shù)有:LD50、LOAEL、NOAEL3.確定毒作用靶器官;
4.評價(jià)毒性損害的可逆性;
5.了解化學(xué)藥物毒作用的影響因素等。第一節(jié)概述一、一般毒性作用概念和意義第一節(jié)概述二、一般毒性試驗(yàn)的動(dòng)物選擇(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇
1.物種
選擇原則:⑴與人體生物學(xué)特征相似的動(dòng)物;⑵自然壽命不太長的動(dòng)物;⑶易于飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作的動(dòng)物;⑷經(jīng)濟(jì)并易于獲得的動(dòng)物。
(一般選擇兩個(gè)物種進(jìn)行試驗(yàn))二、一般毒性試驗(yàn)的動(dòng)物選擇2.品系
一般在毒理學(xué)系列研究中應(yīng)使用同一品系。
3.級別(質(zhì)量)
Ⅱ級(清潔級)或Ⅲ級(SPF級)的動(dòng)物
4.性別
受試物毒性如果有性別差異,應(yīng)選擇敏感的性別,若沒有應(yīng)選擇兩種性別進(jìn)行試驗(yàn)(♂/♀各半)。
5.年齡與體重
急性試驗(yàn)-選擇成年動(dòng)物;慢性試驗(yàn)-剛斷乳動(dòng)物。同一性別動(dòng)物的起始體重差異≯平均體重20%。
6.生理與健康狀況
不選擇懷孕、哺乳其動(dòng)物,須選擇健康動(dòng)物(健康觀察期5-7天)。2.品系(二)染毒方式選擇原則:
一般選擇受試物實(shí)際與人接觸的途徑。
1.呼吸道染毒有:氣管注入染毒吸入染毒(靜式與動(dòng)式兩種)
2.消化道染毒有:灌胃法、喂飼法和膠囊法。
3.經(jīng)皮染毒
有:表皮涂藥、浸尾法。
4.注射途徑
有:靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)等。
(二)染毒方式一、急性毒性概念
是指1次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物在短期內(nèi)所產(chǎn)生的健康損害作用和致死效應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)效應(yīng)觀察期:2周。
24小時(shí)多次染毒:毒性很低或溶解度很低的受試物。一般規(guī)定:≯3次/24小時(shí),每次間隔4小時(shí)以上。第二節(jié)急性毒性作用一、急性毒性概念第二節(jié)急性毒性作用二、急性毒性試驗(yàn)的目的
1.評價(jià)急性毒性大小
求出LD50、LD100、LD01、LD0或MTD、LOAEL、NOAEL等。
2.了解急性毒性特征(中毒癥狀與體征)
3.為亞急性、亞慢性、慢性、致癌等試驗(yàn)提供劑量設(shè)置的依據(jù)。
4.為毒作用機(jī)制研究提供初步線索。二、急性毒性試驗(yàn)的目的
1.評價(jià)急性毒性大小
用LD50作為劑量參考依據(jù)的毒性試驗(yàn)
試驗(yàn)類別劑量設(shè)組要求蓄積毒性試驗(yàn) 1/20-1/5
LD50范圍設(shè)組亞慢性試驗(yàn)1/20-1/5LD50作最高劑量慢性(致癌)試驗(yàn)1/10LD50作最高劑量用LD50作為劑量參考依據(jù)的毒性試驗(yàn)試驗(yàn)類別三、急性毒性試驗(yàn)方法要點(diǎn)
(一)經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)
(即傳統(tǒng)LD50法)
基本要求:(OECD)
1.檢疫觀察3-5d,成年健康動(dòng)物(大鼠首選);
2.5-7個(gè)劑量組,每組10只動(dòng)物以上(♀/♂各半);
3.劑量組距合適,一般為等比級數(shù);
4.給藥途徑盡量與實(shí)際接觸一致;
(隔夜禁食(12-14h),給藥后再禁食3-4小時(shí))
5.毒性觀察期至少2周以上,每天觀察1次。三、急性毒性試驗(yàn)方法要點(diǎn)
(一)經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)
LD50計(jì)算方法:
①曲線擬合法
(概率單位法或Bliss法)
②插值法
累積法
寇氏法
移動(dòng)平均法
霍恩(Horn)法-查表法
Weil查表法等LD50計(jì)算方法:
①曲線擬合法
(概率單位劑量設(shè)置依據(jù):
①參考同系物或類似物的急性毒性資料;
②最大耐受致死量(LD0)測定;
WHO規(guī)定給藥劑量:經(jīng)口5000mg/kg
經(jīng)呼吸道5000ppm
經(jīng)皮膚2000mg/kg
③預(yù)試驗(yàn)測定致死劑量范圍
即死亡率從0%~100%(10%~90%)
-Lork法(改良法的組距為1.3-1.5)
-組距法劑量設(shè)置依據(jù):
①參考同系物或類似物的急性毒性資料;改良Lork簡化劑量設(shè)計(jì)方案改良Lork簡化劑量設(shè)計(jì)方案公式:
i=(lgLD90-lgLD10)/(n-1)
或
i=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)
式中:i-為組距
n-為設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)組距法確定各組劑量公式:
i=(lgLD90-lgLD10)/(n
假定某化學(xué)藥物L(fēng)D100為2000mg/kg,LD0為500mg/kg,設(shè)6個(gè)劑量組,各染毒組的劑量是多少?
1.按公式求出對數(shù)劑量組距(I)公式:
I=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)=(lg2000-lg500)/(6-1)=(3.301-2.699)/5=0.1202.確定各組實(shí)際劑量(見下表)實(shí)例假定某化學(xué)藥物L(fēng)D100為2000mg/kg,LD某化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)劑量設(shè)置
組別劑量對數(shù)劑量(mg/kg)
12.701502.322.821662.232.941873.043.0611150.853.1811517.163.301
2000.0
注:劑量對數(shù)組距=0.12,劑量組間的等比級數(shù)=1.318
某化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)劑量設(shè)置組別
要求:
①5~6個(gè)劑量組,每組動(dòng)物數(shù)相等;
②死亡率呈正態(tài)分布;
③最低劑量組死亡率<20%;
最高劑量組死亡率>80%,
④各組劑量呈等比級數(shù)(一般為1.2-1.5)。
特點(diǎn):
①計(jì)算結(jié)果簡便(按公式計(jì)算)
②精確度高1.改良寇氏(Karber)法–點(diǎn)斜法LD50(或LC50)計(jì)算要求:
①5~6個(gè)劑量組,每組動(dòng)物數(shù)相等
公式:
lgLD50=Xk-i(p-0.5)pqS=i
n
LD50的95%可信限=(LD50±1.96S)
LD50計(jì)算公式:式中:
m-lgLD50;
i-組間對數(shù)劑量差值;
Xk-最大劑量的對數(shù)值;
q-存活率(q=1-p);
∑p-各劑量組死亡率總和;
n-每組動(dòng)物數(shù)。公式:LD50計(jì)算公式:式中:
m-lgLD50;應(yīng)用實(shí)例公式:lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5)
=1.3521lgLD50及其95%可信限為1.3521±1.96×0.0213=1.3104~1.3938LD50及其95%可信限為22.5mg/kg(20.44~24.76mg/kg)應(yīng)用實(shí)例公式:lgLD50=1.4961-0.08(2.3
要求:
①4個(gè)劑量組,每組動(dòng)物數(shù)相等(4只或5只)
②雌雄分開試驗(yàn)
③每組劑量為固定倍數(shù)遞增(2.15倍,3.16倍)
特點(diǎn):
①動(dòng)物用量少
②結(jié)果查表可得(查表可得LD50及95%可信限范圍)
③精確度不高2.霍恩(Horn)法–
又稱劑量遞增法要求:
①4個(gè)劑量組,每組動(dòng)物數(shù)相等(4
霍恩(Horn)法查表-2.15倍組距例如:全活-全死劑量范圍為200-1500mg/kg
劑量組選擇215,464,1000,2150(t=2)霍恩(Horn)法查表-2.15倍組距例如:全活-全
霍恩(Horn)法查表-3.16倍組距例如:全活-全死劑量范圍為180-3500mg/kg
劑量組選擇100,316,1000,3160(t=2)霍恩(Horn)法查表-3.16倍組距例如:全活-全(二)急性毒性替代法
“3R”原則要求:
替代(Replacement)
減少(Reduction)
優(yōu)化(Refinement)
常見的替代法有:
1.限量試驗(yàn)(limittest)
2.固定計(jì)量法(fixeddosemethod)
3.急性毒性分級法(acutetoxicclassmethod)
4.上下法(upanddownprocedure)-序貫法(二)急性毒性替代法
“3R”原則要求:
使用條件:
受試物急性毒性很低時(shí)可采用此法。
方法要求:
①受試動(dòng)物一般為嚙齒類動(dòng)物;
②24小時(shí)內(nèi)多次給予受試物;
③20只動(dòng)物,雌雄各半;
④給予最大劑量,一般為10000mg/kg;
⑤毒性觀察期14天;
毒性評價(jià):
LD50>給藥劑量(mg/kg)1.限量試驗(yàn)使用條件:
受試物急性毒性很低時(shí)可采用此法。
方法要求:(實(shí)際上是一種非死亡毒性評價(jià))
①固定劑量:5、50、300、2000mg/kg;
②預(yù)試驗(yàn):用單性別1只動(dòng)物循序進(jìn)行,接受試驗(yàn)前后的2只動(dòng)物間隔24小時(shí)。如一個(gè)劑量無中毒表現(xiàn),其上個(gè)劑量動(dòng)物死亡,需在中間插入劑量進(jìn)行試驗(yàn);
③正式試驗(yàn):根據(jù)預(yù)結(jié)果,取5只動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn);
④限量試驗(yàn):如果2000mg/kg預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)均不出現(xiàn)中毒表現(xiàn),試驗(yàn)終止,為未觀察到毒性(U)。
⑤若正式試驗(yàn)5mg/kg出現(xiàn)中毒表現(xiàn)或死亡,試驗(yàn)終止,可定為高度(T+)。
結(jié)果判斷(OECD):
高毒(T+)、有毒(T)、有害(H)、未觀察到毒性(U)。2.固定劑量法
方法要求:(實(shí)際上是一種非死亡毒性評價(jià))
FD法急性毒性分級選定:FD法急性毒性分級選定:
3.急性毒性分級法注:按全球化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度(GHS)標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)定級3.急性毒性分級法注:按全球化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度
要求:
先以一個(gè)劑量進(jìn)行一個(gè)動(dòng)物試驗(yàn),如動(dòng)物死亡,則以下一個(gè)較小劑量試探,若仍動(dòng)物死亡則以下一個(gè)更小劑量試探;如動(dòng)物存活,則以較大劑量試探,依次類推,最終按公式計(jì)算LD50值。
死亡觀察為48小時(shí),存活動(dòng)物觀察14天。
特點(diǎn):
①節(jié)省動(dòng)物(一般6-10只動(dòng)物或以上);
②適用于毒性反應(yīng)快速的化學(xué)藥物。4.序貫法(-又稱上-下法)要求:
先以一個(gè)劑量進(jìn)行一個(gè)動(dòng)物試驗(yàn),如動(dòng)物死序貫法實(shí)驗(yàn)計(jì)算公式:式中:
n-使用動(dòng)物總數(shù);
x-每個(gè)劑量組的劑量;
f-每個(gè)劑量組動(dòng)物數(shù)。序貫法實(shí)驗(yàn)計(jì)算公式:式中:應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例
(三)急性毒作用觀察
觀察記錄內(nèi)容:
①中毒癥狀(觀察2周,記錄癥狀發(fā)生的時(shí)間、程度和持續(xù)時(shí)間等);
②試驗(yàn)前后記錄體重(每周至少稱體重1次);
③死亡記錄(死亡數(shù)用于計(jì)算LD50);
④大體解剖與病理學(xué)檢查等。(三)急性毒作用觀察
觀察記錄內(nèi)容:
①中
四、急性毒性分級WHO急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn):四、急性毒性分級WHO急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn):
國內(nèi)健康相關(guān)產(chǎn)品毒性分級國內(nèi)健康相關(guān)產(chǎn)品毒性分級
GHS化學(xué)品急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)
(2002)
≥第4級上限值注:GHS-全球化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度
(GloballyHarmonizedSystemofClassificationandLabelingofChemicals
)GHS化學(xué)品急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)
(2002)≥第4級上限
LD50評價(jià)問題
1.毒性大小比較
LD50值較大者的95%可信限的下限>LD50值較小者的95%可信限的上限。前者的毒性小于后者。
如果可信區(qū)間存在重疊,按公式進(jìn)行t檢驗(yàn):
公式:
2.劑量-反應(yīng)曲線斜率比較
(可分析毒性特征)
3.LD50值表示LD50評價(jià)問題
1.毒性大小比較
LD一般毒性作用2課件
表示LD50時(shí)應(yīng)注意標(biāo)明:
動(dòng)物品系;
染毒途徑;
95%可信限范圍。
LD50±1.96S
例如:異氰酸甲酯
大鼠經(jīng)口LD50值為69mg/kg±5.6
即63.4~74.6mg/kg。表示LD50時(shí)應(yīng)注意標(biāo)明:
概念:
局部毒性作用又稱局部損害作用,是指生物機(jī)體暴露于化學(xué)物后,在其接觸或暴露部位造成的局部毒性損害作用,包括腐蝕性、刺激性與過敏性作用。
目的:
1.評價(jià)化學(xué)物對眼睛、皮膚的刺激與腐蝕作用和皮膚的致敏作用及其程度或等級;
2.為制定化學(xué)物安全使用規(guī)范提供科學(xué)依據(jù)。第三節(jié)
局部毒性作用概念:
局部毒性作用又稱局部損害作用,是指生物機(jī)體暴一、眼睛刺激試驗(yàn)
眼刺激性(eyeirritation)指眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。
眼腐蝕性(eyecorrosion)指眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷。
試驗(yàn)方法:Draize法(1944年)
常用動(dòng)物:白兔一、眼睛刺激試驗(yàn)
眼刺激性(eyeirritDraize法:
(自身對照原則)
試驗(yàn)方法:一般采用4只白兔,受試物以一次劑量滴入每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)(0.1ml),以生理鹽水處理另一側(cè)眼作為自身對照。在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察對兔眼的刺激和腐蝕作用程度,并按規(guī)定的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。
觀察指標(biāo):結(jié)膜(發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物),角膜(混濁程度和范圍),虹膜(充血、腫脹和角膜周圍充血)。
實(shí)驗(yàn)期限:一般為7天,必要時(shí)延長至21天(觀察期能足已評價(jià)刺激是否存在可逆性)。
注意事項(xiàng):
如72h眼刺激反應(yīng)仍不消退時(shí),需另取4只白兔觀察洗眼效果,即滴入受試物后分別在4s和30s時(shí),用生理鹽水洗眼5min,觀察洗眼后的眼睛反應(yīng)。(洗眼效果試驗(yàn))Draize法:
(自身對照原則)
一般毒性作用2課件Draize法眼損傷程度評分表:Draize法眼損傷程度評分表:(續(xù)表)(續(xù)表)一般毒性作用2課件一般毒性作用2課件眼睛刺激動(dòng)物試驗(yàn)替代法:
1.受精雞卵尿囊絨膜試驗(yàn)
利用尿囊絨膜與結(jié)膜結(jié)構(gòu)相似性。
2.細(xì)胞膜損傷溶血試驗(yàn)
用分光光度計(jì)法測定溶血程度(Hb從RBC漏出)。
3.血紅蛋白變性試驗(yàn)(用酶標(biāo)儀測定)
因角膜透明度降低是化學(xué)物破壞了蛋白質(zhì)構(gòu)象。
4.細(xì)胞毒性試驗(yàn)
兔眼角膜上皮細(xì)胞SIRC模型,觀察細(xì)胞增殖、膜完整性等(中性紅不能沉積在死細(xì)胞內(nèi),用酶標(biāo)儀測定)
5.生物膜替代法等方法
受試物+立體人類皮膚+MTT,用酶標(biāo)儀測定提取液中的MTT吸光度(MTT不能沉積在死細(xì)胞內(nèi))眼睛刺激動(dòng)物試驗(yàn)替代法:
1.受精雞卵尿囊絨膜試驗(yàn)
二、皮膚刺激試驗(yàn)
皮膚刺激性(dermalirritation)指皮膚接觸或涂敷受試物后,局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。
皮膚腐蝕性(dermalcorrosion)指皮膚接觸或涂敷受試物后,引起局部的不可逆性組織損傷。
皮膚刺激試驗(yàn)類型:
①單次和多次皮膚刺激試驗(yàn);
②完整皮膚和破損皮膚刺激試驗(yàn)等。
試驗(yàn)方法:Draize法(1944年)
常用動(dòng)物:家兔或豚鼠
二、皮膚刺激試驗(yàn)
皮膚刺激性(dermalirri
破損皮膚刺激試驗(yàn)
是人為將動(dòng)物皮膚某部位擦傷(不能傷及真皮和產(chǎn)生出血),以比較受試物對完整皮膚及受損皮膚造成的刺激反應(yīng)的差異。
傷口消毒藥物一般都需要做破損皮膚刺激試驗(yàn)。破損皮膚刺激試驗(yàn)
是人為將動(dòng)物皮膚某部位擦傷皮膚刺激試驗(yàn)(Draize法):
(自身對照原則)
試驗(yàn)方法:
將受試物一次或多次涂敷于受試動(dòng)物背部一側(cè)皮膚上(0.5ml),涂敷持續(xù)時(shí)間一般為4h,以生理鹽水處理另一側(cè)背部皮膚作自身對照。
觀察指標(biāo):
皮膚反應(yīng)常為紅斑或紫紅色斑、水腫等,損傷嚴(yán)重時(shí)可形成焦痂,一般按紅斑和水腫的嚴(yán)重程度評分,并與自身對照比較,從而評價(jià)受試物對皮膚的刺激作用。
實(shí)驗(yàn)觀察期:一般為14天。皮膚刺激試驗(yàn)(Draize法):
(自身對照原則)
皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果的影響因素:
1.皮膚的完整性(皮膚受損程度);
2.固態(tài)受試物的物理狀態(tài)與溶解度;
3.受試動(dòng)物年齡與性別;
4.實(shí)驗(yàn)人員主觀因素(存在判斷差異)等。
無需做皮膚刺激試驗(yàn)條件:
①受試物為強(qiáng)酸或強(qiáng)堿類腐蝕性物質(zhì)(pH≤2或≥11.5)
②受試物有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性,經(jīng)皮LD50小于200mg/kg體重;
③急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)中,受試物劑量達(dá)2000mg/kg體重仍未出現(xiàn)皮膚刺激性作用。
皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果的影響因素:
1.皮膚的完整性(皮膚皮膚刺激/腐蝕的體外替代法:
1.單層皮膚細(xì)胞培養(yǎng)模型
單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
(如:皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、皮膚黑色素細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等)
2.表皮組織培養(yǎng)模型
EpidermTM重組人表皮模型(美國)
3.器官型人工皮膚模型
即體外構(gòu)建的含表皮和真皮雙層結(jié)構(gòu)皮膚刺激/腐蝕的體外替代法:
1.單層皮膚細(xì)胞培養(yǎng)模Draize法皮膚損傷程度評分表:Draize法皮膚損傷程度評分表:一般毒性作用2課件一般毒性作用2課件三、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)
皮膚變態(tài)反應(yīng)(skinsensitization)
是皮膚對化學(xué)物產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應(yīng),又稱過敏性接觸性皮炎或皮膚致敏反應(yīng)。
在人身上有瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰等,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上,通常只能見到皮膚紅斑和水腫等反應(yīng)。
試驗(yàn)?zāi)康模捍_定重復(fù)接觸化學(xué)物是否可引起變態(tài)反應(yīng)及其反應(yīng)程度。
受試動(dòng)物:豚鼠,每組動(dòng)物10~20只。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):需做陽性對照和陰性對照,陰性對照動(dòng)物僅給予受試物激發(fā)接觸。(陽性物-2,4-二硝基氯苯)
三、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)
皮膚變態(tài)反應(yīng)(skin
致敏機(jī)制:
化學(xué)物在穿透皮膚的過程中,可作為半抗原與體內(nèi)某些特定的載體蛋白共價(jià)結(jié)合,形成完全抗原,誘導(dǎo)抗體形成,產(chǎn)生免疫記憶,如再次接觸較低濃度的相同或結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)物,即能引發(fā)皮膚變態(tài)反應(yīng)。
試驗(yàn)方法:
①局部封閉涂皮法(BuehlerTest)(傳統(tǒng)方法)
②豚鼠最大值試驗(yàn)(guineapigmaximizationtest)
用完全福氏佐劑,皮內(nèi)注射。
③局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(locallymphnodeassay,LLNA)
實(shí)驗(yàn)記錄:
記錄皮膚具有紅斑和水腫(過敏反應(yīng))的動(dòng)物數(shù)。致敏機(jī)制:
化學(xué)物在穿透皮膚的過程中,可作為局部封閉涂皮法(二步法)
致敏接觸:
實(shí)驗(yàn)前將受試動(dòng)物背部左側(cè)皮膚去毛區(qū)3cm×3cm,將受試物0.1~0.2ml涂在2cm×2cm濾紙上,將其敷貼在去毛區(qū),用兩層紗布,一層油紙或不透水塑料膜覆蓋,再以無刺激膠布固定,持續(xù)6h,6h后去除敷貼及受試物。第7天和第14天以同樣方法重復(fù)一次。
激發(fā)接觸:
實(shí)驗(yàn)前將受試動(dòng)物背部右側(cè)皮膚去毛區(qū)2cm×2cm。末次致敏后14~28天,將0.1~0.2ml或低于致敏濃度的受試物斑貼于右側(cè)去毛區(qū),覆蓋方法同前,持續(xù)6h,去掉斑貼及受試物后,每日觀察至第12天。局部封閉涂皮法(二步法)
致敏接觸:
實(shí)驗(yàn)一般毒性作用2課件一般毒性作用2課件一、概述
重復(fù)多次接觸化學(xué)物的毒性研究。
根據(jù)持續(xù)時(shí)間分類(按OECD):
短期毒性作用(亞急性)
(染毒期一般為28天)
亞慢性毒性作用
(嚙齒類動(dòng)物一般為90天,犬為1年)
慢性毒性作用
(嚙齒類動(dòng)物一般為1年,或終身染毒)第四節(jié)
短期、亞慢性和慢性毒性作用一、概述
重復(fù)多次接觸化學(xué)物的毒性研究。
短期、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的主要目的:
1.觀察長期接觸受試物的毒效應(yīng)譜、毒作用特征與毒作用靶器官以及中毒表現(xiàn)(包括癥狀與體征)等;
2.探索受試物的作用機(jī)制;
3.觀察長期接觸受試物所致毒作用的可逆性;
4.評價(jià)毒作用的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系,確定最大無作用劑量(NOAEL)、閾劑量(LOAEL),為制訂人類基礎(chǔ)的安全限值提供依據(jù);
5.觀察不同動(dòng)物種屬的毒性差異,為試驗(yàn)結(jié)果外推到人,確定安全系數(shù)提供依據(jù)。短期、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的主要目的:
1.觀察長二、研究方法
(一)短期重復(fù)毒性和亞慢性毒性試驗(yàn)
基本要求:
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇
(1)物種與品系
①嚙齒類動(dòng)物(首選大鼠,品系Wister與SD大鼠)
②非嚙齒類動(dòng)物(犬,品系Beagle)
(2)性別、年齡和動(dòng)物數(shù)
雌雄各半;大鼠年齡一般≯6周,體重50-100克,每組動(dòng)物≮20只。犬用4-6月齡(≯9個(gè)月),每組動(dòng)物≮8只。
(3)動(dòng)物等級與飼養(yǎng)條件
清潔級及以上等級動(dòng)物,屏障環(huán)境飼養(yǎng),飼料、飲水、墊料、氣溫、氣濕、壓力、光照等符合GLP要求。二、研究方法
(一)短期重復(fù)毒性和亞慢性毒性試驗(yàn)
基本要求:2.染毒途徑與染毒期限
應(yīng)盡量與人實(shí)際接觸相似的途徑;染毒頻率一般為每日1次,連續(xù)給予(每周可給予5-6次)
(1)經(jīng)口染毒
①灌胃法-大小鼠
②喂飼法-大小鼠(受試物在飼料一般≯5%)
③吞咽膠囊法-犬
(2)呼吸道染毒
每天染毒時(shí)間2-6小時(shí)(OECD:為持續(xù)4小時(shí)染毒)
(3)注射途徑
應(yīng)注意無菌操作
染毒期限:短期重復(fù)暴露-28天;亞慢性暴露-90天2.染毒途徑與染毒期限
應(yīng)盡量與人實(shí)際接觸相似的途徑3.劑量選擇與分組
一般選擇至少3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對照組(溶劑),若要中期觀察或?qū)嶒?yàn)結(jié)束后恢復(fù)期觀察,對照組與高劑量組需設(shè)計(jì)“衛(wèi)星組”。
劑量組設(shè)計(jì)原則:
①高劑量組動(dòng)物應(yīng)有明顯中毒反應(yīng),但不引起死亡;
②中劑量組動(dòng)物出現(xiàn)輕度的中毒反應(yīng);
(相當(dāng)于LOAEL水平)
③低劑量組動(dòng)物無毒性反應(yīng);
(相當(dāng)于NOAEL水平)
④劑量組間距一般為2-4倍。3.劑量選擇與分組
一般選擇至少3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性劑量組設(shè)計(jì)應(yīng)注意的問題:
①以急性毒性試驗(yàn)中同一動(dòng)物品系和同一染毒途徑獲得的LD50為依據(jù);
如28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)可按LD50的10-25%作為最高劑量,最低劑量應(yīng)是人體預(yù)期實(shí)際攝入量3倍以上。
②對于求不出LD50的受試物,即毒性很低的受試物,如藥品、食品,可根據(jù)人體實(shí)際攝入量為依據(jù)。
藥品:大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30、100倍,非嚙齒類動(dòng)物可用5、15、50倍的劑量進(jìn)行劑量設(shè)置;
食品:試驗(yàn)劑量應(yīng)涵蓋人體預(yù)期攝入量的100倍,在不影響營養(yǎng)攝食與營養(yǎng)平衡情況下,高劑量組可按最大給予量設(shè)計(jì)。劑量組設(shè)計(jì)應(yīng)注意的問題:
①以急性毒性試驗(yàn)中同一動(dòng)物4.觀察指標(biāo)選擇
應(yīng)能觀察到受試物的靶器官和敏感毒性指標(biāo)。
①一般觀察指標(biāo)(中毒癥狀);
②體重、食物消耗量與飲水消耗量;
③眼部觀察;
④血液學(xué)指標(biāo);
⑤血液生化指標(biāo);
⑥尿常規(guī)指標(biāo);
⑦體溫與心電圖檢查;
⑧病理學(xué)檢查(大體解剖與組織病理學(xué)檢查);
⑨特異性指標(biāo)(效應(yīng)標(biāo)志物)。4.觀察指標(biāo)選擇
應(yīng)能觀察到受試物的靶器官和敏感毒性一般毒性作用2課件5.觀察時(shí)間
如果設(shè)計(jì)恢復(fù)期觀察:
28天亞急性毒性試驗(yàn):衛(wèi)星觀察期14天;
90天亞慢性毒性試驗(yàn):衛(wèi)星觀察期28天;
觀察目的:
①毒性可逆性;
②毒性持續(xù)性;
③毒性遲發(fā)效應(yīng)等;
觀察要求:
至少每天觀察一次,詳細(xì)記錄中毒癥狀、體征、毒
效應(yīng)性質(zhì)、毒性持續(xù)時(shí)間、死亡等情況。5.觀察時(shí)間
如果設(shè)計(jì)恢復(fù)期觀察:
28(二)慢性毒性試驗(yàn)
試驗(yàn)?zāi)康模?/p>
評價(jià)受試動(dòng)物大部分生命期間給予受試物所發(fā)生慢性毒性效應(yīng),闡明其劑量-反應(yīng)關(guān)系和靶器官,確定慢性毒性的NOAEL和LOAEL。
根據(jù)“3R”原則,慢性毒性試驗(yàn)與致癌試驗(yàn)合并。
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與染毒途徑選擇(與亞急性與亞慢性相同)
2.染毒劑量與染毒期限
一般選擇至少3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對照組(溶劑),若要中期觀察或?qū)嶒?yàn)結(jié)束后恢復(fù)期觀察,對照組與高劑量組需設(shè)計(jì)“衛(wèi)星組”。劑量組距一般為2-4倍,≯10倍。染毒期限一般至少12個(gè)月。
3.觀察指標(biāo)選擇(同亞慢性試驗(yàn))(二)慢性毒性試驗(yàn)
試驗(yàn)?zāi)康模?/p>
評價(jià)受試動(dòng)物大部(三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價(jià)
(短期、亞慢性與慢性毒性結(jié)果)
評價(jià)要求:
確定受試動(dòng)物發(fā)生毒效應(yīng)的劑量-反應(yīng)關(guān)系和靶器官,求得NOAEL和LOAEL。
要與正常對照組比較,作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析:
1.劑量-效應(yīng)(反應(yīng))關(guān)系趨勢;
2.實(shí)驗(yàn)效應(yīng)重現(xiàn)性(毒性“三個(gè)重現(xiàn)”);
3.相關(guān)指標(biāo)變化分析;
4.毒性的性別差異;
5.持續(xù)效應(yīng)趨勢分析;
6.效應(yīng)差異大??;
7.實(shí)驗(yàn)室的歷史對照分析(有助于排除假陽性)(三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價(jià)
(短期、亞慢性與慢性毒性結(jié)果)
毒理學(xué)研究的實(shí)際意義:
如食品安全性毒理學(xué)評價(jià)中90天喂養(yǎng)試驗(yàn):
1.最大無作用劑量(NOAEL)≤人可能實(shí)際攝入量100倍,表示毒性較強(qiáng),應(yīng)放棄該化學(xué)物用于食品;
2.最大無作用劑量(NOAEL)在人可能實(shí)際攝入量100-300倍時(shí),應(yīng)進(jìn)行慢性試驗(yàn);
3.最大無作用劑量(NOAEL)≥人可能實(shí)際攝入量300倍時(shí),不必進(jìn)行慢性試驗(yàn),即可進(jìn)行安全性評價(jià)。毒理學(xué)研究的實(shí)際意義:
如食品安全性毒理學(xué)評價(jià)中90
又如工業(yè)化學(xué)物毒物的慢性毒性試驗(yàn):
1.LOAEL與NOAEL值越小,慢性中毒的危險(xiǎn)性越大,制定安全限值(衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))應(yīng)越嚴(yán)格(即安全系數(shù)要大)。
2.慢性吸入中毒危險(xiǎn)指數(shù)
(Rchip=20℃毒物蒸汽飽和濃度/Limch)
評價(jià)危險(xiǎn)性大小:
Rchip<100輕微危害
100≤Rchip<1000中等危害
1000≤Rchip<10000高度危害
Rchip>10000極高危害又如工業(yè)化學(xué)物毒物的慢性毒性試驗(yàn):
1.L一般毒性作用2課件
蓄積毒性試驗(yàn)
研究意義:
1.求出蓄積系數(shù)(K),判斷化學(xué)藥物蓄積性大??;
2.為其他相關(guān)毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
基本方法:
1.理化檢驗(yàn)法-(物質(zhì)蓄積,求t1/2)
(殘留率測定法)
2.生物效應(yīng)法-(物質(zhì)蓄積與功能蓄積)
①蓄積系數(shù)法(有固定劑量法與遞增劑量法)
②20天蓄積試驗(yàn)法蓄積毒性試驗(yàn)
研究意義:
蓄積系數(shù)法
蓄積系數(shù)是指多次染毒所產(chǎn)生的毒效應(yīng)(ED50(n)或LD50(n))與一次染毒所產(chǎn)生相同毒效應(yīng)(ED50(1)或LD50(1))的比值。公式:
Kacc=ED50(n)/ED50(1)
或Kacc=LD50(n)/LD50(1)
求出蓄積系數(shù)K值。根據(jù)K值的大小判斷化學(xué)物蓄積作用的強(qiáng)弱,K值越小蓄積毒性越大。蓄積系數(shù)法
1.固定計(jì)量法基本方法:①求出化學(xué)物1次染毒的LD50(1)值;②對另一組動(dòng)物每天給予1/10LD50(1)劑量直至受試動(dòng)物死亡一半為止,計(jì)算所用總劑量即LD50(n);③如果到50天死亡動(dòng)物仍未達(dá)一半,停止試驗(yàn)(達(dá)5個(gè)LD50(1)劑量),這時(shí)可判斷為輕度蓄積作用。1.固定計(jì)量法
2.遞增劑量法基本方法:①求出化學(xué)物1次染毒的LD50(1)值;②測定另一組動(dòng)物L(fēng)D50(n);
以4天為一周期,在同一周期劑量相同,下一周期為上一周期劑量的1.5倍,第一周期每天劑量為0.1LD50(1),直至受試動(dòng)物死亡一半為止,計(jì)算總劑量即LD50(n);③如果到28天,死亡動(dòng)物仍未達(dá)一半,可停止試驗(yàn),這時(shí)總劑量達(dá)12.8LD50(1),可認(rèn)為無蓄積性。2.遞增劑量法
劑量遞增法(1.5倍)使用劑量表
接觸天數(shù)1~45~89~1213~1617~2021~2425~28
每日接觸劑量(LD50)0.10.150.220.340.500.751.124日接觸總劑量(LD50)0.40.60.881.362.003.004.48
累積接觸總劑量(LD50)0.41.01.88
3.24
5.248.2412.72如本周期受試動(dòng)物死亡一半
即LD50(n)=3.24mg/kg劑量遞增法(1.5倍
我國農(nóng)藥蓄積性評定標(biāo)準(zhǔn)
蓄積系數(shù)(K)蓄積毒性分級<1高度蓄積性
1~明顯蓄積性
3~中等蓄積性
5~輕度蓄積性結(jié)果評價(jià)
我國農(nóng)藥蓄積性評定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果評
我國消毒劑蓄積性評定標(biāo)準(zhǔn)蓄積系數(shù)(K)蓄積毒性分級<1極強(qiáng)蓄積性
1強(qiáng)蓄積性
3
中等蓄積性
5
弱蓄積性我國消毒劑蓄積性評定標(biāo)準(zhǔn)
20天蓄積總量實(shí)驗(yàn)組累積劑量
1/20LD50(低劑量組)LD501/10LD502LD501/5LD504LD501/2LD50(高劑量組)10LD50
對照組020d蓄積試驗(yàn)法20天蓄
結(jié)果評價(jià)
20天蓄積試驗(yàn)法評定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果表述蓄積毒性分級停藥后7d,各劑量組無死亡動(dòng)物未見蓄積性高劑量組有動(dòng)物死亡,其他組無動(dòng)物死亡弱蓄積性低劑量組無動(dòng)物死亡,其他組有動(dòng)物死亡中等蓄積性各劑量組有動(dòng)物死亡,并呈劑量反應(yīng)關(guān)系強(qiáng)蓄積性結(jié)果評價(jià)
耐受性試驗(yàn)
當(dāng)累積劑量>5個(gè)LD50,受試動(dòng)物死亡仍未達(dá)一半時(shí):
1.說明蓄積性極低;
2.提示機(jī)體對毒物產(chǎn)生耐受性。
耐受性檢驗(yàn):
在蓄積性試驗(yàn)基礎(chǔ)上,給予1個(gè)LD50打擊劑量,此時(shí)受試動(dòng)物死亡仍未達(dá)一半時(shí),可被認(rèn)為出現(xiàn)耐受性。
有時(shí)給予3個(gè)LD50打擊劑量,此時(shí)受試動(dòng)物死亡仍未達(dá)一半時(shí),可認(rèn)為耐受性較高。耐受性試驗(yàn)
當(dāng)累積劑量>5第六章
一般毒性作用
Generaltoxiceffects
一.概述二.急性毒性作用三.局部毒性作用四.短期、亞慢性和慢性毒性作用(蓄積性與耐受性)第六章
一般毒性作用
Generaltoxiceffec
一般毒性:
1.急性毒性
(acutetoxicity)
2.局部毒性
(localtoxicity)
3.亞急性毒性
(subacutetoxicity)
4.亞慢性毒性
(subchronictoxicity)
5.慢性毒性
(chronictoxicity)重復(fù)暴露毒性一般毒性:
1.急性毒性
特殊毒性:
1.致癌
(carcinogenicity)
2.致突變
(mutation)
如:小鼠微核試驗(yàn)(mousemicronucleustest)
小鼠顯性致死試驗(yàn)(mousedominantlethaltest)
大鼠染色體畸變試驗(yàn)(ratchromosomeaberrationtest)
3.致畸
(teratogenesis)
4.生殖發(fā)育毒性
(reproductiveand
developmentaltoxicity)
5.
藥物依賴性
(drugdependence)特殊毒性:
1.致癌
(ca一、一般毒性作用概念和意義
一般毒性評價(jià)主要目的:
1.確定受試物毒作用表現(xiàn)與性質(zhì);
2.確定受試物毒作用的劑量與反應(yīng)關(guān)系;獲得的參數(shù)有:LD50、LOAEL、NOAEL3.確定毒作用靶器官;
4.評價(jià)毒性損害的可逆性;
5.了解化學(xué)藥物毒作用的影響因素等。第一節(jié)概述一、一般毒性作用概念和意義第一節(jié)概述二、一般毒性試驗(yàn)的動(dòng)物選擇(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇
1.物種
選擇原則:⑴與人體生物學(xué)特征相似的動(dòng)物;⑵自然壽命不太長的動(dòng)物;⑶易于飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作的動(dòng)物;⑷經(jīng)濟(jì)并易于獲得的動(dòng)物。
(一般選擇兩個(gè)物種進(jìn)行試驗(yàn))二、一般毒性試驗(yàn)的動(dòng)物選擇2.品系
一般在毒理學(xué)系列研究中應(yīng)使用同一品系。
3.級別(質(zhì)量)
Ⅱ級(清潔級)或Ⅲ級(SPF級)的動(dòng)物
4.性別
受試物毒性如果有性別差異,應(yīng)選擇敏感的性別,若沒有應(yīng)選擇兩種性別進(jìn)行試驗(yàn)(♂/♀各半)。
5.年齡與體重
急性試驗(yàn)-選擇成年動(dòng)物;慢性試驗(yàn)-剛斷乳動(dòng)物。同一性別動(dòng)物的起始體重差異≯平均體重20%。
6.生理與健康狀況
不選擇懷孕、哺乳其動(dòng)物,須選擇健康動(dòng)物(健康觀察期5-7天)。2.品系(二)染毒方式選擇原則:
一般選擇受試物實(shí)際與人接觸的途徑。
1.呼吸道染毒有:氣管注入染毒吸入染毒(靜式與動(dòng)式兩種)
2.消化道染毒有:灌胃法、喂飼法和膠囊法。
3.經(jīng)皮染毒
有:表皮涂藥、浸尾法。
4.注射途徑
有:靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)等。
(二)染毒方式一、急性毒性概念
是指1次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物在短期內(nèi)所產(chǎn)生的健康損害作用和致死效應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)效應(yīng)觀察期:2周。
24小時(shí)多次染毒:毒性很低或溶解度很低的受試物。一般規(guī)定:≯3次/24小時(shí),每次間隔4小時(shí)以上。第二節(jié)急性毒性作用一、急性毒性概念第二節(jié)急性毒性作用二、急性毒性試驗(yàn)的目的
1.評價(jià)急性毒性大小
求出LD50、LD100、LD01、LD0或MTD、LOAEL、NOAEL等。
2.了解急性毒性特征(中毒癥狀與體征)
3.為亞急性、亞慢性、慢性、致癌等試驗(yàn)提供劑量設(shè)置的依據(jù)。
4.為毒作用機(jī)制研究提供初步線索。二、急性毒性試驗(yàn)的目的
1.評價(jià)急性毒性大小
用LD50作為劑量參考依據(jù)的毒性試驗(yàn)
試驗(yàn)類別劑量設(shè)組要求蓄積毒性試驗(yàn) 1/20-1/5
LD50范圍設(shè)組亞慢性試驗(yàn)1/20-1/5LD50作最高劑量慢性(致癌)試驗(yàn)1/10LD50作最高劑量用LD50作為劑量參考依據(jù)的毒性試驗(yàn)試驗(yàn)類別三、急性毒性試驗(yàn)方法要點(diǎn)
(一)經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)
(即傳統(tǒng)LD50法)
基本要求:(OECD)
1.檢疫觀察3-5d,成年健康動(dòng)物(大鼠首選);
2.5-7個(gè)劑量組,每組10只動(dòng)物以上(♀/♂各半);
3.劑量組距合適,一般為等比級數(shù);
4.給藥途徑盡量與實(shí)際接觸一致;
(隔夜禁食(12-14h),給藥后再禁食3-4小時(shí))
5.毒性觀察期至少2周以上,每天觀察1次。三、急性毒性試驗(yàn)方法要點(diǎn)
(一)經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)
LD50計(jì)算方法:
①曲線擬合法
(概率單位法或Bliss法)
②插值法
累積法
寇氏法
移動(dòng)平均法
霍恩(Horn)法-查表法
Weil查表法等LD50計(jì)算方法:
①曲線擬合法
(概率單位劑量設(shè)置依據(jù):
①參考同系物或類似物的急性毒性資料;
②最大耐受致死量(LD0)測定;
WHO規(guī)定給藥劑量:經(jīng)口5000mg/kg
經(jīng)呼吸道5000ppm
經(jīng)皮膚2000mg/kg
③預(yù)試驗(yàn)測定致死劑量范圍
即死亡率從0%~100%(10%~90%)
-Lork法(改良法的組距為1.3-1.5)
-組距法劑量設(shè)置依據(jù):
①參考同系物或類似物的急性毒性資料;改良Lork簡化劑量設(shè)計(jì)方案改良Lork簡化劑量設(shè)計(jì)方案公式:
i=(lgLD90-lgLD10)/(n-1)
或
i=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)
式中:i-為組距
n-為設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)組距法確定各組劑量公式:
i=(lgLD90-lgLD10)/(n
假定某化學(xué)藥物L(fēng)D100為2000mg/kg,LD0為500mg/kg,設(shè)6個(gè)劑量組,各染毒組的劑量是多少?
1.按公式求出對數(shù)劑量組距(I)公式:
I=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)=(lg2000-lg500)/(6-1)=(3.301-2.699)/5=0.1202.確定各組實(shí)際劑量(見下表)實(shí)例假定某化學(xué)藥物L(fēng)D100為2000mg/kg,LD某化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)劑量設(shè)置
組別劑量對數(shù)劑量(mg/kg)
12.701502.322.821662.232.941873.043.0611150.853.1811517.163.301
2000.0
注:劑量對數(shù)組距=0.12,劑量組間的等比級數(shù)=1.318
某化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)劑量設(shè)置組別
要求:
①5~6個(gè)劑量組,每組動(dòng)物數(shù)相等;
②死亡率呈正態(tài)分布;
③最低劑量組死亡率<20%;
最高劑量組死亡率>80%,
④各組劑量呈等比級數(shù)(一般為1.2-1.5)。
特點(diǎn):
①計(jì)算結(jié)果簡便(按公式計(jì)算)
②精確度高1.改良寇氏(Karber)法–點(diǎn)斜法LD50(或LC50)計(jì)算要求:
①5~6個(gè)劑量組,每組動(dòng)物數(shù)相等
公式:
lgLD50=Xk-i(p-0.5)pqS=i
n
LD50的95%可信限=(LD50±1.96S)
LD50計(jì)算公式:式中:
m-lgLD50;
i-組間對數(shù)劑量差值;
Xk-最大劑量的對數(shù)值;
q-存活率(q=1-p);
∑p-各劑量組死亡率總和;
n-每組動(dòng)物數(shù)。公式:LD50計(jì)算公式:式中:
m-lgLD50;應(yīng)用實(shí)例公式:lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5)
=1.3521lgLD50及其95%可信限為1.3521±1.96×0.0213=1.3104~1.3938LD50及其95%可信限為22.5mg/kg(20.44~24.76mg/kg)應(yīng)用實(shí)例公式:lgLD50=1.4961-0.08(2.3
要求:
①4個(gè)劑量組,每組動(dòng)物數(shù)相等(4只或5只)
②雌雄分開試驗(yàn)
③每組劑量為固定倍數(shù)遞增(2.15倍,3.16倍)
特點(diǎn):
①動(dòng)物用量少
②結(jié)果查表可得(查表可得LD50及95%可信限范圍)
③精確度不高2.霍恩(Horn)法–
又稱劑量遞增法要求:
①4個(gè)劑量組,每組動(dòng)物數(shù)相等(4
霍恩(Horn)法查表-2.15倍組距例如:全活-全死劑量范圍為200-1500mg/kg
劑量組選擇215,464,1000,2150(t=2)霍恩(Horn)法查表-2.15倍組距例如:全活-全
霍恩(Horn)法查表-3.16倍組距例如:全活-全死劑量范圍為180-3500mg/kg
劑量組選擇100,316,1000,3160(t=2)霍恩(Horn)法查表-3.16倍組距例如:全活-全(二)急性毒性替代法
“3R”原則要求:
替代(Replacement)
減少(Reduction)
優(yōu)化(Refinement)
常見的替代法有:
1.限量試驗(yàn)(limittest)
2.固定計(jì)量法(fixeddosemethod)
3.急性毒性分級法(acutetoxicclassmethod)
4.上下法(upanddownprocedure)-序貫法(二)急性毒性替代法
“3R”原則要求:
使用條件:
受試物急性毒性很低時(shí)可采用此法。
方法要求:
①受試動(dòng)物一般為嚙齒類動(dòng)物;
②24小時(shí)內(nèi)多次給予受試物;
③20只動(dòng)物,雌雄各半;
④給予最大劑量,一般為10000mg/kg;
⑤毒性觀察期14天;
毒性評價(jià):
LD50>給藥劑量(mg/kg)1.限量試驗(yàn)使用條件:
受試物急性毒性很低時(shí)可采用此法。
方法要求:(實(shí)際上是一種非死亡毒性評價(jià))
①固定劑量:5、50、300、2000mg/kg;
②預(yù)試驗(yàn):用單性別1只動(dòng)物循序進(jìn)行,接受試驗(yàn)前后的2只動(dòng)物間隔24小時(shí)。如一個(gè)劑量無中毒表現(xiàn),其上個(gè)劑量動(dòng)物死亡,需在中間插入劑量進(jìn)行試驗(yàn);
③正式試驗(yàn):根據(jù)預(yù)結(jié)果,取5只動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn);
④限量試驗(yàn):如果2000mg/kg預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)均不出現(xiàn)中毒表現(xiàn),試驗(yàn)終止,為未觀察到毒性(U)。
⑤若正式試驗(yàn)5mg/kg出現(xiàn)中毒表現(xiàn)或死亡,試驗(yàn)終止,可定為高度(T+)。
結(jié)果判斷(OECD):
高毒(T+)、有毒(T)、有害(H)、未觀察到毒性(U)。2.固定劑量法
方法要求:(實(shí)際上是一種非死亡毒性評價(jià))
FD法急性毒性分級選定:FD法急性毒性分級選定:
3.急性毒性分級法注:按全球化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度(GHS)標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)定級3.急性毒性分級法注:按全球化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度
要求:
先以一個(gè)劑量進(jìn)行一個(gè)動(dòng)物試驗(yàn),如動(dòng)物死亡,則以下一個(gè)較小劑量試探,若仍動(dòng)物死亡則以下一個(gè)更小劑量試探;如動(dòng)物存活,則以較大劑量試探,依次類推,最終按公式計(jì)算LD50值。
死亡觀察為48小時(shí),存活動(dòng)物觀察14天。
特點(diǎn):
①節(jié)省動(dòng)物(一般6-10只動(dòng)物或以上);
②適用于毒性反應(yīng)快速的化學(xué)藥物。4.序貫法(-又稱上-下法)要求:
先以一個(gè)劑量進(jìn)行一個(gè)動(dòng)物試驗(yàn),如動(dòng)物死序貫法實(shí)驗(yàn)計(jì)算公式:式中:
n-使用動(dòng)物總數(shù);
x-每個(gè)劑量組的劑量;
f-每個(gè)劑量組動(dòng)物數(shù)。序貫法實(shí)驗(yàn)計(jì)算公式:式中:應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例
(三)急性毒作用觀察
觀察記錄內(nèi)容:
①中毒癥狀(觀察2周,記錄癥狀發(fā)生的時(shí)間、程度和持續(xù)時(shí)間等);
②試驗(yàn)前后記錄體重(每周至少稱體重1次);
③死亡記錄(死亡數(shù)用于計(jì)算LD50);
④大體解剖與病理學(xué)檢查等。(三)急性毒作用觀察
觀察記錄內(nèi)容:
①中
四、急性毒性分級WHO急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn):四、急性毒性分級WHO急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn):
國內(nèi)健康相關(guān)產(chǎn)品毒性分級國內(nèi)健康相關(guān)產(chǎn)品毒性分級
GHS化學(xué)品急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)
(2002)
≥第4級上限值注:GHS-全球化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度
(GloballyHarmonizedSystemofClassificationandLabelingofChemicals
)GHS化學(xué)品急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)
(2002)≥第4級上限
LD50評價(jià)問題
1.毒性大小比較
LD50值較大者的95%可信限的下限>LD50值較小者的95%可信限的上限。前者的毒性小于后者。
如果可信區(qū)間存在重疊,按公式進(jìn)行t檢驗(yàn):
公式:
2.劑量-反應(yīng)曲線斜率比較
(可分析毒性特征)
3.LD50值表示LD50評價(jià)問題
1.毒性大小比較
LD一般毒性作用2課件
表示LD50時(shí)應(yīng)注意標(biāo)明:
動(dòng)物品系;
染毒途徑;
95%可信限范圍。
LD50±1.96S
例如:異氰酸甲酯
大鼠經(jīng)口LD50值為69mg/kg±5.6
即63.4~74.6mg/kg。表示LD50時(shí)應(yīng)注意標(biāo)明:
概念:
局部毒性作用又稱局部損害作用,是指生物機(jī)體暴露于化學(xué)物后,在其接觸或暴露部位造成的局部毒性損害作用,包括腐蝕性、刺激性與過敏性作用。
目的:
1.評價(jià)化學(xué)物對眼睛、皮膚的刺激與腐蝕作用和皮膚的致敏作用及其程度或等級;
2.為制定化學(xué)物安全使用規(guī)范提供科學(xué)依據(jù)。第三節(jié)
局部毒性作用概念:
局部毒性作用又稱局部損害作用,是指生物機(jī)體暴一、眼睛刺激試驗(yàn)
眼刺激性(eyeirritation)指眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。
眼腐蝕性(eyecorrosion)指眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷。
試驗(yàn)方法:Draize法(1944年)
常用動(dòng)物:白兔一、眼睛刺激試驗(yàn)
眼刺激性(eyeirritDraize法:
(自身對照原則)
試驗(yàn)方法:一般采用4只白兔,受試物以一次劑量滴入每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)(0.1ml),以生理鹽水處理另一側(cè)眼作為自身對照。在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察對兔眼的刺激和腐蝕作用程度,并按規(guī)定的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。
觀察指標(biāo):結(jié)膜(發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物),角膜(混濁程度和范圍),虹膜(充血、腫脹和角膜周圍充血)。
實(shí)驗(yàn)期限:一般為7天,必要時(shí)延長至21天(觀察期能足已評價(jià)刺激是否存在可逆性)。
注意事項(xiàng):
如72h眼刺激反應(yīng)仍不消退時(shí),需另取4只白兔觀察洗眼效果,即滴入受試物后分別在4s和30s時(shí),用生理鹽水洗眼5min,觀察洗眼后的眼睛反應(yīng)。(洗眼效果試驗(yàn))Draize法:
(自身對照原則)
一般毒性作用2課件Draize法眼損傷程度評分表:Draize法眼損傷程度評分表:(續(xù)表)(續(xù)表)一般毒性作用2課件一般毒性作用2課件眼睛刺激動(dòng)物試驗(yàn)替代法:
1.受精雞卵尿囊絨膜試驗(yàn)
利用尿囊絨膜與結(jié)膜結(jié)構(gòu)相似性。
2.細(xì)胞膜損傷溶血試驗(yàn)
用分光光度計(jì)法測定溶血程度(Hb從RBC漏出)。
3.血紅蛋白變性試驗(yàn)(用酶標(biāo)儀測定)
因角膜透明度降低是化學(xué)物破壞了蛋白質(zhì)構(gòu)象。
4.細(xì)胞毒性試驗(yàn)
兔眼角膜上皮細(xì)胞SIRC模型,觀察細(xì)胞增殖、膜完整性等(中性紅不能沉積在死細(xì)胞內(nèi),用酶標(biāo)儀測定)
5.生物膜替代法等方法
受試物+立體人類皮膚+MTT,用酶標(biāo)儀測定提取液中的MTT吸光度(MTT不能沉積在死細(xì)胞內(nèi))眼睛刺激動(dòng)物試驗(yàn)替代法:
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