檢測限和定量限的確定方法專家講座

體外診斷產品性能評估-2023年10月3日楊宗兵檢測限和定量限旳擬定辦法第1頁術語和定義第2頁α錯誤//β錯誤Alpha(α)error//Beta(β)errorα錯誤//第I類錯誤//假陽性

Alpha(α)error//TypeIerror//Falsepositive

錯誤地回絕無效假設（物質不存在）旳概率，事實上物質真不存在β錯誤//第II類錯誤//假陰性Beta(β)error//TypeIIerror//Falsenegative錯誤地接受無效假設（物質不存在）旳概率，事實上物質在指定旳水平存在第3頁空白Blank//空白限Limitofblank(LoB）

空白Blank不具有感愛好分析物，或至少濃度遠低于感愛好最低水平旳樣本空白限

Limitofblank(LoB）也許觀測到空白樣本旳最高測量成果（聲稱概率下）注：a）LoB不是通過測量獲得旳實際濃度。事實上，陽性信號旳實際濃度確認被稱為LoD。同樣地，LoB是具有在聲稱概率下分析物水平等于LoD旳樣本預期旳最低值b）這同“檢測下限”；即聲稱旳給出測量不擬定度聲稱值旳測量程序得到旳最低成果。也稱為“臨界值”（ISO11843）第4頁檢測限Limitofdetection(LoD)在（聲稱）概率下，樣本中能檢測到旳分析物旳最低量，盡管或許不能量化為一種精確值。注：也稱為“檢測下限”，“最小可檢測濃度”（或量或值），以及有時用于表征“敏捷度”第5頁定量限//定量下限

Limitofquantitation（LoQ）//Lowerlimitofquantitation在聲稱旳可接受精密度和對旳度以及經驗條件下樣本中能定量測定旳分析物旳最低量注：也稱為“檢測下限”和“測量范疇下限”第6頁測量范疇//工作范疇

Measuringrange//Workingrange測量儀器旳誤差處在規(guī)定極限內旳一組被測量旳值（VIM93）注：此前，NCCLS文獻中使用術語“可報告范疇”第7頁敏捷度

“敏捷度”旳非原則使用不同應用中，“敏捷度”也許單獨或修改使用常見為：“IUPAC”定義旳“分析敏捷度”一致，即“校準曲線旳斜率”描述非常低分析濃度旳分析內精密度旳“功能敏捷度”在低濃度有高精密度規(guī)定旳診斷分析，術語“診斷”或“臨床”敏捷度用與描述或比較預定旳與診斷測試性能有關旳臨床信息（如與疾病有關分析物靶點旳有無）第8頁分析敏捷度

測量儀器響應旳變化除以相應旳量“敏捷度”在醫(yī)學檢查上以兩種不同但有關旳含義使用：（1）以足夠置信度可測量旳最小濃度差別

和（2）以合適置信度可檢測旳最小被測量旳量（1）按照IUPAC定義分析敏捷度可以用校準曲線旳斜率來表達（2）已被檢出限和定量限取代第9頁診斷敏捷度、功能敏捷度診斷敏捷度體外診斷檢查程序可以辨認特定疾病或狀態(tài)存在旳能力注：診斷敏捷度是一種數值分數。以真陽性值除以真陽性值加上假陰性值旳和來計算功能敏捷度測量程序測量很低濃度旳能力，它比定量限也無任何優(yōu)勢。因此不鼓勵使用功能敏捷度第10頁類型低限值最低檢出限定量限線性下限測量范圍下限空白限第11頁不同類型之間旳關系LOBLODLOQLLRLMRLOB：最高LOD：高于LOB，也許被聲稱LOQ：最低，U<目旳值（U）LLR：最低與被測量旳值直接成比例旳能力響應值與真實濃度有線性關系LMR：規(guī)定條件下旳最低涉及辦法旳所有特性，偏倚、不精密度、U等第12頁LODdetectionlimit，limitofdetection?由給定測量程序得到的測得量值，對于此值，在給定錯誤地聲稱物質中存在某成分的概率為α時，錯誤地聲稱不存在該成分的概率為βIUPAC建議α和β默認值等于0.05術語“分析靈敏度”有時被用于代表檢出限，但這樣的用法現在不鼓勵第13頁LODdetectionlimit，limitofdetection?被用于描述一個檢驗程序以特定置信水平能報告為存在的被測量最低值。它也被用來指最小可檢測濃度測量區(qū)間的下限不應和檢出限混淆分析靈敏度不能被用于表示檢出限第14頁LOQquantitationlimitlimitofquantitation?被用于描述一個檢驗程序以指定的測量不確定度能測量的被測量最低值。它也被用來指測定下限、定量下限、測量下限和功能靈敏度功能靈敏度比定量限無任何優(yōu)勢。由于該術語延續(xù)靈敏度的不贊成用法，因此不鼓勵它在體外診斷標示中的使用第15頁定性分析中限值旳使用“檢測限”?一個定性測試的檢出限有可能根據經驗觀測不到其增加，例如，試劑引起的變化。因為樣本中分析物可檢測的水平可能低于cutoff值，這可能增加假陰性結果的比例同時，高濃度樣本同樣也可以給出正確的陽性信號。因此，檢出限的測定試驗對許多定性測試的質量控制是重要的第16頁定性分析中限值旳使用“檢測限”?陽性和陰性結果之間的交叉點（也稱為cutoff值，50%的陽性和50%的陰性）過渡區(qū)稱為“95%的區(qū)間”，非CI（LOB與臨界點相同）樣本濃度與區(qū)間關系，重復結果95%陽性結果、95%陰性結果95%區(qū)間上限如同LoD±20%基礎上進行陰陽性結果的重復測量確認第17頁定性分析中限值旳使用“臨界值”的非標準使用?術語“臨界值”在ISO11843中作為空白樣本預期合理的最高結果使用（零濃度或接近零濃度樣本）。超過儀器（方法）響應，認為樣本有一個陽性測量值。但是，在醫(yī)學實驗室該術語普遍用于指征一個重要的醫(yī)學條件的測試結果。響應的閾值被稱為“空白限”第18頁目前旳某些常用辦法LOD/LOQ?當前，許多設備通過單一模式報告LoD和LoQ，僅使用空白樣本測量。在該單一模式下，假設盡可能高的空白值是測定分析物存在的閾值此為檢測下限最常見的是，進行一個空白樣本的重復測量，計算這些測量值的均值和SD，用SD乘以某一因數，加上重復測試的均值，該值被稱為LoD以及可能為LoQ（例如，分析化學）第19頁目前旳某些常用辦法旳缺陷假設空白低值對稱分布SD無法區(qū)分真實虛假忽略事實(LOD)導致低LOD/Q第20頁LOB第21頁第22頁LOB空白樣本結果接近零時的分布儀器內部產生該類型的信號時，許多儀器自動轉換陰性值信號為零或一個低值陽性值。因此只提供非陰性濃度值輸出假設該值超過空白測量中實際空白樣本顯著變異分布的第95百分位數如果樣本產生一個超過該限值的觀測值，它可以宣稱分析物含量大于零第23頁LOB空白樣本結果接近零時的分布使用該限值，我們有真實空白樣本給出值的5%表明分析物存在（通常稱為第I類錯誤）同時，我們觀測到低濃度分析樣本的測量值落在該限值內。當我們斷定在該情況下無可測量分析物存在時，我們承諾錯誤通常稱為第II類錯誤第24頁LOBISO推薦?ISO推薦了第I類和第II類錯誤聲稱水平相關的最小檢出限定義α=β=5%。一個α值為5%對應使用空白值分布第95百分位數，宣稱測量值顯著高于空白限值一個空白值呈Gaussian分布：LoB=μB+1.645σB第25頁LOB計算方法?濃度低于零的情況下不被報告或空白值不呈Gaussian分布時（空白值呈不對稱分布），第95百分位數通過其他方法估計直截了當的程序使用基于命令值的非參數原理。通過大量的Nb值排序，第95百分位數作為陽性第Nb(95/100+0.5)位觀測值來估計第26頁LOB計算方法?因存在小數值，在臨近排序值之間使用內插法。分布上限截斷α百分位，空白分布百分位數限值（PctB），稱為空白限（LoB）即LoB=PctB100-α第27頁LOBLOB估計?通過一個或多個空白樣本重復（NB次）測量估計LoB。使用多個樣本有助于確?？煽啃?，具有明顯分析物量的樣本不被當做空白使用當數據呈Gaussian分布時，那么使用參數程序估計LoB：LoB=μS-1.645σS第28頁LOB例子?當數據不呈Gaussian分布時（如零點被截斷），使用非參數方法計算P(1-α)=(0.95*NB+0.5)當該值為非整數時，應使用線性內插法，例如，當p=95和NB=60，那么NB（p/100）+0.5=57+0.5=57.5，第95百分位應為觀測值排序第57和58位數的均值。當NB=65時，那么NB（p/100）+0.5=62.25，第95百分位應為觀測值排序第62和63位數的組合，=X62+0.25（X63-X62）第29頁LOBLOB驗證舉例?用戶進行25次空白測量（5個樣本5天測量5次）目測檢查顯示空白值呈不對稱分布，因此，非參數估計LoB，在觀測區(qū)的第24位和第25位之間線性內插法得LoB=19.17U/L（=18.01+0.25*（22.65-18.01））第30頁LOD第31頁第32頁LOD第II類錯誤為了表述第II類錯誤，一方面不得不考慮最小樣本濃度等于LoD,即提供規(guī)定概率下超過LoB的結果當第II類錯誤β水平設為5%時，那么95%的測量結果超過LoB第33頁LOD第II類錯誤因而，僅有5%的測量結果被錯誤的宣稱同空白沒有顯著差異,以及β=5%，即第II類錯誤風險（β風險）LoD為該樣本的實際濃度；是能可靠檢測到的最低實際濃度，通常，低水平樣本呈Gaussian分布以及分布的第5百分位數對應LoBLoB=μS-1.645σS第34頁LOD計算公式?可以導出：μS=LoD=LoB+1.645σSLoD=μB+1.645σB+1.645σS第35頁LOD圖示第36頁LOD樣本分布?如果樣本中分析物的實際濃度等于LoB，50%的測量值超過LoB（a）。樣本實際濃度等于LoD，（100%-β）（95%）的樣本測量值超過LoB(b)?樣本不呈Gaussian分布（且不能轉換為Gaussian分布），有可能使用非參數估計LoD，另外，有必要生產濃度接近暫定LoD的樣本。用于檢查5%或更低的測量觀測值低于LoB的最低水平第37頁設計考慮操作條件穩(wěn)定?假設在單一系統或一組實驗設備條件下設計。穩(wěn)定的條件下操作（無試劑批號變化或主校準的重大變化）。推薦考慮包括時間（運行）引起的變異和受試對象之間的差異第38頁設計考慮系統的考慮?制造商應考慮在兩臺或更多臺儀器用兩批或更多批的試劑嘗試獲得不同儀器/試劑預期的變異。如果不同系統結果完全不同，應查明原因。如果同系統結果基本相同時，最大的LoD將作為估計值使用。該建議必須由價值和實際考慮來恒量。任何設計結果應附有一個全面的研究描述和參數第39頁樣本量參數與非參?LoB非參數估計的有效性大約為一個參數估計程序的一半。那就是，參數和非參數程序的預期結果相同，但是使用相同的測量數量時，參數估計有較小的不確定度，（如果數據呈Gaussian分布）。百分位數或SD估計值的不確定度同樣應與分布的分散性成正比。?因而，LoB非參數估計和LoD參數估計，空白測量數量應大于低濃度樣本測量。但最常見的是，低水平樣本測量的分散性大于空白測量。總之，大多數情況下，空白和低水平樣本具有相同測量數量為最佳選擇第40頁樣本量評估與驗證?在精密度和成本之間合理取舍，建議估計LoD時用60次測量的最小數量（空白和低水平樣本）。應由方法開發(fā)者執(zhí)行?為驗證LoD聲稱值，在聲稱水平使用20次結果。以及必要時，在LoB水平。這通常由實驗室或用戶執(zhí)行第41頁樣本性狀樣本代表性?盡可能地，用自然樣本取代空白和陽性低值樣本，即對于藥物分析應有游離藥物的血清或血漿樣本，不只是緩沖液。因人工添加樣本可能與受試者樣本的表現不同使用非自然樣本時，應考慮干擾和基質效應為了確保測量具有代表性，希望收集一定數量樣本的測量值，而不是單個樣本第42頁樣本性狀樣本代表性?樣本之間存在不同基質時，重復測量一特定樣本來代替，最好用5個或更多的樣本為一組。這些測量應在不同日期內分開進行評價，因此評估反應超出典型實驗室條件范圍的分析方法性能，包括（適當時）不同分析和設備?驗證聲稱值時，時間段不需包括試劑批號或主要設備維護的變化，估計聲稱值時，時間段應包括試劑批號的變化第43頁樣本性狀內源性物質?內源性化合物，空白可能是組分剝離樣本，即抗體脫水，酶的降解，或活性炭吸附等對于激素，空白樣本可以由患者受試者提供或發(fā)育不全水平接受藥物治療受試者提供對于腫瘤標志物，正常受試者樣本或許適用。當分析物殘留水平不可避免時，應低于分析物分析范圍限值一個數量級第44頁樣本性狀內源性物質?低水平的內源性化合物，指用一組低濃度范圍內受試者樣本如有必要，在樣本中添加分析物（例如，藥物）時，最好添加源于不同受試者的一組樣本，而不是正好一個樣本或一個混合樣本。通過一組樣本的重復測量估計合并SDS，例如，5個樣本中每一樣本測量12次。測量應在不同日期進行。因此SDs反應總體分析變異第45頁樣本性狀內源性物質?為使LoB和LoD估計值有意義，盡可能地，測量值應追溯至SI單位，或一些已知水平。當分析存在參考方法時，它應用于在低范圍內的比對測量。溯源性也可以由添加樣本的測量證明，考慮添加物質的溯源性第46頁成果LOD?測量值具有許多特征或屬性，如濃度或活性，只要明確地定義被測量。當測量的量不同于感興趣的分析物（例如，酶活性不同于酶的質量濃度）時，必須明確地定義量。理解不同方法或在不同的測量條件下LoD不同是重要的?正好在同樣低濃度樣本獲得所有測量是沒有必要或不可取的。這是因為僅有必要估計SDS（低濃度測量的SD）。使用多個樣本將助于解釋典型的受試者變異第47頁LOD測定程序?測定LoD，樣本測量的SDS通過有意義的低濃度樣本重復測量（NS）獲得，即大約從LoB到4倍LoB的濃度范圍內。推薦從低濃度樣本至少獲得60個結果。指定程序采用多個低水平樣本（4～6個）以及計算這些水平精密度的合并估計值第48頁LOD測量程序?在合并精密度的獨立估計之前，他們應用傳統的F檢驗（2個樣本）或當多于兩個樣本時用Cochran檢驗進行一致性測試，測試失敗時，應由制造商或開發(fā)者查明原因。它可以顯示反應或樣本的不穩(wěn)定影響變異，通過下式估計暫定的LoDt：LoDtent=LoB+cβSD第49頁LOD測量程序?SDS為一個低水平樣本分布的SDS估計值和因SDS基于總體標準偏差σS估計值應用，cβ源于標準Gaussian分布（和修正因子）的第95百分位。當測量的數量不是太小時，cβ=1.645/（1-1/（4*f）），f是SDS估計的自由度例如，通過5個（K=5）低濃度樣本獲得60個結果（NS=60），那么，合并估計SDS時自由度f為55（f=NS-K）和cβ=1.645/（1-1/220）=1.653第50頁LODSD的考慮?考慮測量水平的SDS是否接近LODt水平是重要的。估計LoD時普遍問題是樣本的SD不恒定，因它常常隨樣本濃度而增加。但是，超過低濃度的一個限值范圍時，它將接近恒定以及概述的程序是適當的，當假設一個恒定的SDS時，那么LoD=LoDtent第51頁LODSD的考慮?同樣，如果相關的SD（或CV）恒定，它可能用于估計試驗LOD的SDS，以及因此使用上述公式測定LoD。否則，如果假設樣本SD為濃度水平的一個函數，應開展一個更為復雜的方法第52頁LOD分布形態(tài)的考慮?如果低濃度樣本數據不呈Gaussian分布，那么，有可能轉換數據使其呈Gaussian分布。例如，對數轉換。轉換結束后，LoD用轉換后單位計算，以及然后用可逆轉換程序轉換為原單位（即指數）第53頁LOD分布形態(tài)的考慮?如果不可能產生Gaussian分布數據，但SDS合理恒定，那么可以使用一個非參數進行。這種非參數估計可能作為低濃度樣本賦值（或可接受參考值）測量分布的β百分位的差距來計算。稱該差距為DS,β；DS,β類似于cβ*SDS，因此：LoD=LoB+DS,β第54頁LOD分布形態(tài)的考慮?如果SDS不恒定，以及不可能產生符合Gaussian分布數據，那么，必須使用一個非參數的“試錯法”程序。該程序嘗試假設在LoD水平準備樣本，和一系列的測量值（不同時間和操作者）?計算β百分位，作為低于LoB觀測值的百分位數。當β百分位是5%或更低時，LoD為最低水平物質的結果第55頁LOD例子?激素（空白）：估計LoD，使用α=β=5%的默認值有10個源于激素缺乏或藥物抑制受試者的樣本。為確?？偡治鲎儺惒皇苡绊?，在10天中分別對每一空白樣本測量10次。因被截斷，分析僅提供非陰性值非參數估計LoB作為測量結果的第95百分位數第56頁LOD例子?激素（空白）：第57頁LOD例子第95百分位對應觀測值排序的95.5（=100*（95/100）+0.5）。觀測范圍內第95和96位之間使用線性內插法得LoB估計值:為0.0544U/L(0.0539+0.5*(0.0548-0.0539))排序空白值1000.0653990.0603980.0560970.0554960.0548950.0539940.0538第58頁LOD例子?激素（低濃度水平）：低濃度樣本（在0.05～0.20U/L范圍內）假設從10個受試者每人獲得一個樣本，以及每一樣本分析10次建議目視檢查分布對稱和接近鐘形，因此可能使用參數統計目視復測SDS估計值與該樣本水平無關第59頁LOD例子?激素（低濃度水平）：按照加權方式SDS2=(n1SDS12+n2SDS22+n3SDS32+……+nnSDSn2)/(n1+n2+n3+……+nn)計算SDS（0.0299）合并估計值（該情況下，為變異均值的平方根）。自由度為10*（10-1）=90和α=0.05，因此cβ=1.6449/（1-1/360）=1.6494那么可以獲得一個LoD估計值：LoD=LoB+cβ*SDS=0.0544+1.6494*0.0299=0.104U/L第60頁LOD例子（驗證）?實驗室應確保分析滿足制造商聲稱給定的LoD聲稱值，而不是估計自己的LoD?？捎脮r，實驗室應使用制造商提供的LoB當制造商的LoB不可用時，那么按照LOB估計方法進行第61頁LOD例子（驗證）?運行濃度等于聲稱LoD樣本的重復測量以及估計大于LoB結果的比例。推薦至少使用20次樣本測量，可能時這些測量包括來自樣本和不同時間段的變異。記錄比例符合預期值（1-β；默認為95%），也就是在記錄比例在95%的置信區(qū)間內包含95%時，那么數據支持LoD聲稱值第62頁LOD例子（驗證）?判定：20次測量中有可能多于1次結果低于LoB，但仍然符合該標準次數觀測比例低限2085308740885088608870898089909010090150912009225092300924009350093100094第63頁LOD例子（驗證）?分析程序在α=β=5%時LoD聲稱值為45U/L用戶進行25次空白測量（5個樣本5天測量5次）和25次分析物濃度為45U/L的添加樣本測量目測檢查顯示空白值呈不對稱分布，因此，非參數估計LoB，在觀測區(qū)的第24位和第25位之間線性內插法得LoB=19.17U/L（=18.01+0.25*（22.65-18.01））第64頁LOD例子（驗證）?25個空白測量值和25個添加分析物樣本測量值的分布，因此，實際濃度等于LoD聲稱值45U/L。LoB估計值為19.17（空白分布的第95百分位數）。92%的樣本測量值（23/25）大于LoB?觀測比例符合依據聲稱95%的一個預期值，以及當前的評價不否定聲稱值第65頁LOQ第66頁LOQ估計程序?LoQ為能可靠檢測到的（LoD）分析物實際的最低量，以及總誤差符合實驗室準確度要求（臨床使用的可接受值）實驗室希望估計自己的LoQ，或驗證制造商的聲稱值，如果低水平得測量不確定度（或總誤差）可被確定，測定每一個方法學的LoQ可能是沒有必要的在這種情況下，報告每一個低水平結果已估計的不確定度是可接受的第67頁LOQ估計程序?LoD研究的測試結果應用于估計分析物該水平的偏倚和不精密度推薦測定3到5個不同樣本至少40次重復以及至少5次運行測量均值（當使用一個樣本時）和可接受的參考值之間的偏差為偏倚估計值當該水平使用不止1個樣本時，那么偏差的均值為正確度估計值。40個結果總的SD（一個樣本）或精密度合并估計值SDS為精密度估計值第68頁LOQ估計程序?綜上所述得到該水平總誤差估計值，使用偏倚+2*SDS=總誤差（如果偏倚為負值，使用總誤差，=-（偏倚-2SDS））。如果該估計值低于給定的總誤差目標，那么：LoQ=LoD該程序確保，真實值等于LoQ的樣本，測試結果約有95%概率應非常正確第69頁LOQ估計程序?如果需要更大概率，SDS應乘以較大的因子；例如，如果偏倚+4SDS和偏倚-4SDS在目標范圍內（和誤差呈Gussian分布），那么大于99.5%的結果將適用第70頁LOQ估計程序?如果不符合該水平目標值，那么必須進行略高水平的測試。必須得到適合的參考物質，使用類似的物質來測定LoD。此前，必須通過獨立測試結果的均值，同時用參考方法測試，添加，或，適當時進行稀釋得到實際濃度。如果生產該物質，那么源于測試物質的不確定度和總誤差估計應包括稀釋因子和/或添加程序的不確定度第71頁LOQ驗證程序?如果實驗室測定高于假設測量范圍（或可報告范圍）的最低水平LoQ，那么測量范圍不適用于實驗室預期用途。在較低的95%置信限，如果該試驗得到的偏倚和不精密度估計值大于方法聲稱值，那么應聯系制造商第72頁LOQ驗證程序?如果實驗室希望確認LoQ或假設誤差不呈Gaussian分布，那么使用其他程序檢查LoQ聲稱值。使用最少25次重復是可接受的該情況下，每一樣本重復值與該樣本參考值差值和誤差目標值比較。超出誤差目標結果的數量應按照區(qū)間估計值計算。如果使用95%的標準，應按照95%低限確定不可接受觀測結果的數量第73頁LOQ驗證程序?例如，總共有30次重復時，（超過某一樣本數量），那么我們至少有87%的結果（26.1，四舍五入至27）必須在